CC BY
20
УДК 616-089.843-77
ВЛИЯНИЕ ВРЕМЕННЫХ И ТЕМПЕРАТУРНЫХ ФАКТОРОВ НА ОСТЕОИНДУКТИВНЫЕ СВОЙСТВА ДЕМИНЕРАЛИЗОВАННЫХ КОСТНЫХ ТРАНСПЛАНТАТОВ
А.А. Булатов, В.И. Савельев
ФГУ «Российский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии им. P.P. Вредена Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию», директор - д.м.н. профессор P.M. Тихилов Санкт-Петербург
В эксперименте на 32 крысах и 60 кроликах изучено влияние температурного и временного факторов на остео-индуктивные свойства деминерализованных костных трансплантатов. Доказана возможность пролонгирования сроков заготовки костной ткани для деминерализации без потери её остеоиндуктивной активности.
The influence of temperature and temporal factors on the osteoinductive properties of demineralized bone grafts was studied during an experiment on 32 rats and 60 rabbits. The possibility of prolongation of the period of bone tissue procurement for demineralization without loss of its osteoinductive activity was proved.
Аллогенные деминерализованные костные трансплантаты (ДКТ) находят применение в различных областях восстановительной хирургии [1, 2, 4, 7, 9, 10]. Благодаря своим остеоин-дуктивным и остеокондуктивным свойствам они по праву конкурируют с костными аутотрансплантатами [1, 3, 11- 13].
Костную ткань для деминерализации и изготовления из неё трансплантатов стремятся взять в первые 2-4 часа после смерти донора. Столь строгие временные пределы исключают из процесса заготовки ДКТ значительное число посмертных доноров, что снижает обеспеченность клиник этим ценным пластическим материалом. Кроме того, костные морфогенетические белки, ответственные за остеоиндукцию, могут инактивироваться многочисленными химическими и физическими агентами [6, 8, 14, 15], среди которых временным и температурным факторам принадлежит немаловажная роль. Сведения на этот счёт в литературе крайне скудны [5, 16].
Цель работы - выяснить, как можно увеличить посмертные сроки заготовки костной ткани для изготовления ДКТ за счёт предварительного (до деминерализации) консервирования кости в организме донора или вне его при различных температурных режимах.
Материал и методы
Эксперименты выполнены на 52 взрослых кроликах и 90 белых крысах. В первой серии опытов (16 кроликов и 30 крыс) посмертное
хранение тушек доноров осуществляли в холодильнике при +5°С и при комнатной температуре в течение 8 и 24 часов. После этого у них производили забор костных препаратов, которые подвергали деминерализации. Во второй серии опытов (16 кроликов и 30 крыс) костную ткань заготавливали в первые 2 часа после смерти доноров и, не обрабатывая, хранили до деминерализации при -20°С в течение 1, 2, и 4 недель. Контролем служила третья серия экспериментов (20 кроликов и 30 крыс), в которых использовали трансплантаты, деминерализованные сразу же после забоя животных-доноров. Методика деминерализации во всех опытах была одинаковой и включала механическую обработку костной ткани с обязательным удалением костного мозга, её обезжиривание и выдерживание в 1,2 Н растворе соляной кислоты при 7°С на протяжении 15-18 часов. Консервацию трансплантатов в опытах не производили. На следующий день после деминерализации рабочий раствор кислоты сливали, препараты извлекали из упаковки и помещали в 1% раствор питьевой соды. В контрольной группе трансплантаты консервировали до пересадки путём замораживания при температуре -20°С в сроки от 15 до 30 суток. Техника операций у всех животных была стандартной и заключалась в ор-тотопическом замещении дефекта лучевой кости трансплантатом у кроликов и в эктопической, внутримышечной пересадке ДКТ у
крыс. Оперированных животных выводили из опытов под наркозом через 30, 60, 90 суток после хирургического вмешательства. Полученные у них препараты подвергали рентгенологическому и гистологическому исследованиям. Гистологические срезы окрашивали гематоксилином-эозином и по Ван Гизону по стандартной методике и изучали под световым микроскопом.
Результаты и обсуждение
На основании анализа проведённых экспериментов нами было установлено, что сохранение тушек животных при комнатной температуре и в охлаждённом состоянии в течение 8 и 24 часов соответственно (1 серия опытов) не вызывает в полученных от них ДКТ изменений, которые бы нарушали их ценные с клинической точки зрения качества. Остеоиндуктивные свойства костных трансплантатов, деминерализованных после их предварительной консервации низкими температурами (2 серия опытов) также оказались не нарушенными. При сравнительной оценке полученных данных оказалось, что перестройка деминерализованных трансплантатов в обеих сериях и в контроле не имела существенных различий. Это позволило дать им общее описание. Так, эктопическая пересадка у крыс показала, что на 15 сутки при рентгенологическом контроле деминерализованная кость в области имплантации не выявляется. Через 30 суток у большей части животных на месте пересадки появлялись очаги костеобразования, имеющие незначительную плотность и нечёткие контуры. Спустя 2-3 месяца плотность новообразованной кости нарастала и приобретала контуры бывшего трансплантата. На гистологических препаратах обнаруживалась новообразованная костная ткань, располагающаяся в массивах бесструктурного трансплантата в виде очагов. На протяжении второго и третьего месяцев после операции наблюдалось дальнейшее рассасывание остатков трансплантата и его замещение новообразованной костью, которая имела трабекулярное строение и содержала значительное количество мие-лоидных и жировых клеток.
После ортотопических пересадок у кроликов на 15 день трансплантат в дефекте лучевой кости рентгенологически не определялся. Через 30 суток в зоне вмешательства обнаруживались неправильной формы облаковидные уплотнения, распространяющиеся вдоль дефекта с концов резецированной кости реципиента. К 60 дню костный ре-
генерат приобретал очертания трансплантата, становился более плотным и практически у всех животных полностью замещал костный дефект. Спустя 90 суток во всех наблюдениях, где с самого начала остеогенез был чётко выражен, непрерывность лучевой кости была восстановлена. Новая кость на рентгенограммах имела вполне зрелый вид, однако по своей плотности ещё несколько уступала интактным костям предплечья. К этому сроку обычно заканчивалось формирование компактных стенок трубчатой кости и костномозгового канала, то есть новообразованный на месте ДКТ костный регенерат приобретал органотипические черты.
При гистологическом исследовании через 15 дней после пересадки на гистограммах по всему трансплантату отмечались явления остеокластической резорбции, приводящие к узурированию его поверхности. Также имело место разволокнение, особенно на концах трансплантата, и отщепление вдоль него отдельно набухших коллагеновых волокон. Одновременно с резорбцией наблюдалась значительная пролиферация остеобластичес-ких элементов, отложение остеоида и образование новых костных пластинок на поверхности трансплантата. Врастание остеобластов и капилляров наблюдалось также между расщепленными волокнами и по ходу гаверсовых каналов. В опилах кости реципиента к этому сроку обнаруживались большие бе-зостеоцитные участки, расширенные гаверсовы каналы, просветы которых были заполнены полнокровными капиллярами и фиброретикулярной тканью. На стенках каналов наблюдались скопления остеобластов.
Через 30 дней после пересадки в ДКТ нарастали процессы рассасывания и костеобразования. На гистотопограммах трансплантаты определялись в виде узких полосок из наружного или внутреннего кортикального слоя. Дефект лучевой кости был заполнен новообразованной костной тканью губчатого строения. В толще балок выявлялись замурованные фрагменты трансплантата. Следует отметить, что наиболее интенсивно по сравнению с контролем шло костеобразование у животных второй серии, у которых на месте трансплантата появлялись мелкие очаги миелоидного костного мозга, а также тонкие костные балочки, имеющие продольное расположение.
Через 3 месяца на гистотопограммах выявлялось восстановление целостности лучевой кости. Явления компактизации новообразованного костного регенерата наступали быс-
трее по наружной поверхности лучевой кости, чем со стороны межкостного промежутка, где у большинства животных ещё сохранялась спонгиозная ткань. Практически у всех животных в толще новообразованного кортикального слоя, имевшего строение пластинчатой кости, продолжали обнаруживаться небольшие очаги перестраивающегося трансплантата. Гаверсовы каналы в новой кости располагались хаотично, их просветы были расширены и заполнены остеогенными клетками и полнокровными капиллярами. Между балками обнаруживалась фиброретикулярная ткань, содержащая клетки костного мозга и полнокровные сосуды. На поверхности балок были видны остеобласты в значительно меньшем числе, чем в предыдущие сроки.
лизованных костных трансплантатов далеко недостаточно для бесперебойного обеспечения заинтересованных в них лечебных учреждений. Такие запасы могли бы стать более значительными, если бы удалось увеличить посмертные сроки заготовки костной ткани без нарушения её полезных с точки зрения изготовления ДКТ качеств. Проведенные в работе исследования на животных показали, что такое вполне возможно.
Так, костные образцы, взятые от тушек доноров, хранившихся 8 часов при комнатной температуре и 24 часа в холодильнике при +5°С, оказались вполне пригодными для изготовления деминерализованных трансплантатов с высокими остеоиндуктивными свойствами. Столь же эффективным оказалось приготовление ДКТ из костной ткани, полученной посмертно в первые 2 часа и хранившейся до деминерализации в замороженном виде при - 20°С на протяжении
Место соединения концов новообразованной и лучевой костей определялось с большим трудом, особенно по наружной поверхности.
Таким образом, эксперимент подтвердил высокие остеоиндуктивные и биопластические свойства деминерализованных костных трансплантатов, заготовленных после предварительной консервации низкими температурами в организме донора и вне его (табл.). Те условия, временные и температурные пределы, которые были установлены в рассмотренных выше экспериментах, оказались недостаточными для подавления активности костных мо-фогенетических белков, содержащихся в ДКТ и являющихся основой остеоиндукции.
Накопленный к настоящему времени опыт свидетельствует о том, что запасов деминера-
Таблица
4 недель. Более того, исходы пересадок в данной серии опытов превосходили результаты операций в контроле, что наводит на мысль об обязательной низкотемпературной обработке кости перед деминерализацией с целью сокращения сроков изготовления ДКТ и усиления их остеогенного потенциала. Практическое значение проведённых исследований очевидно. Они доказали возможность осуществлять заготовки деминерализованных трансплантатов планомерно и в массовом порядке, что имеет принципиальное значение. Кроме того, это позволяет экономить время и трудовые затраты работников тканевых банков в тех, довольно частых теперь случаях, когда уже подготовленные для клинического использования деминерализованные трансплантаты приходится списывать в связи с их непригодностью по результатам анализов крови и другим причинам.
Зависимость остеогенеза от разных условий хранения донорского материала
Эксперимент на крысах и кроликах Индукционный остеогенез, % Количественное содержание новообразованной кости в % от площади исходных ДКТ
Эктопическая пересадка Ортотопическая пересадка Эктопическая пересадка Ортотопическая пересадка
Контроль 96,1 97,9 83,6 88,9
Первая серия опытов 98,0 98,2 85,7 89,5
Вторая серия опытов 98,7 98,9 87,0 90,4
Примечание: количественная оценка осуществлена с помощью планиметрии рентгенограмм.
Выводы
1. Посмертное хранение тушек животных при комнатной (+18°С) температуре в течение 8 часов и в холодильнике при +5°С в течение 24 часов не лишает изъятую у них костную ткань остеоиндуктивной активности.
2. Хранение кости в блоке с окружающими мягкими тканями при -20°С в течение 24 часов до деминерализации не снижает её костеобразующих свойств.
3. Эксперименты подтвердили возможность пролонгированной заготовки костной ткани для деминерализации в пределах изученных в работе временных и температурных параметров.
Литература
1. Савельев В.И. Получение и сохранение деминерализованной костной ткани для клинического применения / В.И. Савельев // Деминерализованные костные трансплантаты и их использование в восстановительной хирургии: Сб. науч. тр. — СПб., 1996. - С. 3-12.
2. Савельев В.И. Технологии изготовления и экспериментально-клинического применения деминерализованных костных трансплантатов / В.И.Савельев, Н.В. Корнилов, А.В. Калинин, А.А. Булатов // Биоимплантология на пороге XXI века: Матер. симп. по проблемам тканевых банков с междунар. участием. — М., 2001. — С. 27-28.
3. Harakas N.K. Demineralized bone matrix-induced osteogenesis / N.K. Harakas // Clin. Orthop. — 1984.
— N 188. — P. 239 — 251.
4. Iwata H. Demineralized bone matrix and native bone morphogenetic protein in orthopaedic surgery / H. Iwata, S. Sakano, T. Itoh, T.W. Bauer // Clin. Orthop.
— 2002. — N 395. — P. 99— 109.
5. Moore T.M. Influence of post-mortem time and temperature on osteoinductive activity of demineralized microperforated ethylene oxide sterilized syngeneic
bone implant in the rat / T.N. Moore, R. Artal, M. Arenas, E. Gendler // Clin. Orthop. — 1990. — N 299.
- P. 239-244.
6. Reddi A.H. Implant-stimulated interface reactions during
collagenous bone matrix-induced bone formation / AH. Reddi // J. Biomed. Mater. Res. — 1985. — Vol.19, N 2.
- P. 233 — 239.
7. Russell J.L. Clinical utility of demineralized bone matrix for osseous defects, arthrodesis, and reconstruction: impact of processing techniques and study methodology / J.L. Russell, J.E. Block // Orthopedics — 1999. — Vol. 22, N 5. — P. 524 — 531.
8. Sakou T. Bone morphogenetic proteins: from basic studies to clinical approaches / T. Sakou // Bone. — 1998. — Vol. 22, N 6. — P. 591 —603.
9. Solheim E. Osteoinduction by demineralized bone / E. Solheim // Int. Orthop. — 1998. — Vol. 22, N 3. — P. 335 — 342.
10. Stevenson S. Biology of bone grafts / S. Stevenson // Orthop. Clin. North. Am. — 1999. — Vol. 30, N 4. — P. 543—552.
11. Strates B.S. Contribution of osteoinductive and osteoconductive properties of demineralized bone matrix to skeletal repair / B.S. Strates, J.T. Tiedeman // Eur. J. Exp. Muskuloskeletal Res. — 1993. — Vol. 2, N 2. — P. 63—67.
12. Urist M.R. The bone induction principle / M.R. Urist, B.F. Silverman, K. Buring et al. // Clin. Orthop. — 1967
- N 53. — P. 243 — 283.
13. Urist M.R. Inductive substrates for bone formation / M.R. Urist, T.A. Dowell, P.H. Hay, B.S. Strates // Clin. Orthop. — 1968. — N 59. — P. 59 — 96.
14. Urist M.R. Bone morphogenic protein / M.R. Urist, B.S. Strates // J. Dental. Res. — 1972. — Vol. 50, Suppl. 6. — P. 1392—1406.
15. Urist M.R. Preservation and biodegradation of the morphogenetic property of bone matrix / M.R. Urist, H. Iwata // J. Theor. Biol. — 1973. — Vol. 38, N 1. — P. 155—167.
16. Yazdi M. Postmortem degradation of demineralized bone matrix osteoinductive potential / M. Yazdi, S. Bernick, W.J. Paule, M.E. Nimni // Clin. Orthop. — 1991. — N 262. — P. 281 — 285.
