CC BY
44
УДК 616.345-006.5./.6 : 616.002.1 и. л. ОСИНЦЕВА
С. И. МОЗГОВОЙ Л. В. ПАНЮШКИН А. С. МАХРОВ
Омская государственная медицинская академия
Западно-Сибирский медицинский центр медико-биологического агентства России, г. Омск
СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА МУЦИНПРОДУЦИРУЮЩЕЙ И ПРОЛИФЕРАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ В ПОЛИПОВИДНЫХ ОБРАЗОВАНИЯХ И «ПЕРЕХОДНОЙ СЛИЗИСТОЙ» ПРИ ГИПЕРПЛАСТИЧЕСКОМ ПОЛИПЕ, ТУБУЛЯРНОЙ АДЕНОМЕ И АДЕНОКАРЦИНОМЕ ТОЛСТОЙ КИШКИ
Рассмотрены параметры клеточного обновления и особенности продукции гастроин-тестинальных муцинов в полиповидных образованиях толстой кишки и в прилежащей «переходной» слизистой оболочке. В аденомах толстой кишки, имеет место смещение пролиферативного компартмента в верхнюю треть крипт с увеличением пролифера-тивной активности и уменьшением продукции кишечных муцинов, для гиперпластического полипа характерно расширение пролиферативного компартмента с увеличением продукции кишечных и появлением нейтральных углеводных групп, желудочных муцинов MUC5AC, MUC1. «Переходная слизистая» является самостоятельным фенотипом кишечного эпителия, для которого характерно расширение пролиферативного компартмента, гетерогенность продукции кишечных муцинов и появление желудочных муцинов MUC5AC, MUC1, нейтральных углеводных групп.
Ключевые слова: толстая кишка, гиперпластический полип, «переходная слизистая» толстой кишки, муцины, клеточное обновление.
Рак толстой кишки занимает III — IV место в ние с наличием интраэпителиальной неоплазии, кото-структуре смертности от онкологических заболева- рое гистологически характеризуется увеличением и ний [1—2]. Это диктует необходимость поиска новых гиперхромией ядер, потерей полярности и различной подходов диагностики на этапе предраковых изме- степенью ядерной стратификации [7]. нений, а также разработки критериев оценки даль- Особый интерес представляет часть слизистой нейшего морфогенеза патологических образований, оболочки, расположенной между патологическим относящихся к предраковым и опухолеподобным. образованием и неизмененной слизистой, так назы-Традиционно считается возможным переход аденомы ваемая «переходная слизистая» (синонимы: нормаль-в аденокарциному [3 — 4]. Гиперпластические поли- ная слизистая смежная с новообразованием — adja-пы, по мнению большинства авторов, не имеют потен- cent normal mucosa, параканкрозная слизистая — циального риска малигнизации. Однако по молеку- paracancerous mucosa). В участках такой слизистой лярно-биологическим свойствам они ближе к раку, обнаружены более глубокие, чем в норме, ветвящиеся чем нормальная слизистая оболочка толстой кишки, крипты, содержащие в кишечном эпителии большое и в литературе описаны случаи малигнизации [5 — 6]. количество увеличенных в объеме бокаловидных По ВОЗ-2000 гиперпластический полип определен клеток [8]. Одни авторы расценивают этот феномен как «опухолевидное образование на широком осно- как реактивное неспецифическое изменение, обус-вании, при микроскопическом исследовании кото- ловленное репаративной регенерацией [9—11], а дру-рого выявляется удлинение крипт с расширением их гие считают промежуточным этапом в процессе неопросвета, гиперплазией бокаловидных клеток и ха- пластической трансформации [8, 9, 12]. рактерным пилообразный контуром эпителия крипт»; Цель работы — оценить параметры клеточного аденома представляет собой «предраковое» образова- обновления и профиль продукции муцинов гипер-
пластического полипа, тубулярной аденомы, адено-карциномы и соответствующей «переходной слизистой» для изучения морфогенеза в процессе неопластической трансформации.
Материал и методы исследования. Материалом для изучения являлись 62 биоптата из полиповидных образований слизистой оболочки левых отделов толстой кишки (сигмовидная и верхние отделы прямой кишки) размером до 1 см, от больных в возрасте 55 — 65 лет. Материал был распределен на 4 группы сравнения: 20 биоптатов от пациентов с гиперпластическим полипом (ГП), 20 биоптатов от пациентов с тубулярной аденомой типичного строения с неоплазией низкой степени (AHC) и 12 с аденомой типичного строения с неоплазией высокой степени (ABC), 10 биоптатов от пациентов с аденокарциномой толстой кишки. Группа контроля была представлена биоптатами от В пациентов с малоизмененной слизистой оболочкой толстой кишки. Проводилось выявление количественного отношения сульфомуцинов к сиаломуцинам (сочетание реакции с диамином железа с 1 %-ным альци-ановым синим при рН = 2,5), оценка нейтральных муцинов (наличие нейтральных углеводных групп) по реакции с 1 %-м альциановым синим при рН = 2,5 в комбинации с ШИ^реакцией. Иммуногистохими-ческое исследование выполняли с применением первичных антител к Ki-67, клон MIB-1 («DAKO», Дания); Р53, клон DO-7 («DAKO», Дания); CDX-2 (клон EPR2764Y, Cell Marque, CШA); моноклональных антител к желудочным (MUC1, MUC5AC и MUC6) муцинам в разведении 1:100; моноклональных антител к кишечному муцину (MUC2) в разведении 1:100; система детекции LSAB2 Systems, HRP («DAKO», Дания).
Оценивался индекс экспрессии муцинов — отношение количества клеток с наличием муцина к общему числу клеток (цилиндрических или бокаловидных) в процентах, индекс пролиферации — отношение количества клеток с экспрессией Ki-67 к общему количеству клеток в процентах. Оценка проводилась по всем измененным криптам, показатели рассчитывались отдельно по компартментам (нижняя треть крипты — I, средняя — II, верхняя — III, а также в поверхностном эпителии — IV) (рис. 1). Для статисти-
В
Цилиндрическая клетка
□
Бокаловидная
Рис. 1. Локализация компартментов экспрессии изученных маркеров в толстокишечной крипте.
I — нижняя треть крипты, II — средняя треть крипты, III — верхняя треть крипты, IV — поверхностный эпителий
ческого сравнения индексов применялся Т-критерий Манна-Уитни. Допустимая ошибка принималась за 5 % (р<0,05 — отличия достоверны), с помощью Biostat 6.0 и SPSS 11.5.
Результаты. Среди гистохимических и иммуно-гистохимических показателей в полиповидных образованиях имело место достоверное изменение секреции муцинов, как кишечных, так и желудочных, главным образом в цилиндрических клетках. В бокаловидных клетках присутствовали все исследуемые муцины без статистически значимых отличий. Продукция сиаломуцинов достоверно отличалась во всех группах с наибольшей секрецией в ГП и минимальной в АК: в ГП выше по сравнению с АНС, АВС и АК (р = 0,012, р = 0,002 и р = 0,015 соответственно), в АК ниже, чем в АНС и АВС (р = 0,04 и р = 0,001 соответственно) (рис. 2). Секреция сульфогрупп кишечного муцина была увеличена в ГП (р = 0,003 для АНС, р = 0,004 для АВС, р = 0,006 для АК), а в АНС выше по сравнению с АВС и АК (р = 0,016 и р = 0,0002 соответственно). Иммуногистохимически были выявлены различия в экспрессии кишечного муцина MUC2 с увеличением продукции в ГП относительно АНС,
1.00 2.00 3 "О
гп анс авс
ак
Рис. 2. Индекс продукции сиаломуцинов в гиперпластическом полипе, аденоме с неоплазией низкой и высокой степени и аденокарциноме
s н
I
р=0,022
р=0,002
fe
^5,00
О 2
р=0,007
р=0,745
р=0,019
гп
а нс
т
с
ак
Рис. 3. Индекс экспрессии MUC2 в гиперпластическом полипе, аденоме с неоплазией низкой и высокой степени и аденокарциноме
АВС и АК (р = 0,002, р = 0,022 и р = 0,004 соответственно), минимальная экспрессия была выявлена вАК (р = 0,007 для АНС, р = 0,019 для АВС) (рис. 3). Секреция кишечных муцинов практически отсутствовала в АК, а в аденомах была снижена до 5 — 20 % в IV и III компартментах. Продукция нейтральных углеводных групп статистически не отличалась в исследуемых группах. Экспрессия желудочного муцина МиС5АС в ГП была выше, чем в АНС, АВС и АК (р = 0,002, р = 0,006 и р = 0,023 соответственно); продукция MUC1 в ГП увеличена по сравнению с АНС (р = 0,025), в АВС и АК экспрессии выявлено не было; секреция MUC6 выявлена в трех случаях ГП и в двух случаях в АНС.
При сравнении полиповидного образования с соответствующей «переходной слизистой» различия в продукции муцинов выявлены в цилиндрических клетках. Индекс секреции сиаломуцинов был выше в клетках слизистой оболочки переходного типа по сравнению с полиповидными образованиями (р = 0,004 для АНС, р = 0,009 для АВС, р = 0,003 для АК), в ГП уровень продукции сиаломуцинов соответствовал таковому в «переходной слизистой». Достоверные различия в секреции сульфогрупп кишечного муцина выявлены только при сопоставлении АК и «переходной слизистой» (р = 0,004). Экспрессия кишечного муцина MUC2 была различной, причем в цилиндрических клетках ГП уровень был выше, чем в «переходной слизистой» (р = 0,002), а в аденомах с неоплазией высокой степени и аденокарциномах ниже (р = 0,002 и р = 0,33 соответственно). Достоверных различий продукции нейтральных муцинов по крипте не было обнаружено, однако случаев с их наличием в «переходной слизистой» ГП выявлено 11, в АНС — 7, в АВС — 5, причем максимальный индекс продукции выявлен в IV компартменте во всех исследуемых группах. Экспрессия желудочного муцина MUC5AC была выше в ГП и АНС по сравнению со слизистой оболочкой переходного типа (р = 0,003 и р = 0,046 соответственно), в АВС и АК она статистически не отличалась главным образом за счет снижения экспрессии поли-повидными образованиями.
«Переходные слизистые» различных полиповид-ных образований отличались между собой по про-
дукции сульфогрупп кишечного муцина с увеличением в таковой ГП по сравнению с АК (р = 0,011). MUC2 экспрессировался выше в участке слизистой переходного типа АВС, по сравнению с таковой рядом с ГП и АНС (р = 0,004 и р = 0,023 соответственно). Не было выявлено достоверных различий в секреции муцинов между «переходной слизистой» и нормальной слизистой оболочки толстой кишки.
Экспрессия CDX2 достоверно не отличалась как в полиповидных образованиях, так и в «переходной слизистой», однако интенсивность иммуногистохи-мической метки была слабее в АК, однако этот параметр ввиду субъективности нами не учитывался.
Экспрессия Ki-67 в железистом эпителии АК превышала таковую в ГП, АНС и АВС (р = 0,008, р = 0,016 и р = 0,005 соответственно), в АВС была выше, чем в ГП и АНС (р = 0,015 и р = 0,016 соответственно). При этом отмечалось расширение пролиферативного компартмента в ГП до средней и верхней трети крипты, смещение его в АНС и АВС и равномерно высокий индекс экспрессии с уровнем до 95 % в АК. По митотической активности достоверные различия выявлены в I компартменте с увеличением в ГП больше по сравнению с АНС и АВС (р = 0,002 и р = 0,003 соответственно), в IV компартменте увеличение пролиферации в АНС, АВС и АК по сравнению с ГП (р = 0,002, р = 0,008 и р = 0,004 соответственно) (рис. 4, 5). Экспрессия Ki-67 в «переходной слизистой» исследуемых группах была достоверно ниже, чем в соответствующих полиповидных образованиях (р = 0,029 для ГП, р = 0,009 для АНС, р = 0,005 для АВС, р<0,05 для АК). При сравнении «переходной слизистой» различных полиповидных образований между собой, достоверных различий выявлено не было. Необходимо отметить, что в слизистой оболочке переходного типа была выявлена пролиферация во II компартменте, тогда как в неизмененных криптах она присутствует только в I компартменте.
Индекс экспрессии р53 в железистом эпителии АК был достоверно выше по сравнению с ГП, АНС и АВС (р = 0,006, р = 0,002 и р = 0,0049 соответственно), по другим группам различий выявлено не было. В «переходной слизистой» экспрессия р53 была ниже, чем в соответствующих полиповидных образованиях
III
II
р=0,004
р=0,008
р=0,002
р=0,007
р=0,009
р=0,003
р=0,02 р=0,02
р=0,009
р=0,003 р=0,04
р=0,003
р=0,035
р=0,002
р=0,002
р=0,003
р=0,05
р=0,03
р=0,022
ГП
75-100%
АНС
АВС
50-74,9%
25-49,9%
АК
5-24,9%
Рис. 4. Распределение по компартментам пролиферации в гиперпластическом полипе, аденоме с неоплазией низкой и высокой степени и аденокарциноме. Каждый случай наблюдения обозначен квадратом. Размер квадрата полуколичественно отражает индекс продукции нейтральных муцинов
s
д 75.00
е
Я о
я о
л 50.00
S
v
CD р
ß
25.00
s
р=0,008
р=0,015
р=0,382
I
р=0,016
р=0,0016
-
т
р=0,005
ГП
АНС
АВС
АК
Рис. 5. Индекс пролиферации в гиперпластическом полипе, аденоме с неоплазией низкой и высокой степени и аденокарциноме
(р = 0,023 для ГП, р = 0,005 для АНС, р = 0,043 для АВС, р = 0,002 для АК). Распределение экспрессии р53 по компартментам соответствовало пролиферативной активности: достоверное увеличение в верхней трети крипт и в поверхностном эпителии в АНС, АВС и АК по сравнению с ГП, при этом в ГП в нижней трети крипты экспрессия была выше.
Обсуждение. Оценка профиля муцинов отражает функциональную активность эпителиоцитов [13] и цитопротективные свойства слизистой оболочки, а также указывает на степень зрелости и характер диф-ференцировки колоноцитов [14]. Наибольшими протекторными свойствами обладают MUC2, и муцины в составе, которых содержаться сульфогруппы [13]. Уменьшение продукции этих муцинов способствует избыточному действию мутагенных факторов (продуктов распада белков, канцерогенных веществ содержащихся в пище и др.) на колоноциты с развитием хронического воспаления, что является дополнительным повреждающим фактором [15—16]. Экспрессия желудочных муцинов в ГП, вероятно, представляет
собой своеобразный ответ на повреждение, что компенсируется расширением пролиферативного компартмента при сохранении дифференцировки клеток. Различия в распределении муцинов в бокаловидных клетках исследуемых групп практически отсутствуют, поэтому изменение муцинового профиля происходит за счет большей (как в ГП) или меньшей (как в АНС, АВС) секреции их цилиндрическими клетками. Пролиферативная активность одинакова в ГП, АНС, хотя опухолевый потенциал этих образований различен. Это обстоятельство можно объяснить тем, что экспрессия Ki-67 в АНС расположена в верхней части и на поверхности крипт, где, с одной стороны, действуют повреждающие факторы просвета толстой кишки, а с другой — отсутствуют собственные протективные свойства муцинов, поскольку пролиферирующие клетки не способны секретировать их в полном объеме. Это способствует дополнительному повреждению клеток и появлению новых мутаций с переходом аденомы низкой степени в аденому с неоплазией высокой степени, при этом
I
митотическая активность последней уже значительно повышается, и далее в аденокарциному.
Наличие секреции желудочных муцинов (нейтральных муцинов MUC1, MUC5AC) в «переходной слизистой» аденокарцином, аденом и гиперпластических полипов является своеобразной фенотипи-ческой особенностью, отличной от нормальной слизистой оболочки толстой кишки. Максимальная продукция выявлена в поверхностном эпителии и в верхней трети крипт, что, вероятно, связано с активацией генов, обеспечивающих желудочный фенотип. Причиной изменения цитопротекции при этом может быть компенсаторная реакция на уменьшение продукции кишечных муцинов полиповидного образования, расположенного рядом, (как например, в аденомах и аденокарциномах — снижение экспрессии кишечных муцинов). Различия в продукции кишечных муцинов не имели тенденций, коррелирующих с увеличением злокачественного потенциала полиповидного образования. Расширение пролифератив-ного компартмента, с появлением делящихся клеток в средней части крипты, вероятно, обусловлено ускоренным прохождением колоноцитами клеточного цикла, что может быть связано с повреждением и/ или паракринным действием полиповидного образования. Таким образом, согласно полученным данным, не доказано участие «переходной слизистой» в процессах канцерогенеза, однако расширение пролифе-ративного компартмента и появление в этих участках желудочных муцинов, возможно, является проявлением формирования гиперплазии, подобной гиперпластическому полипу.
Выводы
1. Клеточное обновление в аденомах толстой кишки характеризуется смещением пролиферативного компартмента в верхнюю треть крипт с увеличением пролиферативной активности и уменьшением продукции сиало-, сульфомуцинов и MUC2, что определяет канцерогенный потенциал данного образования.
2. Гиперпластический полип представляет собой гастроинтестинальный фенотип, для которого характерно расширение пролиферативного компартмента с увеличением продукции кишечных (сиало-, сульфомуцинов и MUC2) и появлением желудочных муцинов, (MUC5AC, MUC1 и нейтральных углеводных групп) в цилиндрических и бокаловидных клетках.
3.«Переходная слизистая» является самостоятельным фенотипом кишечного эпителия, для которого характерна гетерогенность продукции кишечных муцинов, появление желудочных муцинов, с расширением пролиферативного компартмента до средней трети крипты.
Библиографический список
1. Давыдова, М. И. Огатистика злокачественных образований в России и странах СНГ в 2007 г. / М. И. Давыдова, Е. М. Аксель // Вестник РОНЦ им. Н. Н. Блохина. - 2009. - Т. 20, № 3. - С. 57-63.
2. Cancer statistics, 2007 / A. Jemal [et al.] // CA. - 2007. -Vol. 57, № 1. - Р. 43-66.
3. Redston, M. Carcinogenesis in the GI tract: From morphology to genetics and back again / M. Redston // Mod. Pathol. - 2001. -Vol. 14. - P. 236-245.
4. Suminori, K. Genetic polymorphisms of methylenetetrahydro-folate reductase and colorectal cancer and adenoma / K. Suminori, C. Kun // Ann. Pathol. - 2005. - Vol. 5. - P. 25-58.
5. Hyperplastic polyps and the risk of adenoma recurrence in the polyp prevention trial / A.O. Laiyemo [et al.] // Clin. Gastroenterol. Hepatol. - 2009. - Vol. 7 (2). - P. 192- 197.
6. Hyperplastic polyposis associated with two asynchronous colon cancers / M. Kurobe [et al.] // World J. Gastroenterol. - 2007. -Vol. 13 (23). - P. 3255-3258.
7. Hamilton, R. Pathology and Genetics of Tumours of the Digestive System / R. Hamilton, A. Lauri // WHO. - 2000. - P. 105-113.
8. Progression of tumors arising from large ACF is associated with the MUC5AC expression during rat colon MNNG carcinogenis / N. Maurin [et al.] // Int. J. Cancer. - 2007. - Vol. 120, № 3. -P. 477-483.
9. A study of the expression of Cyclin E and its isoforms in tumor and adjacent mucosa, correlated to patient outcome in early colon cancer / I. Corin [et al.] // Acta Oncol. - 2010. - Vol. 49, № 1. -P. 63-69.
10. Identification and distribution of thioredoxin-like 2 as the antigen for the monoclonal antibody MC3 specific / Y. Lu [et al.] // Proteomics. - 2008. - Vol. 8, № 1. - P. 2220-2229.
11. Kearney, K. E. Increased expression of fatty acid synthase in human aberrant crypt foci: possible target for colorectal cancer prevention / K. E. Kearney, T. G. Pretlow, T. P. Pretlow // Int. J. Cancer. -2009. - Vol. 125, № 1. - P. 249-252.
12. Ectopic expression of P-cadherin correlates with promoter hypomethylation early in colorectal carcinogenesis and enhanced intestinal crypt fission in vivo / A. Milicic [et al.] // Cancer Res. -2008. - Vol. 68, № 19. - P. 7760-7768.
13. Johansson, M. E. Proteomic analyses of the two mucus layers of the colon barrier reveal that their main component, the Muc2 mucin, is strongly bound to the Fcgbp protein / M. E. Johansson, K. A. Thomsson, G. C. Hansson // J. Proteome Res. - 2009. - Vol. 8, № 7. - P. 3549-3557.
14. Intestinal MUC2 and gastric M1/MUC5AC in preneoplastic lesions induced by1,2-dimethylhydrazine in rat: a sequential analysis / S. Zoghbi [et al.] // Int. J. Oncol. - 2007. - Vol. 30, № 2. - P. 489-497.
15. Muc2 protects against lethal infectious colitis by disassociating pathogenic and commensal bacteria from the colonic mucosa / K. S.EBergstrom [et al.] // PLoS Pathog. - 2010. - Vol. 13, № 5. -P. 902- 1000.
16. The inner of the two Muc2 mucin-dependent mucus layers in colon is devoid of bacteria / M. E. Johansson [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2008. - Vol. 30, № 39. - P. 15064- 15069.
ОСИНЦЕВА Ирина Леонидовна, клинический ординатор кафедры патологической анатомии с курсом клинической патологии Омской государственной медицинской академии.
МОЗГОВОЙ Сергей Игоревич, кандидат медицинских наук, доцент кафедры патологической анатомии с курсом клинической патологии Омской государственной медицинской академии. ПАНЮШКИН Леонид Васильевич, заведующий эндоскопическим отделением Западно-Сибирского медицинского центра медико-биологического агентства России.
МАХРОВ Андрей Станиславович, врач-эндоскопист эндоскопического отделения Западно-Сибирского медицинского центра медико-биологического агентства России.
Адрес для переписки: 644099, г. Омск, ул. Партизанская, 20.
Статья поступила в редакцию 18.08.2010 г.
© И. Л. Осинцева, С. И. Мозговой, Л. В. Панюшкин, А. С. Махров
