CC BY
94
Сравнительная оценка методов детекции ботулотоксина в клиническом материале от больных людей
Т.Ю. Загоскина1 (T_Y_Z_@mail.ru), С.В. Балахонов1, Е.А. Чапоргина1, Е.Ю. Марков1, О.В. Гаврилова1, О.Б. Бодрых2, Т.М. Долгова1, Т.С. Тайкова1, Т.А. Иванова1, Ю.О. Попова1, А.В. Корнева1
1ФКУЗ «Иркутский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора
2ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Иркутской области» Роспотребнадзора, г. Иркутск
Резюме
Сконструирована высокочувствительная специфичная тест-система для дот-иммуноанализа, позволяющая проводить скрининг клинического материала на ботулотоксин в течение двух часов. При этом исключается необходимость использования в работе лабораторных животных.
Ключевые слова: ботулинический токсин, биологическая проба, дот-иммуноанализ
comparative Estimation of Methods for Botulotoxin Detection in clinical Material from patients
T.Yu. Zagoskina1 (adm@chumin.irkutsk.ru), S.V. Balakhonov1, E.A. Chaporgina1, E.Yu. Markov1, O.V. Gavrilova1, O.B. Bodryh2, T.M. Dolgova1, T.S. Taikova1, T.A. Ivanova1, Yu.O. Popova1, A.V. Korneva1
1 Federal State Institution of Public Health «Irkutsk Antiplague Research Institute» of Federal Service on Customers' Rights Protection and Human Well-Being Surveillance
2 Federal Budget Institution of Public Health «Center of Hygiene and Epidemiology in Irkutsk Region» of Federal Service on Customers' Rights Protection and Human Well-Being Surveillance, Irkutsk
Abstract
High-sensitive, specific test-system for dot-immunoassay permitting to screen a clinical material for botulotoxin within two hours was designed. Necessity of laboratory animal application for the experiment is thus excluded but efficiency. Key words: botulinic toxin, biological test, dot-immunoassay
Введение
Ботулизм - тяжелая токсикоинфекция, обусловленная преимущественным поражением ЦНС экзотоксинами спорообразующих анаэробных бактерий Clostridium botulinum. Ботулотоксины (БТ) - яды биологического происхождения II группы патогенности - с высокой вероятностью могут быть использованы в качестве поражающих агентов при совершении актов биологического и химического терроризма [1]. Ботулинические нейротоксины подразделяются на серотипы А, В, С, D, Е, F, G и недавно обнаруженный новый серотип H [2 - 4]. Несмотря на довольно высокое сходство первичной структуры серотипов [5, 6], внутриклеточные белки-мишени разных типов токсинов, их характеристики действия и эффективность значительно различаются [7]. Все они чрезвычайно токсичны, ингибируют высвобождение ацетилхолина в нервно-мышечном соединении. Наиболее патогенны для человека токсины серотипов А, В, Е и F [5]. Все типы токсинов C. botulinum обусловливают одинаковую картину заболевания, но токсин каждого типа иммунохимически специфичен и нейтрализуется только соответствующим антитоксином.
За рубежом «золотым стандартом» детекции БТ в клиническом материале и пищевых продуктах является тест на летальность мышей - высокочувствительная, но дорогостоящая и требующая большого расхода времени процедура [8]. Чувствительность определения ботулинических токсинов в биопробе на мышах выражают в средней летальной дозе LD50, составляющей приблизительно 10 пг/мл [9].
К сожалению, не всегда есть возможность проведения работ с лабораторными животными, а сроки получения результатов в биологической пробе (БП) и реакции биологической нейтрализации токсина (РБНТ) велики.
С целью ускорения процедуры определения и идентификации ботулотоксинов, а также с целью отказа от использования лабораторных животных для рутинного скрининга клинического материала, пищевых продуктов и объектов окружающей среды предпринимаются попытки разработки надежных высокочувствительных экспрессных и информативных методов обнаружения ботулинических токсинов in vitro.
Цель исследования - сравнительная оценка чувствительности различных методов детекции ботулотоксинов (БП, РБНТ на белых мышах и дот-иммуноанализа (ДИА)) и затрат времени на получение с их помощью результатов.
Материалы и методы
Детекцию БТ в лабораториях Центра гигиены и эпидемиологии проводят преимущественно постановкой биологической пробы и реакции биологической нейтрализации токсина на белых мышах обоего пола весом 20 г с использованием диагностических противоботулинических поли- и моновалентных сывороток серотипов А, В, Е и Г Ориентировочный ответ при применении методов с использованием лабораторных животных получают на 2-е сутки, окончательный - через 4 - 8 суток.
При постановке РБНТ лабораторным животным внутрибрюшинно вводят исследуемый материал в смеси с одной из моноспецифических либо с поливалентной противоботулинической сывороткой. Контрольным животным вводят испытуемый образец в чистом виде. За время исследования мыши, не защищенные тем типом антитоксина, которым вызвано заболевание у пациента, погибают. Остаются живыми лабораторные животные, которым вводили исследуемый материал в смеси с поливалентной сывороткой или с сывороткой, соответствующей типу токсина, циркулирующего в крови больного. Чувствительность РБНТ составляет 30 - 40 пг/мл ботулотоксина.
Для постановки БП экстракты из исследуемого материала делят на две части. Одну из них кипятят на водяной бане в течение 20 - 30 минут для разрушения токсина. Постановка биологической пробы является ориентировочным исследованием и сводится к тому, что каждый образец кипяченого и некипяченого материала вводят двум мышам внутрибрюшинно по 0,5 мл или подкожно по 1,0 мл. Если в материале содержится ботулиниче-ский токсин, животные, получившие некипяченый образец, погибают, а получившие кипяченый -остаются живыми. Чувствительность БП составляет также 30 - 40 пг/мл ботулотоксина [10].
Одним из перспективных методов обнаружения патогенов и диагностики вызываемых ими заболеваний является дот-иммуноанализ (ДИА). Достаточно высокие специфичность и чувствительность, простота постановки, миниатюризация (объем пробы ~ 1 мкл), экспрессность (время реакции ~ 2 ч), отсутствие потребности в дорогостоящих реактивах и оборудовании делают ДИА перспективным для индикации патогенных биологических агентов методом, особенно в условиях работы мобильных автолабораторий эпидразвед-ки.
Результаты и обсуждение
При создании новых способов детекции ботулотоксинов исходят из того, что эффективный
метод должен превосходить по чувствительности биотест на мышах, минимально реагировать на неспецифические воздействия со стороны исследуемых биологических субстратов, иметь высокую производительность и экспрессность, давать возможность идентифицировать серотип боту-лотоксинов с одновременной их количественной оценкой. И наконец, для работы в условиях чрезвычайной ситуции необходима разработка простых в постановке высокочувствительных диагностических тест-систем, не требующих громоздкого оборудования и использования лабораторных животных.
Нами сконструирована тест-система для дот-иммуноанализа, позволяющая в течение приблизительно двух часов детектировать БТ в клиническом материале от больных ботулизмом людей. С этой целью подобраны способы выделения и очистки специфических ^ из коммерческих поливалентных и моноспецифических противоботу-линических сывороток, применяемых в РБНТ и обеспечивающих высокую чувствительность обнаружения токсина; оптимизированы условия связывания ^ с наночастицами коллоидного серебра размером 5 - 9 нм; подобраны временной и температурный режимы проведения всех этапов дот-иммуноанализа [11].
Испытание ДИА на клиническом материале (рвотные массы, промывные воды желудка, содержимое кишечника, клизменные воды, сыворотки крови, моча) больных людей с установленным диагнозом «ботулизм» показало его высокую эффективность (табл. 1, 2). Пробы, содержащие БТ, в виде темно-серых пятен разной интенсивности проявлялись в местах нанесения образцов на мембрану. В отрицательных контролях (промывные воды желудка больных острыми кишечными инфекциями сальмонеллезной, шигеллезной и эшерихиозной этиологии, разводящая жидкость) окрашивания не развивалось, что свидетельствовало о специфичности разработанной тест-системы.
Положительные результаты исследования клинического материала в ДИА не только полностью совпадали с аналогичными результатами, полученными в БП и РБНТ на белых мышах, но и в ряде случаев превосходили их по чувствительности. Так, от больного N. положительные результаты были получены (совпадали) в трех указанных методах при исследовании содержимого кишечника, промывных вод желудка, рвотных масс, клизменных вод, однако в ДИА у этого же больного дополнительно был выявлен ботулотоксин в крови и моче. Время проведения БП составило 38 часов, РБНТ - также 38 часов, ДИА - приблизительно 2 часа.
Положительный результат исследования крови и мочи в дот-иммуноанализе свидетельствует, на наш взгляд, не только о более высокой чувствительности метода, но и о возможности обнаруже-
Таблица 1.
Сравнительные результаты исследования клинического материала от больного с диагнозом «ботулизм» в БП, РБНТ и ДИА
Материал для исследования Результат
БП рбнт ДИА
Промывные воды желудка Положит. Положит. Положит.
Содержимое кишечника Положит. Положит. Положит.
Рвотные массы Положит. Положит. Положит.
Клизменные воды Положит. Положит. Положит.
Кровь Отрицат. Отрицат. Положит.
Моча Отрицат. Отрицат. Положит.
Таблица 2.
Сравнительная оценка чувствительности методов БП и ДИА при исследовании клинического материала от больных с диагнозом «ботулизм»
Промывные воды желудка Результат
БП ДИА
От больного Х. Ц 1:256
От больного Z. Ц 1:128
От больного М. 1:2 1:512
От больного^ Ц 1:256
От больного S. 1:2 1:512
Примечание: Ц - цельный материал.
ния ботулотоксина в составе циркулирующих иммун- Выводы ных комплексов в биологических средах организма, 1. что повышает диагностическую ценность ДИА.
При сравнении чувствительности БП и ДИА были параллельно исследованы различные разведения (1:2 - 1:512) нативных образцов клинического материала (промывных вод желудка) от больных Х. (проба № 1), Z. (проба № 40), М. (проба № 41), ^ (проба № 44) и S. (проба № 48). Гибель белых мы- 2. шей зарегистрирована через 36 часов в разведении исследуемого материала в БП (цельный материал - 1:2). В ДИА ботулотоксин в указанных образцах обнаруживался в разведениях 1:128 - 1:512. Бо- 3. лее высокие разведения исходных образцов (1:4 -1:512) в БП не вызывали развития заболевания или 4. гибели лабораторных животных. В ДИА все исследуемые образцы давали положительные результаты в разведениях 1:128 - 1:512 (см. табл. 2). Сроки получения результатов в ДИА -приблизительно через 2 часа от начала исследования.
Разработанная тест-система для ДИА превосходит традиционные биологические методы как по чувствительности, так и по скорости получения результата, что позволяет эффективно (с высокой чувствительностью и специфично-стью)проводить скрининг клинического материала на ботулотоксин в течение двух часов. При использовании ДИА для детекции ботулотоксина в клиническом материале от больных ботулизмом людей исключается необходимость использования в работе лабораторных животных. Разработанная тест-система для ДИА по сравнению с БП и РБНТ более экономична. Преимущество ДИА заключается также в возможности проведения нализа в лабораториях любого уровня (даже слабо оснащенных), а также в условиях работы санитарно-противо-эпидемических бригад в режиме чрезвычайных ситуаций. ш
Литература
Arnon S.S., Schechter R., Inglesby T.V., Henderson D.A., Bartlett J.G., Ascher M.S. et al. Botulinum toxin as a biological weapon: Medical and public health management. JAMA. 2001; 285 (8): 1059 - 1070.
Dover N., Barash J.R., Hill K.K., Xie G., Arnon S.S. Molecular characterization of a novel botulinum neurotoxin type H gene. J. Infect. Dis. 2014; 209 (2): 192 - 202.
Barash J.R., Arnon S.S. A novel strain of Clostridium botulinum that produces type B and type H botulinum toxins. J. Infect. Dis. 2014; 209 (2): 183 - 191. Yao G., Lee K., Gu S., Lam K.H., Jin R. Botulinum neurotoxin A complex recognizes host carbohydrates through its hemagglutinin componentcarbohydrates through its hemagglutinin component. Toxins (Basel). 2014; 6 (2): 624 - 635.
5. Загоскина Т.Ю., Марков Е.Ю., Балахонов С.В. Современные подходы к детекции и идентификации ботулинических токсинов. Инфекционные болезни. 2012; 1: 64 - 73.
6. Pellett S. Progress in cell based assays for botulinum neurotoxin detection. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 2013; 364: 257 - 285.
7. Куренков А.Л., Артеменко А.Р., Никитин С.С., Орлова О.Р Современные представления о механизмах действия ботулинического токсина типа А. Врач. 2009; 7: 8 - 12.
8. Аббасова С.Г., Руденко Н.В., Гороховатский А.Ю., Капралова М.В., Виноградова И.Д., Вертиев Ю.В., Несмеянов В.А., Гришин Е.В. Моноклональные антитела к ботулиническим нейротоксинам типов А, В, Е и F. Биоорганическая химия. 2011; 37 (3): 344 - 353.
9. apek, P, Dickerson, T.J. Sensing the deadliest toxin: technologies for botulinum neurotoxin detection. Toxins. 2010; 2 (1): 24 - 53.
10. ГОСТ 10444.7-86 «Продукты пищевые. Методы выявления ботулинических токсинов и Clostridium botulinum». Доступен на: http://docs.cntd.ru/docu-ment/1200021073.
11. Загоскина Т.Ю., Субычева Е.Н., Носырева Л.И., Бодрых О.Б., Марков Е.Ю., Вейде А.А. и др. Конструирование тест-системы для скрининга пищевых продуктов и клинического материала на ботулотоксин в дот-иммуноанализе. Журнал инфекционной патологии. 2009; 16 (3): 20 - 23.
References
1. Arnon S.S., Schechter R., Inglesby T.V., Henderson D.A., Bartlett J.G., Ascher M.S. et al. Botulinum toxin as a biological weapon: Medical and public health management. JAMA. 2001; 285 (8): 1059 - 1070.
2. Dover N., Barash J.R., Hill K.K., Xie G., Arnon S.S. Molecular characterization of a novel botulinum neurotoxin type H gene. J. Infect. Dis. 2014; 209 (2): 192 - 202.
3. Barash J.R., Arnon S.S. A novel strain of Clostridium botulinum that produces type B and type H botulinum toxins. J. Infect. Dis. 2014; 209 (2): 183 - 191.
4. Yao G., Lee K., Gu S., Lam K.H., Jin R. Botulinum neurotoxin A complex recognizes host carbohydrates through its hemagglutinin componentcarbohydrates through its hemagglutinin component. Toxins (Basel). 2014; 6 (2): 624 - 635.
5. Zagoskina T.Yu., Markov E.Yu., Balakhonov S.V. Modern approaches to detection and identification of botulinic toxins. Infektsionnye bolesni. 2012; (1): 64 - 73 (in Russian).
6. Pellett S. Progress in cell based assays for botulinum neurotoxin detection. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 2013; 364: 257 - 285.
7. Kurenkov A.L., Artemenko A.R., Nikitin S.S., Orlova O.R. Modern representations of action mechanisms of botulinic toxin of A type. Vrach. 2009; 7: 8 - 12 (in Russian).
8. Abbasova S.G., Rudenko N.V., Gorokhovatsky A.Yu., Kapralova M.V., Vinogradova I.D., Vertiev Yu.V. et al. Monoclonal antibodies to botulinic neurotoxins of A, B, Е and F types. Bioorganicheskaya chimiya. 2011; 37 (3): 344 - 353 (in Russian).
9. Capek P., Dickerson T.J. Sensing the deadliest toxin: technologies for botulinum neurotoxin detection. Toxins. 2010; 2 (1): 24 - 53.
10. State Standard 10444.7-86 «Foodstuffs. Methods for detection of botulinic toxins and Clostridium botulinum»». Аvailable at: http://docs.cntd.ru/docu-ment/1200021073.
11. Zagoskina T.Yu., Subycheva E.N., Nosyreva L.I., Bodrykh O.B., Markov E.Yu., Veide A.A. et al. Design of a test-system for screening of foodstuffs and clinical material for botulotoxin by dot-immunoassay. Zhurnal infektsionnoy patologii. 2009; 16 (3): 20 - 23 (in Russian).
Директор ФКУЗ «Иркутский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора (с 2008 г.), доктор медицинских наук, профессор Сергей Владимирович БАЛАХОНОВ
