CC BY
39
СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА КОСТНЫХ ТРАНСПЛАНТАТОВ, ЗАГОТОВЛЕННЫХ РАЗНЫМИ СПОСОБАМИ С ПОМОЩЬЮ ОРИГИНАЛЬНОЙ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ МОДЕЛИ
В.И. Савельев, A.A. Булатов, A.B. Калинин
ФГУ «Российский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии им. Р. Р. Вредена Росмедтехнологий», директор - д.м.н. профессор Р.М. Тихилов Санкт-Петербург
Любая исследовательская работа, посвященная сравнительной оценке тех или иных способов консервации костной ткани, начинается с выбора экспериментальной модели, которая должна соответствовать цели и задачам исследования, а также стандартизировать условия проведения опытов. Создание таких условий сопряжено с известными трудностями, связанными как с внешними, так и с внутренними факторами. К внешним следует отнести особенности оперативной техники, вызывающей разную степень травматизации тканей и нарушения при фиксации трансплантатов. При определённом навыке и усовершенствовании модели внешние факторы вполне преодолимы. Нежелательное влияние внутренних факторов, к которым относятся индивидуальные, возрастные, половые, конституционные особенности донора и реципиента, преодолеть сложнее. Наиболее правильный путь в данном случае - проводить подобного рода исследования на генетически однородных линиях животных. Однако, инбредные животные, особенно крупные, ещё слишком дороги, чтобы войти в повседневную практику большинства экспериментальных лабораторий. Следует отметить, что экспериментальные модели, используемые в настоящее время для изучения биопластических свойств костных трансплантатов, таких условий не обеспечивают. К недостаткам известных экспериментальных моделей следует отнести также их трудоемкость и потребность в большом расходе животных, часть из которых выводится из опыта без операции в связи с необходимостью получения от них значительного количества пластического материала [1 - 4, 6, 7].
Цель статьи - ознакомить специалистов с оригинальной, на наш взгляд, экспериментальной моделью, применяемой для изучения костных трансплантатов, заготовленных, стерилизованных и консервированных разными способами.
В 1967 году В.И. Савельевым была предложена оригинальная модель для сравнительного изучения эволюции костных трансплантатов [5]. Сущность модели заключается в том, что одному животному-реципиенту (собаке) пересаживается через одно -два ребра несколько трансплантатов (от 2 до 8), по-
лученных от одного животного-донора. Трансплантационным материалом служат фрагменты ребер, а местом их пересадки - их дефекты, образуемые у подопытных животных в результате резекции как с левой, так и с правой стороны грудной клетки.
В дальнейшем автором был предложен усовершенствованный вариант экспериментальной модели, при которой полученные оперативным путем с одной стороны грудной клетки костные трансплантаты, после соответствующей обработки стерилизующими или консервирующими средствами, пересаживались в дефекты ребер другой стороны грудной клетки этому же животному (рис. 1). Таким образом, если при первом варианте речь шла об аллогенной трансплантации кости, то во втором - о костной аутопластике.
АУТОПЛАСТИКА
АЛЛОПЛАСТИКА
Рис. 1. Предлагаемый вариант модели — костная аутопластика. Взятый фрагмент ребра (1) после соответствующей обработки пересаживают тому же животному на другую сторону грудной клетки (2). Прототип — костная аллопластика. Полученные у животного-донора трансплантаты (3) пересаживают другому животному-реципиенту на обе стороны грудной клетки. В костномозговой канал трансплантата (3) введён плоский копьевидный стержень.
Применение второго варианта существенно повышало достоверность получаемых результатов в связи с полным соответствием пластического материала индивидуальным и всем остальным особенностям организма реципиента. Иначе говоря, в отличие от первого варианта, устранялось несоответствие между однородным в антигенном отношении пластическим материалом и неоднородным воспринимающим ложем. При этом значительно сокращались сроки выведения животных из опытов, поскольку максимальные сроки наблюдения за ними обычно не превышали 6 месяцев, тогда как при костной аллопластике они составляли не менее 1 года. Устранение трудностей, связанных с воспроизведением одинаковых условий эксперимента, введение адекватного контроля, каковым является свежий, не консервированный фрагмент ребра, способствовало тому, что все выявляемые в опытах особенности репара-тивного остеогенеза при трансплантации костной ткани, консервированной различными способами и в различные сроки, можно было ставить в зависимость только от их влияния. Важно также отметить, что ни одна из применяемых ныне экспериментальных моделей по костной пластике не позволяет использовать одновременно такое количество кости, однородной по своей структуре, объему и форме.
В процессе усовершенствования второго варианта модели были изучены разные способы фиксации трансплантатов и предложен свой, заключающийся в использовании плоского копьевидного стержня, изготовленного путём ковки из применяемых в травматологии и ортопедии спиц и вводимого интраме-дуллярно. Такой стержень надежно скреплял концы резецированных ребер, устранял подвижность в местах их соединения с трансплантатом и препятствовал смещению последнего по оси ребра («скручиванию»). Кроме того, он уменьшал нагрузку на центральную часть трансплантата, особенно в разгар его перестройки, что предотвращало возникновение переломов и ложных суставов. Особенно удобным оказался копьевидный стержень при пересадке деминерализованной кости, фиксация которой другими способами была менее надежной. Кроме усовершенствования методики фиксации, было предложено иссекать часть ребра, на 2 - 3 мм меньше размеров трансплантата, что позволяло создавать по линии соединения костей определенную компрессию. Все это, в конечном итоге, способствовало улучшению условий приживления трансплантатов и благоприятствовало их замещению костным регенератом. Необходимо отметить, что наиболее ответственным этапом операции является отслоение с помощью распатора плеврального листка надкостницы с внутренней стороны ребра. Во время его выполнения возможно повреждение плевры. Возникший при этом пневмоторакс ликвидируется общеизвестным способом, т.е. путем зашивания плевры и откачивания воздуха из плевральной полости. Собаку при этом срочно инту-
бируют и временно переводят на искусственное дыхание. Интубацию можно произвести и до операции. Отмеченное осложнение, как показал наш опыт, наблюдается редко и не оказывает отрицательного влияния на исходы пересадок. Гибели животных на операционном столе мы не наблюдали
Методика эксперимента. У 38 животных с левой стороны грудной клетки поднадкостнично резецировались участки трех ребер, из которых затем изготавливались трансплантаты длиной 35 мм. Образовавшиеся при этом дефекты ничем не замещались. Рана послойно зашивалась наглухо. Взятые препараты после тщательного удаления остатков надкостницы консервировались различными способами: замораживанием при -20°С, в 0,5% растворе нейтрального формалина и путем деминерализации в 2,4 н. растворе соляной кислоты с последующей отмывкой в стерильном физиологическом растворе и хранением в 70° спирте при +4°С. Сроки хранения трансплантатов в зависимости от условий опыта составляли от 1 до 3 месяцев. Спустя указанное время собаки оперировались повторно уже на противоположной, правой стороне грудной клетки, где также производилась резекция ребер с последующим замещением дефектов консервированными трансплантатами. Одномоментно одной собаке пересаживали (через интактное ребро) от 3 до 4 реберных трансплантатов. Один из них - «свежий», взятый на операции, был контрольным. Собак выводили из опыта, руководствуясь «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ МЗ СССР №755 от 12.08.1977) через 15, 30, 90 и 180 суток. Полученные на секции препараты подвергались макроскопическому, рентгенологическому (обязательно в двух проекциях), гистологическому и гистотопографическому изучению. Окраска гистологических препаратов производилась гематоксилином-эозином и по ван Гизону.
На 15 сутки, помимо воспалительных изменений, в зоне оперативного вмешательства наблюдались незначительные периостальная и эндостальная реакции со стороны концевых отделов костного ложа и очаговая остеокластическая резорбция трансплантатов. Деминерализованные трансплантаты рентгенологически не определялись. К 30 суткам между трансплантатами и костным ложем формировалась первичная костная спайка. Периостальный остеоге-нез был более выражен, чем в предыдущий срок, особенно с внутренней (плевральной) поверхности трансплантатов. Концы последних на рентгенограммах были размыты, гистологически в области соединения выявлялась новообразованная костная ткань губчатого или пластинчатого характера. Через 90 суток на месте пересадки, в основном со стороны плевральной поверхности, обнаруживались сформированные костные регенераты, соединяющие концы оперированных ребер (рис. 2, 3).
а б в г д
Рис. 2. Рентгенограмма аутотрансплантатов на 90 сутки после операции: а — трансплантат не консервирован; б — консервирован формалином; в — деминерализован; г — консервирован замораживанием; д — трансплантат не применялся.
На гистологических препаратах к этому времени в каждом регенерате можно было видеть хорошо выраженный кортикальный слой и костномозговую полость, заполненную густой сетью новообразованных балок с наличием миелоидного и жирового костного мозга (рис. 4). Спустя 180 суток при рентгенологическом и гистологическом исследованиях наблюдалось практически полное анатомическое восстановление целостности оперированных костей, не отличающихся по своему строению от интактных ребер. Место пересадки можно было определить лишь по расположению металлических стержней. При гистологическом исследовании в толще новой кости, возникшей после формалинизи-рованного трансплантата, еще продолжали встречаться его микроскопические участки, претерпевающие дальнейшую перестройку (рис. 5).
Таким образом, выбор экспериментальной модели при изучении результатов трансплантации костной ткани и оценке её биологической активности продолжает сохранять свою актуальность и практическую значимость. В этом отношении предлагаемая в статье рабочая модель наиболее точно отвечает экспериментальным требованиям, поскольку практически полностью устраняет недостатки, присущие другим моделям. Она стандартизирует пластический материал в морфологическом и антигеном отношениях и ставит его в одинаковые условия после пересадки. Модель значительно сокращает расход животных, поскольку на одной собаке выполняется несколько операций. В отличие от других моделей все манипуляции на одном живот-
а б ' в г
Рис. 3. Гистотопограмма аутотрансплантатов на 90 сутки после операции: а — трансплантат не консервирован; б — консервирован формалином; в — деминерализован; г — консервирован замораживанием. Отмечается хорошее сращение трансплантатов с концами резецированных рёбер, рассасывание и частичное замещение компактных слоёв трансплантатов новообразованной костной тканью.
Рис. 4. Миелоидный и жировой костный мозг в костномозговой полости новой кости, сформировавшейся на месте трансплантата, консервированного замораживанием (микрофотография). Срок наблюдения — 90 суток после операции. Окраска гематоксилином и эозином, увеличение X 100.
ном, как и его забой, производятся в один срок, что исключает влияние временного фактора. Наконец, модель позволяет производить одномоментно орто-топическую пересадку нескольких однородных по форме, величине и структуре костных трансплантатов одному животному-реципиенту.
Проведенные нами эксперименты показали, что использованные в работе фрагменты ауторёбер обладают высокой биологической активностью. У большинства животных в короткие сроки (3-6 месяцев) после пересадки на месте реберных дефектов сфор-
Рис. 5. Участки формалинизированного трансплантата в толще новообразованной пластинчатой кости (микрофотография). Срок наблюдения — 180 суток после операции. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение X 100.
мнровалась новая кость, имеющая органотипичес-кое строение. По скорости костеобразования и перестройки деминерализованные трансплантаты занимали первое место, замороженные - второе, фор-малинизированные - третье. Однако в зоне замороженного и формалинизированного трансплантатов, по сравнению с деминерализованным, всегда формировалась более плотная костная ткань, хотя и значительно позднее. Полученные результаты позволяют судить о роли тех или иных компонентов костной ткани в процессах остеогенеза. Прежде всего, они свидетельствуют о том, что основное вещество аутотрансплантатов оказывает на исходы пересадок положительное воздействие, чего нельзя сказать о минеральных элементах, присутствие которых в трансплантатах тормозит их ассимиляцию. Рассасывание и утилизация минеральной основы кости требует от организма реципиента дополнительных энергетических и временных затрат. Интересные данные были получены при сравнительном изучении репаративного остеогенеза после трансплантации нативной аутокости и аутокос-ти, консервированной замораживанием, в слабых растворах формалина или путем деминерализации. До проведения экспериментов предполагалось, что под воздействием указанных факторов в аутотран-сплантате произойдут определенные биохимические и морфологические сдвиги, в результате чего он утратит свои преимущества. В действительности оказалось иначе. Аутокость, консервированная в течение одного месяца при -20°С, после пересадки своему хозяину, обеспечивала, в основном, такие же результаты как и свежий, т.е. только что взятый на операции трансплантат. Высокие биопластические
свойства сохраняла аутокость и после консервирования ее 0,25% раствором формалина. Однако полная перестройка формалинизированных аутотран-сплантатов, по сравнению с замороженными, происходила медленнее в связи с отставанием процессов рассасывания и замещения их новой костью. Опыты с аутопластикой лишний раз подтверждают, что жизнеспособность костнопластического материала не является единственным и тем более главным условием успеха при его клиническом применении.
Таким образом, с помощью усовершенствованной модели были получены следующие практически важные данные:
- деминерализованная кость является весьма перспективным костно-пластическим материалом, пригодным для внедрения в клинику;
- методы консервации биологических тканей
0.25. раствором формалина или замораживанием не исключают друг друга с точки зрения их практического применения, однако перестройка формалинизированных трансплантатов происходит более медленными темпами;
- жизнеспособность изолированных костных аутотрансплантатов не оказывает решающего влияния на результаты пересадки.
В заключение следует подчеркнуть, что сравнительная оценка биопластических свойств костных трансплантатов, произведенная с помощью оригинальной экспериментальной модели, подтвердила ее несомненную пригодность и информативность. Она позволяет исключить влияние на исходы операций иммунологических, видовых и других наслоений, тем самым стандартизировать условия эксперимента и обеспечить достаточную сопоставимость полученных данных.
Литература
1. Имамалиев, A.C. Заготовка и консервация тканей опорно-двигательного аппарата / A.C. Имамалиев.
- М. : Медицина, 1970. - 224 с.
2. Имамалиев, A.C. Костная ксенопластика / A.C. Имамалиев, Б. Хабижанов, И.Я. Жуковский. — М. : Медицина, 1974. — 216 с.
3. Коваленко, П.П. Гомотрансплантация замороженных костей / П.П. Коваленко. — Ростов-на-Дону : Ростовское кн. изд-во, 1961. — 176 с.
4. Корж, A.A. Репаративная регенерация кости / A.A. Корж, A.M. Белоус, Е.Я. Панков. — М. : Медицина, 1972. — 232 с.
5. Савельев, В.И. Химическая стерилизация тканевых трансплантатов и применение их в пластической хирургии : автореф. дис. ... д-ра мед. наук / Савельев Владимир Ильич. — Омск, 1967. — 30 с.
6. Ткаченко С.С. Костная гомопластика в травматологии и ортопедии / С.С. Ткаченко. — Л. : б.и., 1966. — 174 с.
7. The healing of segmental bone defects induced by demineralized bone matrix / T.A. Einhorn [et al.] // J. Bone Joint Surg. — 1984. — Vol. 66-A, N 1. — P. 274 — 279.
