СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА КАТАЛАЗНОЙ АКТИВНОСТИ И УСТОЙЧИВОСТИ К НЕБЛАГОПРИЯТНЫМ ФАКТОРАМ СРЕДЫ ШТАММОВ КЛУБЕНЬКОВЫХ БАКТЕРИЙ BRADYRHIZOBIUM JAPONICUM И SINORHIZOBIUM FREDII СЕЛЕКЦИИ ВНИИ СОИ Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

Вестник ДВО РАН. 2019. № 3

УДК 631.52:576.851.155:577.158.7 DOI: 10.25808/08697698.2019.205.3.006

М.В. ЯКИМЕНКО, С.А. БЕГУН, А.И. СОРОКИНА

Сравнительная оценка каталазной активности и устойчивости к неблагоприятным факторам среды штаммов клубеньковых бактерий Bradyrhizobium japonicum и Sinorhizobium fredii селекции ВНИИ сои

Коллекционные штаммы клубеньковых бактерий сои Bradyrhizobium japonicum (Jordan, 1982) и Sinorhizobium fredii (Scholia, Elkan, 1984) различаются по стрессоустойчивости (повышенное содержание NaCl в питательной среде, повышенная температура выращивания) и обладают различной каталазной активностью. Высокую каталазную активность показали 10 % коллекционных штаммов B. japonicum и 12 % штаммов S. fredii, среднюю — 13 % штаммов B. japonicum и 15 % штаммов S. fredii. У 40 % штаммов ризобий сои обоих видов каталазная активность не проявилась. Среди ризобий B. japonicum преобладали штаммы с умеренной каталазной активностью (44 %о). Штаммы B. japonicum с повышенной каталазной активностью оказались устойчивыми к концентрации 8,5 г/л хлористого натрия в минерально-растительной среде и температуре выращивания +39...+40 °С. Устойчивость штаммов S. fredii к неблагоприятным факторам среды была выше по сравнению со штаммами B. japonicum и не зависела от каталазной активности.

Ключевые слова: клубеньковые бактерии сои, ризобии, Bradyrhizobium japonicum, Sinorhizobium fredii, виды, штаммы, каталаза, стрессоустойчивость, солеустойчивость, температурный шок.

Comparative evaluation of catalase activity and resistance to unfavorable environmental factors of strains of nodule bacteria Bradyrhizobium japonicum and Sinorhizobium fredii, selected in ARSRI of Soybean.

M.V. YAKIMENKO, S.A. BEGUN, A.I. SOROKINA (All-Russian Scientific Research Institute of Soybean, Blagoveshchensk).

Collection .strains of soybean nodule bacteria Bradyrhizobium japonicum (Jordan, 1982) and Sinorhizobium fredii (Scholia, Elkan, 1984) differ in stress tolerance (increased content of NaCl in the nutrient medium, increased growing temperature). It was established that the collection strains of B. japonicum and S. fredii have different catalase activity. 10 % of B. japonicum collection strains and 12 % of S. fredii strains showed high catalase activity, 13 %o of B. japonicum strains and 15 % of S. fredii strains showed an average catalase activity. In 40 % of soybean rhizobia strains of both species, catalase activity was not revealed. Among the rhizobia of B. japonicum, strains with moderate catalase activity (44 %) prevailed. The strains of B. japonicum with increased catalase activity were resistant to concentration of 8.5 g/l sodium chloride in the mineral-plant medium and to growing temperature +39...+40 °C. The resistance of S. fredii strains to unfavorable environmental factors was higher compared with the strains of B. japonicum and did not depend on catalase activity.

Key words: soybean nodule bacteria, rhizobia, Bradyrhizobium japonicum, Sinorhizobium fredii, species, strains, catalase, stress tolerance, salt tolerance, temperature shock.

*ЯКИМЕНКО Мария Владимировна - кандидат биологических наук, заведующая лабораторией, БЕГУН Степан Алексеевич - кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник, СОРОКИНА Арина Игоревна -кандидат ветеринарных наук, ведущий научный сотрудник (Всероссийский научно-исследовательский институт сои, Благовещенск). * E-mail: [email protected]

Введение

Особенностью почв южной сельскохозяйственной зоны Дальнего Востока России является широкое распространение в них клубеньковых бактерий сои родов Brady-rhizobium и Sinorhizobium, которые представляют важную составляющую биологических ресурсов.

Во Всероссийском научно-исследовательском институте сои (ВНИИ сои) в результате длительного поиска и отбора наиболее ценных по хозяйственно полезным свойствам штаммов из самых северных в мире природных популяций ризобий Восточно-Азиатского региона была создана уникальная коллекция чистых культур этих микроорганизмов. Большинство коллекционных штаммов выделено из почв Амурской области. Отдельные штаммы взяты из почв Еврейской автономной области, Хабаровского и Приморского краев, а также пограничных регионов Китая [10].

Детальное изучение культуральных, физиолого-биохимических и хозяйственно полезных свойств природных популяций ризобий (скорость роста, метаболическая активность, вирулентность, эффективность и др.) позволило выявить среди них два вида: медленнорастущий Bradyrhizobium japonicum (Jordan, 1982) и быстрорастущий Sinorhizobium fredii (Scholia, Elkan, 1984) [2]. В настоящее время лабораторная коллекция чистых культур ризобий насчитывает 103 штамма B. japonicum, 66 штаммов S. fredii и 101 штамм ризобий, выделенных из клубеньков других зернобобовых культур (арахис, люпин, вигна и др.).

Штаммы медленнорастущего вида в чашках Петри дают рост на 7-10-е и даже 20-е сут после посева. Они усваивают ограниченный набор источников углеродного питания с выделением продуктов метаболизма щелочного характера, обладают пониженной осмо-устойчивостью, резко замедляют рост на кислых и щелочных питательных средах. В оптимальных условиях этот вид ризобий доминирует при нодуляции растений сои, обладая высокой и устойчивой вирулентностью.

Штаммы быстрорастущего вида в чашках Петри дают рост на 2-4-е сут после посева, хорошо усваивают широкий спектр источников углеродного питания с выделением продуктов метаболизма кислотного характера. Большинство штаммов этого вида обладает высокой осмоустойчивостью. Выделяется группа штаммов S. fredii с различной степенью газообразования [9].

Известно, что координация сложных метаболических превращений, протекающих в различных органеллах бактериальной клетки, может быть нарушена под влиянием внешних воздействий, в том числе стрессов, что сопровождается повышением уровня активных форм кислорода [8], которые играют роль ингибиторов процесса азотфиксации [7]. В процессе эволюции микроорганизмы выработали механизмы защиты от стрессов, основанные на детоксикации активных форм кислорода с участием антиоксидантной системы, одним из компонентов которой является фермент каталаза [4, 5]. В связи с этим актуальным представляется изучение сравнительной характеристики каталазной активности коллекционных штаммов ризобий сои и их стрессоустойчивости. Это позволит выявить среди них наиболее приспособленные к изменениям внешней среды.

В качестве стрессовых факторов в таких исследованиях обычно используют повышение содержания соли (NaCl) в питательной среде и температурный шок при выращивании чистых культур [3, 6].

Цель исследований - изучение каталазной активности и стрессоустойчивости штаммов клубеньковых бактерий сои видов B. japonicum и S. fredii из коллекции ВНИИ сои.

Объекты и методы

Объектами исследований являются чистые культуры ризобий сои видов B. japonicum и S. fredii. Типовой штамм В-1967 для вида B. japonicum получен из коллекции

Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г. К. Скрябина (г. Пущино). Для X /гвёи взят штамм КНРб из коллекции Института сельского хозяйства КНР (г. Харбин).

При выращивании чистых культур ризобий использовали минерально-растительную среду следующего состава, г/л: К2НР04 - 0,5, КН2Р04 - 0,5, MgSO4 - 0,1, CaSO4 - 0,1, №С1 - 0,2, (№Н4)6 Мо7О24 - следы; манит - 20,0, соевая мука - 10,0, агар-агар - 20,0 [1]. Каждый штамм высевали в две пробирки, после чего пробирки термостатировали при оптимальной (+26...+28 °С) температуре в течение 10 сут.

Интенсивность роста штриха ризобий определяли по балльной шкале: 0 - нет роста, 1 - скудный, 2 - умеренный, 3 - хороший, 4 - обильный рост.

Солеустойчивость оценивали по интенсивности роста штриха ризобий на минерально-растительной среде с повышенным содержанием №С1 (8,5 г/л). Термоустойчивость изучали по интенсивности роста штриха ризобий после термостатирования пробирок с засеянной культурой при повышенной (+39...+40 °С) температуре в течение 10 сут. Ката-лазную активность определяли по интенсивности образования пузырьков кислорода при внесении в пробирки с культурой 1 мл 3%-й перекиси водорода. При этом использовался балльный метод оценки активности: высокая (+++), средняя (++), умеренная (+), ее отсутствие (-) [11]. Активность каталазы оценивали при комнатной температуре и после прогревания пробирки с чистой культурой при температуре 68 °С в течение 30 мин, что позволило выявить термолабильность фермента.

Результаты и обсуждение

Сравнительная оценка каталазной активности штаммов видов В. ]аротсиш и X /гвСИ приведена в табл. 1. Коллекционные штаммы обладают различной каталазной активностью и могут быть разбиты на 4 группы - с высокой, средней, умеренной и нулевой активностью. Штаммов с высокой и средней каталазной активностью среди ризобий обоих видов было практически равное количество. Высокой каталазной активностью обладали 10 % коллекционных штаммов В. ]аротсиш и 12 % штаммов & /гвёи, средней - 13 % штаммов В. ]аротсиш и 15 % штаммов Б./гвСИ. У 40 % штаммов ризобий сои изучаемых видов каталазная активность не проявилась. Среди ризобий В. ]аротсиш преобладали штаммы с умеренной каталазной активностью (44 %).

В целом коллекционные штаммы В. ]аротсиш показали более высокую ферментативную активность, чем штаммы Б./гвСИ.

Таблица 1

Общая характеристика коллекционных штаммов ризобий сои по каталазной активности

Активность штаммов В. ]аротсиш Б. А^вйИ Всего штаммов

Кол-во | % Кол-во | % Кол-во | %

Высокая Средняя Умеренная Нулевая Всего штаммов 10 10 8 12 18 11 14 13 10 15 24 14 45 44 15 23 60 35 34 33 33 50 67 40 103 100 66 100 169 100

Для исследований на стрессоустойчивость было отобрано по 14 штаммов каждого вида. На минерально-растительной среде без внесения №С1 штаммы обычно показывают обильный и хороший рост бактериальной массы на 10-е сут выращивания.

Высокоэффективные запатентованные штаммы В. ]аротсиш (639а, 648а, АС-17, СМ-42, БМ-85) обладают различной степенью каталазной активности (табл. 2). Запатентованные штаммы Б./ггёи (ББ-49, КБ-11, ББ-55, ТБ-508, ТБ-467, ТБ-643) имеют высокие и средние показатели каталазной активности (табл. 3).

У 99 % штаммов быстрорастущего вида X /ггёи каталазная активность сохраняется после прогревания пробирки с чистой культурой при температуре 68 °С в течение 30 мин, тогда как у штаммов вида В. ]аротсит с умеренной каталазной активностью после прогревания фермент каталаза дезактивируется.

При повышении концентрации поваренной соли в питательной среде до 8,5 г/л штаммы В. ]аротсит ТМ-444, БМ-91, 639а, 648а, АС-17, БМ-85, а также типовой штамм В-1967 показали скудный рост штриха бактериальной массы. Другие штаммы этого вида (ТА-40, ТА-125, СМ-42, СМ-47, ТМ-455, ТМ-464, ТМ-469) снизили интенсивность роста бактериальной массы до умеренного показателя (табл. 2).

Интенсивность роста штаммов с высокой и средней каталазной активностью (ТА-40, ТА-125, СМ-42, СМ-47, ТМ-455, ТМ-464, ТМ-469) на минерально-растительной среде с 8,5 г/л №С1 была выше, чем у штаммов с умеренной активностью.

При выращивании штаммов вида & /гвёи на среде с 8,5 г/л поваренной соли интенсивность роста бактериальной массы слабо изменялась в сравнении с показателями роста на среде без №С1 (табл. 3).

Таблица 2

Активность и термолабильность фермента каталаза и интенсивность роста штаммов B. japonicum на минерально-растительной среде при действии стрессовых факторов

Каталазная активность Интенсивность роста

Штамм при комн. после нагревания до ШС1, г/л Температурный шок °

температуре 68 °С

0,2 8,5 +26.. .+28 +39.. .+40

Запатентованные штаммы с высокой активностью каталазы

СМ-42 +++ + 3 2 3 1

Запатентованные штаммы с умеренной активностью каталазы

В-1967* + - 3 1 3 0

639а + - 3 1 3 0

648а + - 3 1 3 0

АС-17 + - 3 1 3 0

БМ-85 + - 3 1 3 0

Штаммы с высокой активностью каталазы

ТА-40 +++ ++ 3 2 3 1

СМ-47 +++ ++ 4 2 3 1

ТМ-455 +++ ++ 3 2 3 2

ТМ-464 +++ +++ 3 2 3 1

ТМ-469 +++ + 4 2 3 1

Штаммы со средней активностью каталазы

ТА-125 ++ + 4 3 4 3

Штаммы с умеренной активностью каталазы

ТМ-444 + - 3 1 3 0

БМ-91 + - 3 1 3 0

Типовой штамм.

По сравнению с интенсивностью роста бактериальной культуры вида В. ]аротсит интенсивность роста штаммов вида &. Зтейи на среде с 8,5 г/л №С1 была выше и не зависела от каталазной активности (табл. 3).

При оптимальной температуре выращивания ризобий исследуемые штаммы В. ]арот-сит давали хороший рост бактериальной массы. Исключение составил штамм ТА-125: он дал обильный рост штриха чистой культуры на 10-е сут выращивания. При повышении температуры термостатирования до +39...+40 °С прекратило свой рост 60 % изучаемых штаммов В. ]аротсит. Устойчивыми к высокой температуре оказались штаммы В. ]а-ротсит с повышенной каталазной активностью (ТА-40, ТА-125, СМ-42, СМ-47, ТМ-455, ТМ-464, ТМ-469).

Таблица 3

Активность и термолабильность фермента каталаза и интенсивность роста штаммов Я. /гвМ1 на минерально-растительной среде при действии стрессовых факторов

Каталазная активность Интенсивность роста

Штамм при комн. после нагревания до ШС1, г/л Температурный шок, °С

температуре 68 °С 0,2 8,5 +26.. .+28 +39.. .+40

Запатентованные штаммы с высокой активностью каталазы

КБ-11 +++ +++ 4 3 4 3

ББ-49 +++ +++ 4 3 4 2

ТБ-508 +++ + 3 3 3 3

Запатентованные штаммы со средней активностью каталазы

КНРб* ++ + 4 3 4 2

ТБ-467 ++ ++ 4 3 4 0

ББ-55 ++ + 4 3 4 4

ТБ-643 ++ ++ 4 4 4 4

Штаммы с высокой активностью каталазы

СБ-39 +++ +++ 4 3 3 2

ТБ-498 +++ + 4 3 3 4

ББ-90 +++ +++ 4 3 4 4

Штаммы со средней активностью каталазы

МБ-85 ++ ++ 4 3 4 0

Штаммы с умеренной активностью каталазы

065 + - 3 3 3 3

071 + + 4 4 4 3

ТБ-407 + + 4 3 4 4

Типовой штамм.

Коллекционные штаммы ризобий & /гвёи при оптимальной температуре давали обильный (71 %) и хороший (29 %) рост штриха чистой культуры. При повышении температуры выращивания до +39...+40 °С два штамма (МБ-85, ТБ-467) прекратили свой рост, пять штаммов (КНРб, КБ-11, ББ-49, СБ-39, 071) замедлили рост биомассы, штаммы ТБ-407, ТБ-508, ББ-90, 065, ББ-55, ТБ-643 дали одинаково хороший или обильный рост бактериальной массы. Штамм ТБ-498 рос интенсивнее при повышенной температуре.

Штаммы р"ейи с различной каталазной активностью более устойчивы к повышенной температуре, чем штаммы В. ]аротсыт.

Вывод

Таким образом, коллекционные штаммы В. ]аротсыт и &. /гвСИ обладали различной каталазной активностью. Высокую каталазную активность имели 10 % коллекционных штаммов В. ]аротсыт и 12 % штаммов &. /гвёи, среднюю - 13 % штаммов В. ]аротсыт и 15 % штаммов &. /гвСИ. У 40 % штаммов ризобий сои обоих видов каталазная активность не проявлялась. Среди ризобий В. ]аротсыт преобладали штаммы с умеренной каталазной активностью (44 %). Штаммы с повышенной каталазной активностью оказались устойчивыми к концентрации 8,5 г/л №С1 в минерально-растительной среде и температуре выращивания +39...+40 °С. Устойчивость штаммов &. /гвСИ к неблагоприятным факторам среды была выше по сравнению со штаммами В. ]аротсыт и не зависела от каталазной активности.

ЛИТЕРАТУРА

1. Бегун С.А. Способы, приемы изучения и отбора эффективных штаммов клубеньковых бактерий сои. Методы аналитической селекции: метод. рекомендации. Благовещенск: Зея, 2005. 70 с.

2. Бегун С.А., Сорокина А.И., Якименко М.В. Характеристика коллекционных штаммов ризобий по их ферментативной активности // Агр. наука. 2015. № 7. С. 16-18.

3. Воробьёв В.А. Симбиотическая азотфиксация и температура. Новосибирск: Наука, 1998. 126 с.

4. Глянько А.К., Акимова Г.П., Макарова Л.Е., Соколова М.Г., Васильева Г.Г. Окислительные процессы на начальных стадиях взаимодействия клубеньковых бактерий и гороха // Прикл. биохимия и микробиол. 2007. Т. 43, № 5. С. 576-582.

5. Гоголева О.А., Немцева Н.В., Бухарин О.В. Каталазная активность углеводородокисляющих бактерий // Прикл. биохимия и микробиол. 2012. Т. 48, № 6. С. 612-616.

6. Ибрагимова М.В., Румянцева М.Л., Онищук О.П., Белова В.С., Курчак О.Н., Андронов Е.Е., Дзюбен-ко Н.И., Симаров Б.В. Симбиоз клубеньковых бактерий Sinorhizobium meliloti с люцерной Medicago sativa в условиях засоления // Микробиология. 2006. Т. 75, № 1. С. 94-100.

7. Мишустин Е.Н., Шильникова В.К. Биологическая фиксация атмосферного азота. М.: Наука, 1968. 532 с.

8. Сытников Д.М., Кругова Е.Д., Мандровская Н.М. Влияние лектина сои на метаболизм и симбиотические свойства штаммов Bradyrhizobium japonicum // Бютехнолопя. 2011. Т. 4, № 6. С. 42-50.

9. Тильба В.А., Бегун С.А., Якименко М.В. Природные популяции ризобий сои и их использование в соевых агроценозах // Инновационная деятельность аграрной науки в Дальневосточном регионе. Владивосток: Дальнаука, 2011. С. 95-102.

10. Якименко М.В., Бегун С.А. Основные направления исследований дальневосточных природных популяций // Вестн. ДВО РАН. 2016. № 2. С. 45-49.

11. Takahashi S. Cell wall deficient forms of Mycobacteria // Kekkaku. 1979. N 7. P. 63.