CC BY
19
УДК 575.174.015 DOI 10.24411/2078-1318-2019-14060
Канд. биол. наук М.Г. СМАРАГДОВ
(ВНИИГРЖ, mik7252@yandex.ru)
СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА ГЕНЕТИЧЕСКИХ РАЗЛИЧИЙ ГОЛШТИНСКИХ
КОРОВ В СТАДАХ МЕТОДОМ ГЛАВНЫХ КОМПОНЕНТ И ИНДЕКСОМ
ФИКСАЦИИ С. РАЙТА
Значительная генетическая изменчивость является основой для выживания и сохранения популяций животных [1]. Генетическая вариация проявляется благодаря аллельной изменчивости и гетерозиготности по всему геному. Для селекции необходимо знать степень генетической вариации в стадах крупного рогатого скота и в популяции в целом. Молекулярные генетические данные способствуют отслеживанию генетического разнообразия в популяциях крупного рогатого скота и используются в геномной селекции [2]. Следует отметить, что знание генетического разнообразия также важно при консервации малочисленных пород животных и межпородном скрещивании [3, 4]. Для этой цели современные технологии позволяют использовать полиморфизм однонуклеотидных замен (SNP) [5].
В настоящее время существует несколько методов для определения генетического разнообразия в популяциях. К ним относится метод главных компонент (РСА) [6] и индекс фиксации С. Райта (Fst) [7]. В методе РСА рассчитывают собственные векторы, исходя из ковариационной матрицы генотипов животных. Они создают линейную комбинацию генотипов, которая эффективно дифференцирует выборки животных и при этом не требуется априорная информация. В сороковые годы ХХ века С. Райт предложил индекс фиксации Fst для измерения генетических различий между популяциями [7]. Этот метод оказался плодотворным для популяционной генетики. В нашем исследовании была использована статистика Хадсона [8]. Она не чувствительна к численности популяций, не переоценивает Fst и точна и стабильна при неслучайной выборке.
Цель исследования - провести сравнительный анализ генетических различий коров в стадах голштинизированного черно-пестрого скота Ленинградской области, измеренных Fst и РСА методами, и оценить мощность обоих методов.
Материалы, методы и объекты исследования. В исследовании генотипированы 372 коровы из 6 племенных заводов голштинизированного черно-пестрого скота Ленинградской области. В выборку входило 45 - 85 коров, что составило 8 - 15% от численности коров в стаде. Генотипирование коров осуществили чипом BovineSNP50 v.2.0 (Illumina Inc.) в Ирландии (Co. Kildare. Ireland). Контроль качества генотипированных коров был выполнен программным пакетом PLINK 1.9 [8]. При этом учитывали только аутосомы. В исходной выборке были удалены SNPs, отсутствующие в геноме коров не более 5% и с отклонением от распределения Харди-Вайнберга при P < 1.0E-03. В результате контроля качества количество SNPs составило 48101.
Вычисление Fst было выполнено программой EIGENSOFT 6.0.1 [9], в которой использована статистика Хадсона [7]. Стандартные ошибки значений Fst вычислены методом block-jackknife в программе EIGENSOFT 6.0.1. Для оценки достоверности значений Fst была проведена случайная перестановка генотипов коров в каждой из 30 пар стад и вычислены значения Fst, которые следует рассматривать как Н0 распределение, то есть распределение, удовлетворяющее Н0 гипотезе. Была использована команда -make-pheno и -fitler-mfiter 5 в PLINK для получения пяти случайных перестановок генотипов коров в каждой из 6 пар стад. Далее для каждой пары стад вычисляли 5 значений Fst и среднее значение Fst. Средние знчения рассматривались как удовлетворяющие Н0 распределению. Достоверность значений Fst рассчитывали с помощью одностороннего t - критерия Стьюдента. Мощность t - критерия вычисляли программой powerAnalysis в R программном обеспечении [10].
При анализе данных методом РСА использовали программу EIGENSOFT 6.0.1. Методом ANOVA были вычислены P-значения для 30 комбинаций из 6 пар стад и каждого собственного вектора (РС). Распределение P-значений ANOVA соответствовало х2 со степенью свободы число собственных векторов минус 1. Исходя из х2 распределения, были рассчитаны Р-значения для суммированных РС 1-10, РС 1- 20 и 100 собственных векторов. Для РС 1, РС 3 были рассчитаны средние значения стад вдоль каждого собственного вектора, и они представлены на рисунке при помощи R программного обеспечения [9]. Мощность РСА анализа для суммированных РС 1-100 вычисляли программой powerAnalysis в R программном обеспечении [10].
Результаты исследований. Данные Fst анализа представлены в табл. 1. Значения Fst для стада 4, как правило, имели наибольшие величины по сравнению со значениями Fst для других стад. Генетическое отличие коров из четвертого стада обусловлено использованием быков - производителей из Голландии, тогда как в других стадах быки - производители были преимущественно из США и Канады. Для стада 3 наблюдается тенденция меньших по сравнению с другими стадами (кроме пары стадо 3 и 4) значений Fst, что свидетельствует о генетической близости коров из этого стада с коровами из других стад. Важно отметить, что генетические различия между породами крупного рогатого скота, идентифицируемые индексом фиксации, как правило, более 0.01 [11]. Имея Н0 распределение Fst и экспериментально полученные значения Fst (табл. 1), можно с помощью t - критерия Стьюдента вычислить достоверность оценочных значений Fst. Результаты приведены в табл. 2. Суммируя результаты вычисления достоверности Fst данных, можно утверждать о высоком ее уровне.
Таблица 1. Оценка значений Fst для 6 стад коров
Стадо 1 2 3 4 5 6
1 0.005 0.005 0.006 0.006 0.004
2 0.0002 0.004 0.012 0.006 0.006
3 0.0003 0.0001 0.009 0.003 0.004
4 0.0004 0.0000 0.0001 0.009 0.004
5 0.0004 0.0002 0.0002 0.0001 0.005
6 0.0002 0.0002 0.0001 0.0001 0.0003
Fst данные расположены над диагональю. Fst данные для Но распределения расположены под диагональю
Таблица 2. Оценки достоверности генетических различий между стадами коров
(Р - значения)
Стадо_ Стадо PC 1 PC 3 Суммированы 10 собственных векторов Суммированы 20 собственных векторов Суммированы 100 собственных векторов Р-значения для Fst
1 2 0.0031 1.6E-05 4.2e-07 1.5e-11 3.0e-15 4.1e-49
1 3 0.0444 0.0017 0.0002 1.3e-09 9.8e-18 3.3e-47
1 4 0.0029 0.0598 5.6e-05 4.6e-07 2.8e-10 3.54e-32
1 5 0.8517 0.0007 0.0289 6.6e-11 7.2e-17 3.4e-40
1 6 0.6751 0.6948 0.0504 7.81e-05 1.0e-13 8.6e-25
2 3 0.1539 0.0798 3.34e-06 6.7e-06 2.0e-14 3.5e-29
2 4 1.0e-09 1.8e-08 6.52e-17 9.9e-21 3.3e-24 1.2e-54
2 5 0.0033 0.7395 0.0001 1.6e-06 3.3e-18 5.2e-59
2 6 0.0007 6.1E-06 8.58e-7 8.2e-10 2.2e-16 4.0e-58
3 4 1.0e-08 2.4e-06 6.19e-13 1.80e-16 1.5e-21 1.7e-51
3 5 0.0486 0.2529 0.0063 0.0019 2.9e-13 2.6e-26
3 6 0.0109 0.0006 0.0004 6.4e-06 5.0e-12 3.6e-40
4 5 0.0006 5.0e-06 2.48e-07 2.8e-11 8.2e-17 1.7e-51
4 6 0.0099 0.1422 0.0949 0.1570 2.8e-12 4.6e-23
5 6 0.5239 0.0003 0.0013 1.1e-05 5.1e-15 4.3e-29
Таблица 3. Генетическое сходство стад коров, выявленное РС 1 and РС 3
Стадо 1 2 3 4 5 6
1 + +
2 +
3 + +
4 +
5 + + +
6 + +
Таблица 4. Генетическое сходство стад коров, выявленное суммированием данных РС 1 - 10 аис! РС 1 - 20
Стадо 1 2 3 4 5 6
1 +
2
3
4 +
5
6 + +
+ - обозначает недостоверное различие между парами стад коров при Р > 0.05. Данные для РС 1 над диагональю и для РС 3 под диагональю
+ - обозначает над диагональю недостоверное различие между парами стад коров при Р > 0.05 для суммы данных РС 1-10, под диагональю между парами стад при Р > 1.0е-05 для суммы данных РС 1-20
РСА
0.05 0.04 0.03 0.02 0.01
0.00
0.01
Principal CofT(wncnt 1
Рис. Расположение средних значений для стад коров, выявленных PC 1 and PC 3
РСА анализ
Собственные значения для 100 векторов, вычисленные из ковариационной матрицы SNPs аллелей у 372 коров, монотонно уменьшались от 9.5 до нуля. Это свидетельствует о том, что структура ковариационной матрицы однородна без экстремальных ковариационных блоков аллелей.
Для статистического описания генетических различий между стадами были использованы Р-значения для каждой пары стад, полученные при вычислении средних значений для стад, вдоль РС 1 и РС 3. Взаимное расположение средних значений стад вдоль РС 1 и РС 3 представлено на рисунке. Для оценки достоверности генетических различий между 6 стадами РСА методом в табл. 3 представлены данные, полученные из табл. 2, для РС 1 при Р > 0.05. В ней недостоверные генетические различия для пар стад обозначены знаком (+). Среди 30 пар стад генетические различия для 5 пар стад были недостоверны: 1 и 5, 6; 2 и 3; 3 и 6; 5 и 6.
Такая же процедура была выполнена для РСА 3 (табл. 4). Среди всех 30 пар стад 6 сочетаний пар стад были недостоверны: 1 и 4, 6; 2 и 3, 5; 3 и 5; 4 и 6. Из данных в табл. 3 следует, что генетические различия между стадами, выявленные РС 1 и РС 3, различны. Так, для РС 3 пары 1 и 4; 2 и 5; 4 и 6 были недостоверны, тогда как для РС 1 они были достоверны. С другой стороны, пары 3 и 6; 5 и 6 были достоверны для РС 3, но недостоверны для РС 1. Таким образом, было бы некорректно делать выводы о генетических различиях между стадами, основываясь на отдельных собственных векторах.
Также был оценен уровень достоверности PCA метода при суммировании данных 10-ти собственных векторов. ^ответствующие P-значения приведены в табл. 2 и недостоверные сочетания пар стад, обозначенные (+) при P > 0.0S, приведены в табл. 4. Всего только две пары стад были недостоверными: 1 и б; 4 и б. Таким образом, использование десяти собственных векторов приводит к более достоверным данным. Для проверки изменения уровня достоверности при суммировании собственных векторов были вычислены P - значения при суммировании данных двадцати собственных векторов (табл. 4). Оказалось, что для отсекающего уровня достоверности P > 0.0S недостоверных пар стад не было. Для уровня достоверности P > 1.0е^ только пары стад 1 и б; S и б были недостоверны.
Подводя итог, следует заключить, что суммирование данных собственных векторов приводит к увеличению уровня достоверности генетических различий между стадами. Для включения всей вариансы PCA анализа необходимо вычислить P-значения при суммировании данных от 100 собственных векторов (табл. 2). Оказалось, что только пара стад 4 и б имели наименьший уровень достоверности P = 2.8e-12. Эта пара стад также имела наименьший уровень достоверности P = 4.6e-23 из Fst данных (табл. 2).
В табл. 2 приведены данные P- значений для всего парного набора стад, вычисленные PCA и Fst методами. В соответствии с этими данными для суммированных 100 собственных векторов P- значения были меньше, чем для PC 1, PC 3 и суммированных десяти и двадцати собственных векторов. Этот результат был следствием использования всей вариансы в случае 100 собственных векторов. Cравнение P - значений вычисленных PCA и Fst методами свидетельствует о том, что P - значения для Fst метода на много порядков меньше, чем P -значения для PCA метода. Мощность PCA анализа для всех 30 пар стад была 0.8 - 1.0, и для Fst анализа 0.9 - 1.0. Учитывая на несколько порядков меньшие P - значения для Fst метода по сравнению с PCA, можно утверждать, что Fst метод дает более достоверные результаты при той же мощности статистического анализа, как у PCA.
Выводы. Несмотря на генетическое сходство коров в стадах, Fst и PCA методы способны выявлять междустадные генетические различия. Но PCA метод, примененный к стадам коров, может быть эффективным только в том случае, если были использованы данные от нескольких собственных векторов. Полученные данные свидетельствуют о том, что индекс фиксации является более статистически мощным методом, чем PCA. Однако PCA метод может быть полезным благодаря визуализации различий коров в стадах в системе PC координат. Таким образом, именно метод индекса фиксации должен быть использован в начале исследований по выявлению генетических различий между стадами, популяциями и породами сельскохозяйственных животных.
Исследования выполнены в рамках Государственного задания Министерства науки и высшего образования России, тема № АААА-А18-118021590138-1.
Литература
1. Olson-Manning C.F., Wagner M.R., Mitchell-Olds T. Adaptive evolution: evaluating empirical support for theoretical predictions // Nature Review Genetics. - 2012. - V. 13. - P. 8б7-877.
2. Смарагдов М.Г. Геномная селекция молочного скота. Пять лет практического использования // Генетика. - 2013. - Т. 49. - № 11. - C. 12S1-1260.
3. de Cara M.A, Villanueva B, Toro M.A, Fernandez J. Using genomic tools to maintain diversity and fitness in conservation programmes // Molecular Ecology. - 2013. - V. 22. - P. 6091-6099.
4. Engelsma K.A, Veerkamp R.F, Calus M.P, Windig J.J. Consequences for diversity when animals are prioritized for conservation of the whole genome or of one specific allele // J. Anim. Breed. Genet. 2014. - V. 131(1). - P. 61-70.
5. Schaid D.J., Chen W., Larson N.B. From genome-wide associatioins to candidate causal variants by statistical fine - mapping // Nature Review Genetics. - 2018. - V. 19. - P. 491-S04.
6. Patterson N, Price A.L, Reich D. Population structure and eigenanalysis // PLoS Genetics. -
2006. - 2. e190.
7. Wright S. The genetical structure of populations//Annals of Eugenics. - 1949. - V. 15. - P. 323-354.
8. Hudson R.R., Slatkin M., Maddison W.P. Estimation of level of gene flow from DNA sequence data // Genetics. - 1992. - V. 132. - P. 583-589.
9. Pursell S, Neale B, Todd-Brown K, Thomas L, Ferreira M.A, Bender D, et al. PLINK: a tool set for whole genome association and population based linkage analyses // Am. J. Hum. Genet.
2007. - V. 81. - P. 559-575.
10.R Development Core Team R: a language and enviroment for statistical computing. R foundation for statistical computing. Viena. http://www.R-project.org
11.Smaragdov M G., Kudinov A. A., Uimari P. Assessing the genetic differentiation of Holstein cattle herds in the Leningrad region using Fst statistics // Agricultural and Food Science. - 2018. -V. 27. - P. 96-101.
Literatura
1. Olson-Manning C.F., Wagner M.R., Mitchell-Olds T. Adaptive evolution: evaluating empirical support for theoretical predictions // Nature Review Genetics. - 2012. - V. 13. - P. 867-877.
2. Smaragdov M.G. Genomnya selektia molochnogo skota. Pyat let prakticheskogo ispolzovanya // Genetika. - 2013. - T. 29. - № 11. - S. 1251-1260.
3. de Cara M.A, Villanueva B, Toro M.A, Fernandez J. Using genomic tools to maintain diversity and fitness in conservation programmes // Molecular Ecology. - 2013. - V. 22. - P. 6091-6099.
4. Engelsma K.A, Veerkamp R.F, Calus M.P, Windig J.J. Consequences for diversity when animals are prioritized for conservation of the whole genome or of one specific allele // J. Anim. Breed. Genet. 2014. - V. 131(1). - P. 61-70.
5. Schaid D.J., Chen W., Larson N. B. From genome-wide associatioins to candidate causal variants by statistical fine - mapping // Nature Review Genetics. - 2018. - V. 19. - P. 491-504.
6. Patterson N, Price A.L, Reich D. Population structure and eigenanalysis // PLoS Genetics. -
2006. - 2. e190.
7. Wright S. The genetical structure of populations // Annals of Eugenics. - 1949. - V. 15. - P.323-354.
8. Hudson R.R., Slatkin M., Maddison W.P. Estimation of level of gene flow from DNA sequence data // Genetics. - 1992. - V. 132. - P. 583-589.
9. Pursell S, Neale B, Todd-Brown K, Thomas L, Ferreira M.A, Bender D, et al. PLINK: a tool set for whole genome association and population based linkage analyses // Am. J. Hum. Genet.
2007. - V. 81. - P. 559-575.
10.R Development Core Team R: a language and enviroment for statistical computing. R foundation for statistical computing. Viena. http://www.R-project.org
11.Smaragdov M.G., Kudinov A. A., Uimari P. Assessing the genetic differentiation of Holstein cattle herds in the Leningrad region using Fst statistics // Agricultural and Food Science. - 2018. -V. 27. - P. 96-101.
