CC BY
5
Российский кардиологический журнал 2022;27(12):5281
doi:10.15829/1560-4071-2022-5281 https://russjcardiol.elpub.ru
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ISSN 1560-4071 (print) ISSN 2618-7620 (online)
Сравнительная оценка экспрессии ферментов пути синтеза церамидов de novo в жировой ткани сердца и сосудов пациентов с сердечно-сосудистыми заболеваниями
ГруздеваО. В.1,2, ДылеваЮ. А.1, БеликЕ. В.1, УчасоваЕ. Г.1, Стасев А. Н.1, Зинец М. Г.1, Барбараш О. Л.1,2
Понасенко А. В.1, Горбатовская Е. Е.1, ФанасковаЕ. В.1, Иванов С. В.1
Цель. Оценить в сравнительном аспекте экспрессию ферментов биосинтеза церамидов по пути de novo в жировой ткани (ЖТ) сердца и сосудов пациентов с ишемической болезнью сердца (ИБС) и приобретенными пороками сердца. Материал и методы. В исследование включено 20 пациентов с ИБС и 18 пациентов с аортальным стенозом/недостаточностью. Биоптаты подкожной, эпикардиальной, периваскулярной ЖТ (подкожная ЖТ (ПЖТ), эпикар-диальная ЖТ (ЭЖТ), периваскулярная ЖТ (ПВЖТ), соответственно) получены во время оперативного вмешательства. Методом количественной ПЦР оценена экспрессия генов ферментов синтеза церамидов de novo (серинпальмитоилтрансферазы субъединицы С1 и С2: SPTLC1, SPTLC2; церамидсинтазы 1-6: СERS1-6; дигидроцерамиддесатуразы: DEGS1). Статистический анализ результатов проводили в программе GraphPad Prism 8 (GraphPad Software).
Результаты. Пациенты с ИБС характеризовались более высоким уровнем мРНКSPTLC1 в ПЖТ и ЭЖТ, SPTLC2, СERS1, продуцирующей церамиды С18, СERS5 и СERS6, генерирующих церамиды С14-С16 в ЭЖТ, СERS2 — в ПЖТ, продуцирующей длинноцепочечные церамиды С20-С24, СERS4, синтезирующей очень длинноцепочечные церамиды С18-С20. В ПВЖТ выявлена высокая экспрессия СERS4 и СERS3, синтезирующей очень длинноцепочечные церамиды С26 и выше. Экспрессия DEGS1 была максимальной в ПЖТ и ЭЖТ У пациентов с пороками сердца отмечалась высокая экспрессия СERS3 в ПВЖТ, СERS4 в ЭЖТ и ПВЖТ, DEGS1 в ЭЖТ Уровень мРНК SPTLC1 в ПЖТ и ЭЖТ, SPTLC2 в ЭЖТ, СERS2 во всех исследуемых ЖТ, СERS4 и 5 в ЭЖТ, DEGS1 в ПЖТ и ЭЖТ среди пациентов с ИБС был выше, чем в группе сравнения.
Заключение. Региональные жировые депо сердца отличались по уровню экспрессии ферментов биосинтеза церамидов de novo. Полученные результаты свидетельствуют об активации синтеза церамидов по этому пути в ади-поцитах преимущественно эпикардиальной локализации при коронарогенной патологии, что может способствовать накоплению длинноцепочечных цера-мидов в ЖТ этой локализации.
Ключевые слова: церамиды, серинпальмитоилтрансфераза, церамидсинта-за, дигидроцерамиддесатураза, жировая ткань, ишемическая болезнь сердца.
Отношения и деятельность. Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда № 22-15-20007 "Церамидный профиль локальных жировых депо сердца: клинико-патогенетическое значение и терапевтический потенциал" https://rscf.ru/project/22-15-20007/ и средств Министерства науки и высшего образования Кузбасса.
1ФГБНУ Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердеч-
но-сосудистых заболеваний, Кемерово; 2ФГБОУ ВО Кемеровский государственный медицинский университет Минздрава России, Кемерово, Россия.
Груздева О. В.* — д.м.н., доцент, профессор РАН, зав. лабораторией исследований гомеостаза отдела экспериментальной медицины: ORCID: 0000-0002-7780-829X, Дылева Ю. А. — к.м.н., с.н.с. лаборатории исследований гомеостаза отдела экспериментальной медицины, ORCID: 0000-0002-6890-3287, Белик Е. В. — к.м.н., н.с. лаборатории исследований гомеостаза отдела экспериментальной медицины, ORCID: 0000-0003-3996-3325, Учасова Е. Г. — к.м.н., с.н.с. лаборатории исследований гомеостаза отдела экспериментальной медицины, ORCID:
0000-0003-4321-8977, Понасенко А. В. — к.м.н., зав. лабораторией геномной медицины отдела экспериментальной медицины, ORCID: 0000-0002-3002-2863, Горбатовская Е. Е. — лаборант-исследователь лаборатории исследований го-меостаза отдела экспериментальной медицины, ORCID: 0000-0002-0500-2449, Фанаскова Е. В. — к.м.н., зав. трансфузиологическим кабинетом, ORCID: 00000003-2705-3252, Иванов С. В. — д.м.н., в.н.с. лаборатории реконструктивной хирургии мультифокального атеросклероза, ORCID: 0000-0002-9070-5527, Стасев А. Н. — к.м.н., н.с. лаборатории пороков сердца, ORCID: 0000-0003-1341-204X, Зинец М. Г. — врач-кардиохирург отделения кардиохирургии, лаборатория рентгенэндоваскулярной и реконструктивной хирургии сердца и сосудов, ORCID: 0000-0002-4761-4080, Барбараш О. Л. — д.м.н., профессор, академик РАН, директор ФГБНУ ORCID: 0000-0002-4642-3610.
*Автор, ответственный за переписку (Corresponding author): [email protected]
ЖТ — жировая ткань, ИБС — ишемическая болезнь сердца, ИМ — инфаркт миокарда, ИМТ — индекс массы тела, мРНК — микро рибонуклеиновая кислота, ПВЖТ — периваскулярная жировая ткань, ПЖТ — подкожная жировая ткань, ПЦР — полимеразная цепная реакция, РНК — рибонуклеиновая кислота, ЭЖТ — эпикардиальная жировая ткань, СERS1-6 — гены церамидсинтазы
1-6, DEGS1 — ген дигидроцерамиддесатуразы 1, SPTLC1 — ген серинпальмитоилтрансферазы субъединицы С1, SPTLC2 — ген серинпальмитоилтрансфе-разы субъединицы С2.
Рукопись получена 08.11.2022 Рецензия получена 24.11.2022 Принята к публикации 28.11.2022
Для цитирования: Груздева О. В., Дылева Ю.А., Белик Е. В., Учасова Е. Г., Понасенко А. В., Горбатовская Е. Е., Фанаскова Е. В., Иванов С. В., Стасев А. Н., Зинец М. Г., Барбараш О. Л. Сравнительная оценка экспрессии ферментов пути синтеза церамидов de novo в жировой ткани сердца и сосудов пациентов с сердечно-сосудистыми заболеваниями. Российский кардиологический журнал. 2022;27(12):5281. doi:10.15829/1560-4071-2022-5281. EDN AVUPVQ
Comparative evaluation of the expression of enzymes of the ceramide de novo synthesis pathway in cardiac adipose tissue and blood vessels of cardiovascular patients
Gruzdeva O. V.1,2, Dyleva Yu. A.1, BelikE. V.1, UchasovaE. G.1, Ponasenko A. V.1, GorbatovskayaE. E.1, FanaskovaE. V.1, IvanovS. V.1, Stasev A. N.1, Zinets M. G.1, Barbarash O. L.1,2
Aim. To compare the expression of enzymes of the ceramide de novo synthesis pathway in cardiac adipose tissue (AT) and blood vessels of patients with coronary artery disease (CAD) and acquired heart defects.
Material and methods. The study included 20 patients with CAD and 18 patients with aortic stenosis/regurgitation. Biopsies of subcutaneous, epicardial,
perivascular AT (SCAT, EAT, PVAT, respectively) were obtained during surgery. Quantitative PCR test was used to evaluate the gene expression of de novo ceramide synthesis enzymes (serine palmitoyltransferase C1 and C2: SPTLC1, SPTLC2; ceramide synthase 1-6: CERS1-6; dihydroceramide desaturase: DEGS1). Statistical analysis was performed using GraphPad Prism 8 (GraphPad Software).
Results. Patients with CAD were characterized by a higher level of mRNA SPTLC1 in SCAT and EAT, SPTLC2, CERS1, producing C18 ceramides, CERS5 and CERS6, generating C14-C16 ceramides in EAT, CERS2 — in SCAT, producing long-chain ceramides C20-C24, CERS4, synthesizing very long-chain ceamides C18-C20. In PVAT a high expression of CERS4 and CERS3, which synthesizes very long-chain ceramides C26 and higher, was revealed. DEGS1 expression was highest in SCAT and EAT. In patients with heart defects, there was a high expression of CERS3 in PVAT CERS4 in EAT and PVAT, DEGS1 in EAT. The mRNA level of SPTLC1 in SCAT and EAT SPTLC2 in EAT, CERS2 in all studied AT, CERS4 and 5 in EAT, DEGS1 in SCAT and EAT among patients with CAD was higher than in the comparison group. Conclusion. Regional fat depots of the heart differed in the level of expression of enzymes of the ceramide de novo synthesis pathway. The results obtained indicate the activation of ceramide synthesis along this pathway in predominantly epicardial adipocytes in coronary pathology, which may contribute to the accumulation of long-chain ceramides in the AT of this localization.
Keywords: ceramides, serine palmitoyltransferase, ceramide synthase, dihydro-ceramide desaturase, adipose tissue, coronary heart disease.
Relationships and Activities. The study was carried out at the expense of the grant of the Russian Scientific Foundation No. 22-15-20007 "Ceramide profile of local fat depots of the heart: clinical and pathogenetic significance and therapeutic potential" https://rscf.ru/project/22-15-20007 / and funds of the Ministry of Science and Higher Education of Kuzbass.
Research Institute for Complex Issues of Cardiovascular Diseases, Kemerovo; 2Kemerovo State Medical University, Kemerovo, Russia.
Gruzdeva O. V.* ORCID: 0000-0002-7780-829X, Dyleva Yu. A. ORCID: 0000-00026890-3287, Belik E. V. ORCID: 0000-0003-3996-3325, Uchasova E. G. ORCID: 0000-0003-4321-8977, Ponasenko A.V. ORCID: 0000-0002-3002-2863, Gorba-tovskaya E. E. ORCID: 0000-0002-0500-2449, Fanaskova E. V. ORCID: 0000-00032705-3252, Ivanov S. V ORCID: 0000-0002-9070-5527, Stasev A. N. ORCID: 0000-0003-1341-204X, Zinets M. G. ORCID: 0000-0002-4761-4080, Barbarash O. L. ORCID: 0000-0002-4642-3610.
'Corresponding author: [email protected]
Received: 08.11.2022 Revision Received: 24.11.2022 Accepted: 28.11.2022
For citation: Gruzdeva O. V., Dyleva Yu. A., Belik E. V., Uchasova E. G., Ponasenko A. V, Gorbatovskaya E. E., Fanaskova E. V., Ivanov S.V., Stasev A. N., Zinets M. G., Bar-barash O. L. Comparative evaluation of the expression of enzymes of the ceramide de novo synthesis pathway in cardiac adipose tissue and blood vessels of cardiovascular patients. Russian Journal of Cardiology. 2022;27(12):5281. doi:10.15829/1560-4071-2022-5281. EDN AVUPVQ
Ключевые моменты
Key messages
В сравнительном аспекте оценена экспрессия ферментов биосинтеза церамидов по пути de novo в подкожной, эпикардиальной и пери-васкулярной жировой ткани пациентов с ише-мической болезнью сердца и приобретенными пороками сердца.
При коронарогенной патологии наблюдается активация биосинтеза церамидов de novo в ади-поцитах преимущественно эпикардиальной локализации, что может приводить к аккумуляции церамидов и запускать патологические процессы, ассоциированные с атеросклерозом.
Управление биосинтезом церамидов за счет ин-гибирования ферментов пути de novo — привлекательная терапевтическая стратегия для лечения сердечно-сосудистых патологий.
M
The expression of enzymes of the ceramide de novo synthesis pathway in subcutaneous, epicardial and perivascular adipose tissue of patients with coronary artery disease and acquired heart defects was compared.
In case of coronary pathology, activation of cera-mide de novo synthesis in predominantly epicar-dial adipocytes is observed, which can lead to the accumulation of ceramides and trigger pathological processes associated with atherosclerosis. Controlling ceramide biosynthesis by inhibiting de novo pathway enzymes is an potential therapeutic strategy for the treatment of cardiovascular pathologies.
Жировая ткань (ЖТ) является активным эндокринным органом, который ассоциирован с патофизиологией ишемической болезни сердца (ИБС) [1]. Особенно тесную связь с атерогенезом имеют эпи-кардиальный и периваскулярный компартменты ЖТ [2, 3]. В настоящее время широко признано, что эти компартменты чрезвычайно активны, продуцируют широкий спектр биологически активных веществ, среди которых церамиды (сфинголипиды) занимают особенное место. Церамиды являются не только важными структурными компонентами мембран клеток, но и выполняют роль вторичного мессен-джера (участвуют во внутриклеточной и межклеточ-
ной передаче сигналов), регулируют многие важные физиологические процессы: рост, дифференциров-ку, пролиферацию, миграцию, апоптоз клеток, активность киназ и фосфатаз, модулируют метаболизм глюкозы и липидов [4, 5]. За последние 20 лет интенсивные популяционные, когортные и экспериментальные, в т.ч. генетические, исследования убедительно продемонстрировали взаимосвязь церамидов и факторов сердечно-сосудистого риска (пол, возраст, артериальная гипертензия, курение, ожирение) [6-8]. В многочисленных исследованиях, носящих экспериментальный характер, показана роль цера-мидов в формировании атеросклеротических бляшек [9, 10]. Исследования липидома плазмы человека позволили выявить определенные виды церамидов, ко-
Таблица 1
Клиническая характеристика пациентов с ИБС и пороками сердца
Параметр Пациенты с ИБС, n=20 Пациенты с пороками, n=18 р
Мужчины, n (%) 12(60) 10 (55,6) 0,056
Возраст, лет 64,9 (47,8; 69,5) 59,3 (43,7; 621) 0,071
Индекс массы тела, кг/м2 26,4 (22,5; 30,2) 27,3 (23,4; 31,2) 0,062
Ожирение, n (%) 7 (35) 1 (5,6) 0,0001
Артериальная гипертензия, n (%) 11(55) 4(22,2) 0,002
Дислипидемия, n (%) 9 (45) 2(111) 0,001
Курение, n (%) 10(50) 3 (16,7) 0,0001
ИБС в анамнезе, n (%) 12(60) 7 (38,9) 0,038
ИМ в анамнезе, n (%) 14 (70) 0
ОНМК, n (%) 2 (10) 0
Атеросклероз других бассейнов, n (%) 3 (15) 0
Нет стенокардии, n (%) 1 (5) 18(100) 0,0001
Стенокардия I ФК, n (%) 0 0
Стенокардия II ФК, n (%) 9 (45) 0
Стенокардия III ФК, n (%) 10(50) 0
Стенокардия IV ФК, n (%) 0 0
ХСН I ФК, n (%) 8 (40) 4(22,2) 0,055
ХСН II ФК, n (%) 3 (15) 14 (778) 0,002
ХСН III ФК, n (%) 0 0 0,0002
ХСН IV ФК, n (%) 0 0
Атеросклероз одной КА, n (%) 3 (15) 0
Атеросклероз 2-х КА, n (%) 1 (5) 0
Атеросклероз 3-х и более КА, n (%) 16(80) 0
Фракция выброса, % 53,6 (46,3; 58,9) 51,6 (42,5; 55,8) 0,046
C-реактивный белок до операции, n (%) 2,68 (2,18; 3,29) 3,22 (2,65; 3,64) 0,211
Терапия в стационаре
Аспирин, n (%) 19(95) 0
Клопидогрель, n (%) 3 (15) 0
Варфарин, n (%) 0 15 (83,3)
ß-блокаторы, n (%) 18(90) 16 (88,9) 0,091
иАПФ, n (%) 15 (75) 14 (778) 0,247
Статины, n (%) 20(100) 13 (72,2) 0,059
Блокаторы Са-каналов, n (%) 15 (75) 13 (72,2) 0166
Нитраты, n (%) 1 (5) 2 (111) 0107
Диуретики, n (%) 16(80) 17 (84,4) 0,087
Сокращения: иАПФ — ингибиторы ангиотензинпревращающего фермента, ИБС — ишемическая болезнь сердца, ИМ — инфаркт миокарда, ОНМК — острое нарушения мозгового кровообращения, КА — коронарная артерия, ФК — функциональный класс, ХСН — хроническая сердечная недостаточность.
торые являются независимыми предикторами будущих фатальных и нефатальных сердечно-сосудистых событий [11, 12]. Вместе с тем должного внимания проблеме аккумуляции церамидов в ЖТ сердца и сосудов при ИБС и их роли в атерогенезе не уделялось. В то время как церамиды ЖТ посредством паракрин-ного высвобождения могут выступать в качестве ате-рогенных медиаторов.
Основным источником церамидов в адипоцитах является путь de novo [13]. Благодаря скоординированному действию ферментов (серинпальмитоил-трансферазы, 3-кетодигидросфингозинредуктазы, церамидсинтазы, дигидроцерамиддесатуразы) в ре-
зультате четырех последовательных реакций генерируется до 80% клеточных церамидов. Наличие 6 изоформ фермента церамидсинтазы (CerS1-CerS6), присоединяющей ацильную цепь жирной кислоты к каркасу сфинганина, обеспечивает большое видовое разнообразие церамидов [13]. Так CerS1, CerS5 и CerS6 присоединяют жирные кислоты с более короткой длиной углеводородной цепи (04-08) к сфинганину, в то время как CerS2, CerS3 и CerS4 добавляют более длинноцепочечные жирные кислоты (08^26 и более). Дисбаланс CerS в клетке будет приводить к увеличению определенных церамидов, нарушая гомеостаз клетки [14], однако механизмы
нарушения соотношений и значения этих соотношений до конца не изучены, необходимы дополнительные исследования.
На сегодняшний день недостаточно и данных, касающихся особенности экспрессии ферментов пути de novo в ЖТ, в особенности сердечной локализации. Работы носят в основном экспериментальный характер, и результаты зачастую противоречивы [5, 8, 15, 16]. Между тем, изменение активности ферментов синтеза в ЖТ сердца может приводить к избыточному синтезу и накоплению церамидов не только в ЖТ, но и в кардиомиоцитах. Избыточная аккумуляция церамидов, в свою очередь, может индуцировать целый ряд патологических процессов, ассоциированных с атерогенезом [17].
В связи с этим, целью исследования явилось оценить в сравнительном аспекте экспрессию ферментов биосинтеза церамидов по пути de novo в ЖТ сердца и сосудов пациентов с ИБС и приобретенными пороками сердца.
Материалы и методы
В исследование включено 38 пациентов, среди которых было 20 пациентов с ИБС (основная группа). Группу сравнения составили 18 пациентов с некоро-нарогенными патологиями сердца — дегенеративные приобретенные неревматические пороки сердца (аортальный стеноз/недостаточность) и показаниями для проведения открытой операции на клапанах сердца, сопоставимых по полу и возрасту с основной группой. Все пациенты имели показания для проведения открытого вмешательства на сердце — прямой реваскуляризации миокарда методом коронарного шунтирования или операции на клапанах сердца.
Критериями включения явились возраст пациента до 75 лет; согласие пациента на исследование. Критерии исключения: возраст пациента >75 лет; наличие сахарного диабета 1 и 2 типа в анамнезе и/ или выявленного при обследовании в период госпитализации; инфаркт миокарда (ИМ); клинически значимые сопутствующие заболевания (анемия, почечная и печеночная недостаточность, онкологические и инфекционно-воспалительные заболевания в период обострения, аутоиммунные заболевания); отказ пациента от проведения исследования.
Клинико-анамнестическая характеристика представлена таблице 1. Критерии включения для пациентов группы сравнения: верифицированный приобретенный порок сердца, согласие на проведения исследования.
Среди пациентов с ИБС преобладали лица мужского пола (60%), средний возраст которых составил 64,9 (47,8; 69,5) лет, индекс массы тела (ИМТ) — 26,4 (22,5; 30,2) кг/м2 (табл. 1). В анамнезе чаще фиксировались артериальная гипертензия, курение, стенокардия, отягощенная наследственность по сер-
Таблица 2 Праймеры, используемые для оценки генной экспрессии ферментов синтеза церамидов
Ген Направленность Sequence (5'^3') Длина праймера
SPTLC1 Forward pr mer aggaagcggctaactatggc 20
Reverse pr mer ccagaggatcagaatcccttcc 22
SPTLC2 Forward pr mer cgcctgaaagagatgggcttc 21
Reverse pr mer ccgatgttccgcttcagcat 20
CERS1 Forward pr mer gcgtttgcagccaaggtgtt 20
Reverse pr mer ttcaccaggccgttcctcag 20
CERS2 Forward pr mer ggacgtgtctacgccaaagc 20
Reverse pr mer atgttcaagagggcagccagt 21
CERS3 Forward pr mer ctcgcacagatggtgtcctg 20
Reverse pr mer cctgatgggatgttgcttcctg 22
CERS4 Forward pr mer caggacttgttggcagccct 20
Reverse pr mer cgttgggcttcacttgcctc 20
CERS5 Forward pr mer ctcaatggcctgctgctgac 20
Reverse pr mer tgctctccacatcactgcga 20
CERS6 Forward pr mer cggacctgaagaacacggagga 22
Reverse pr mer atggcgcacggtttggctac 20
DEGS1 Forward pr mer ccactgagctggagtttcct 20
Reverse pr mer caggaattgtagtgagggaggt 22
Сокращения: SPTLC1 — ген серинпальмитоилтрансферазы субъединицы С1, SPTLC2 — ген серинпальмитоилтрансферазы субъединицы С2, CERS1-6 — гены церамидсинтазы 1-6, DEGS1 — ген дигидроцерамиддесатуразы 1.
дечно-сосудистой патологии. У 14 (70%) пациентов в анамнезе был ИМ, у 2 (10%) человек — инсульт. Пациенты с приобретенными пороками сердца были сопоставимы по полу, возрасту и ИМТ с основной группой. Средний возраст пациентов составил 59,3 (43,7; 62,1) лет. Пациенты с пороками сердца чаще страдали хронической сердечной недостаточностью II-III функционального класса и имели сниженную фракцию выброса в сравнении с группой ИБС.
В течение госпитального периода все пациенты получали стандартную медикаментозную терапию в соответствии с рекомендациями Министерства Здравоохранения РФ (2020) и Европейского общества кардиологов (2020), включая гепарин, клопидогрел, аспирин, ингибиторы ангиотензинпревращающего фермента, ß-адреноблокаторы, блокаторы кальциевых каналов, нитраты, ингибиторы ГМГ-КоА-редуктазы (статины). Пациенты с пороками сердца получали варфарин, ß-адреноблокаторы, ингибиторы ангиотен-зинпревращающего фермента, ингибиторы ГМГ-КоА-редуктазы (статины), антагонисты Са (дигидропири-диновые), нитраты, диуретики.
Биоптаты ЖТ подкожной, эпикардиальной и пе-риваскулярной локализации (3-5 г) были получены у пациентов во время оперативного вмешательства (коронарного шунтирования или коррекции пороков сердца). Источник подкожной ЖТ (ПЖТ) — подкожная клетчатка нижнего угла средостенной раны, эпикардиальной ЖТ (ЭЖТ) — зоны ее наибольшего
Таблица 3
Экспрессия генов основных ферментов синтеза церамидов пути de novo в ЖТ сердца различной локализации пациентов с сердечно-сосудистыми заболеваниями
Параметры Ишемическая болезнь сердца, n=20 Приобретенные пороки сердца, n=18 рт
ПЖТ ЭЖТ ПВЖТ ПЖТ ЭЖТ ПВЖТ
1 2 3 4 5 6
SPTLC1, 7,40 6,45 3,32 3,49 3,75 3,45 рт14=0,00003
ACt (6,03; 13,37) (2,89; 9,12) (1,58; 5,16) (2,26; 5,01) (2,82; 5,17) (312; 5,37) рт2,5=0,0022
рк=0,012/рт1,з=0,0002/рт2,3=0,010 рк=0,061
SPTLC2, 0,32 0,58 0,23 018 016 018 рт2,5=0,039
ACt (0,21; 0,47) (0,36; 0,72) (015; 0,39) (0,09; 0,31) (0,08; 0,27) (0,10; 0,34)
рк=0,015/рт1,2=0,012/рт2,э=0,013 рк=0,071
DEGS1, 0,49 2,26 0,91 0,27 0,51 0,28 рт1,4=0,029
ACt (0,29; 0,62) (1,92; 2,55) (0,72; 1,32) (0,11; 0,46) (0,30; 1,22) (0,14; 0,41) рт2,5=0,035
Рк=0,014/Рт1,3=0,010/Рт2,3=0,012 рк=0,017/рт1,2=0,014/рт2,3=0,011 рт3,6=0,030
Сокращения: ПВЖТ — периваскулярная жировая ткань, ПЖТ — подкожная жировая ткань, ЭЖТ — эпикардиальная жировая ткань, рк — уровень статистической значимости при сравнении трех групп методом Kruskal-Wallis, рт — уровень статистической значимости при сравнении двух групп методом Mann-Whitney, SPTLC1 — ген серинпальмитоилтрансферазы субъединицы С1, SPTLC2 — ген серинпальмитоилтрансферазы субъединицы С2, DEGS1 — ген дигидроцерамид-десатуразы 1.
присутствия — правые отделы сердца (правое предсердие и правый желудочек), периваскулярной ЖТ (ПВЖТ) — из области правой коронарной артерии. Образцы ЖТ подвергались криогенной заморозке жидким азотом с последующим хранением при температуре -150° С.
Экспрессия генов ферментов синтеза церамидов пути de novo
Выделение и синтез нуклеиновых кислот. Выделение рибонуклеиновой кислоты (РНК) из ЖТ проводили с помощью набора Fatty Tissue RNA Purification Kit (Norgen Biotek Corp., Канада), основным преимуществом которого является быстрое выделение и высокая степень очистки тотальной РНК из тканей с высоким содержанием липидов. Количество и чистоту выделенной РНК определяли на спектрофотометре NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, США). Для проведения обратной транскрипции и синтеза комплементарной ДНК на основе образцов РНК использовали реагенты High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor (AB, США) и хранили при -20° C в течение 2 дней до момента постановки по-лимеразной цепной реакции (ПЦР).
Оценка генной экспрессии. Для измерения экспрессии генов ферментов синтеза церамидов пути de novo использовался метод количественной ПЦР с праймерами, синтезированными ЗАО "Евроген" (г. Москва, Россия), на амплификаторе ViiA 7 (Applied Biosystems, США). Структура праймеров представлена в таблице 2.
Для проведения ПЦР с интеркалирующим красителем SYBR Green использовали реакционную смесь мастер-микс БиоМастер UDG HS-qPCR Lo-ROX SYBR (2x) (ООО "Биолабмикс", Россия) согласно протоколу производителя. Количественная ПЦР
осуществлялась с помощью амплификатора CFX-96 Rial-Time System (Bio-Rad, США). Для расчета относительной величины экспрессии использовали метод ACT (вариант метода Ливака), основанный на определении разницы между значениями CT рефе-ренсных генов и целевых значений CT для каждого образца. Нормирование результатов ПЦР проводилось с помощью референсных генов ACTB (ß-актин), GAPDH (глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа), B2M (бета-2-микроглобулин).
Статистический анализ
Статистический анализ полученных результатов проводили в программе GraphPad Prism 8 (GraphPad Software). Данные представлены в виде медианы, 25-го и 75-го процентилей. Для анализа межгрупповых различий использовали непараметрические критерии. Сравнение 3 независимых групп проводили с использованием критерия Краскела-Уоллиса с последующим попарным сравнением с применением U-критерия Манна-Уитни. Сравнение 2 независимых групп проводили с использованием U-критерия Манна-Уитни. Категориальные переменные, выраженные в процентах, сравнивали с использованием критерия хи-квадрат или точного критерия Фишера. Значения р<0,05 считались статистически значимыми.
Результаты
Для получения информации об особенности экспрессии генов ферментов пути синтеза церами-дов de novo в ЖТ были оценены уровни микро-РНК (мРНК) генов ферментов SPT, CERS и DEGS1 с использованием количественной ПЦР в реальном времени. С учетом того, что SPT состоит как минимум из двух субъединиц, был оценен уровень экспрессии мРНК SPTLC1 и мРНК SPTLC2.
СБЯ81
СБЯ82
СБЯ83
СБЯ85
пжт эжт эжт
О ИБС □ Пороки
СБЯ$4
56.0 4В,0 40,0 32,0 24,0 16,0
в,о
СБЯ8б 0,01 л 0,06 0,05
; о,о4
*
0,03 0,02 0,01
ПЖТ пжт эжт эжт пвжт пвжт О ИБС □ Пороки
0.010
Рис. 1. Экспрессия Сокращения: ИБС
пжт пжт эжт эжт пвжт пвжт
□ ИБС □ Пороки
генов церамидсинтаз в ЖТ сердца различной локализации пациентов с сердечно-сосудистыми заболеваниями.
— ишемическая болезнь сердца, ПВЖТ — периваскулярная жировая ткань, ПЖТ — подкожная жировая ткань, ЭЖТ — эпикардиальная жиро-
вая ткань.
Среди пациентов с ИБС обнаружена более высокая экспрессия субъединицы С1 в образцах ПЖТ и ЭЖТ в сравнении с ЖТ периваскулярной локализации (р=0,0002, р=0,010, соответственно). В отличие от субъединицы С1, уровень экспрессии субъединицы С2 был выше только в образцах ЭЖТ в сравнении с ПЖТ и ПВЖТ (р=0,012, р=0,013, соответственно) (табл. 3).
Генная экспрессия церамидсинтаз в ЖТ пациентов с ИБС имела тканевые особенности. ПЖТ характеризовалась максимальной экспрессией гена СЕЯБ2, продуцирующей длинноцепочечные цера-миды С20-С24 (рис. 1), ЭЖТ - экспрессией СЕКБ1, продуцирующей церамиды С18 и высоким уровнем мРНК СЕЯБ5, СЕЯБ5 и СЕЯБб, генерирующих церамиды С14-С16. В ПВЖТ, аналогично ЭЖТ, выявлена
максимальная экспрессия СERS4, а также СERS3, отвечающих за синтез очень длинноцепочечных цера-мидов С18-С20 и С26, соответственно.
Уровень мРНК DEGS1, фермента завершающей стадии синтеза церамидов, был максимальным в образцах эпикардиальной и периваскулярной ЖТ в сравнении с ПЖТ (р=0,010, р=0,012, соответственно).
В группе пациентов с пороками сердца образцы ЖТ не отличались по уровню мРНК SPTLC1, SPTLC2 и СERS1, 2, 5 и 6, в то время как отмечалась высокая экспрессия СERS3 в периваскулярных ади-поцитах (р=0,004) и СERS4 в ЭЖТ (р=0,011) и ПВЖТ (р=0,024) (рис. 1). Генная экспрессия DEGS1 в образцах ЭЖТ была максимальной в сравнении с подкожными и периваскулярными адипоцитами (р=0,014 и р=0,011, соответственно) (табл. 3).
Оценка межнозологических различий в экспрессии генов ферментов пути синтеза церамидов de novo в ЖТ показала, что пациенты с ИБС, в отличие от пациентов с пороками сердца, характеризовались более высокой экспрессией SPTLC1 в ЖТ подкожной и эпикардиальной локализации (р=0,00003, р=0,0022, соответственно), SPTLC2 в образцах ЭЖТ (р=0,039) (табл. 3). Среди пациентов с ИБС также отмечалась более высокая экспрессия СERS2 в образцах всех исследуемых тканей (ПЖТ, р=0,0001, ЭЖТ, р=0,003, ПВЖТ, р=0,0013), СERS4 и 5 в эпи-кардиальных адипоцитах (р=0,022, р=0,017) (рис. 1). Генная экспрессия СERS6 не имела межгрупповых различий. Уровень мРНК DEGS1 среди пациентов с ИБС был выше в адипоцитах независимо от локализации (в ПЖТ, р=0,029; ЭЖТ, р=0,035; в ПВЖТ, р=0,030) (табл. 3).
Таким образом, региональные жировые депо сердца отличались по уровню экспрессии ферментов биосинтеза церамидов de novo. Полученные результаты свидетельствуют об активации синтеза церами-дов по пути de novo в адипоцитах преимущественно эпикардиальной локализации при коронарогенной патологии, что может способствовать накоплению длинноцепочечных церамидов в ЖТ этой локализации.
Обсуждение
Экспериментальные и клинические исследования показали связь между церамидами и развитием атеросклероза [17]. Особый интерес вызывает накопление церамидов в жировых депо сердца и сосудов, поскольку ЭЖТ и ПВЖТ локализованы в непосредственной близости к очагу атеросклеротического поражения. Первым этапом исследования явилась оценка экспрессии гена ключевого фермента синтеза церамидов de novo серинпальмитоилтрансфе-разы в ЖТ подкожной и сердечной локализации. Установлено, что у пациентов с ИБС в ЭЖТ экспрессия SPTLC1 и SPTLC2 превышала аналогичные
показатели в группе пороков сердца. Максимальные значения мРНК SPTLC1 также наблюдались в группе пациентов с ИБС. Можно предположить, что при ИБС усиление экспрессии SPT, ключевого фермента пути синтеза церамидов de novo в адипоцитах ПЖТ и ЭЖТ могло быть обусловлено наличием избыточной массы тела у обследованных пациентов. Ранее проведенные клинические исследования подтверждают такую точку зрения. Так, Btachnio-Zabielska AU, et al. (2012) продемонстрировали значительное увеличение мРНК обеих субъединиц SPT (SPTLC1 и SPTLC2) в образцах ПЖТ брюшной полости у лиц с ожирением (ИМТ >30) по сравнению с контрольной группой без ожирения (ИМТ <25). Активность фермента, оцененная с использованием радиоактивно меченного субстрата, [3И]-Ь-серина (Moravek Bio-chemicals), также была повышена [18]. Однако следует принять во внимание отсутствие различий по ИМТ с группой пациентов с пороками сердца, которые имели более низкие значения экспрессии гена SPTLC1. С другой стороны, ишемия/гипоксия миокарда, обусловленная атеросклерозом коронарных артерий, могла также спровоцировать усиление экспрессии SPT в адипоцитах. Экспериментально показано, что адаптация к хронической гипоксии регулируется дифференциальным транскрипционным профилем, включающим активацию экспрессии SPT, направленным на метаболическое перепрограммирование клетки. Синтез церамидов с участием жирных кислот поначалу может носить приспособительный характер, однако по мере накопления цера-мидов в клетке наблюдается замедление ключевых клеточных и физиологических процессов, напротив, активируется запрограммированная гибель клетки. Важным аспектом также является индуцированное гипоксией усиление провоспалительной активности ЖТ. Считается, что гипоксия, развивающаяся в областях ЖТ, приводит к выработке адипоцитами про-воспалительного фактора некроза опухоли, который, в свою очередь, усиливает экспрессию SPT [19].
Следующим этапом анализа явилась оценка профиля экспрессии генов CERS1-6, кодирующих ферменты церамидсинтазы, со специфической субстратной специфичностью по отношению к жирным кислотам с разной длиной цепи. У млекопитающих длина ацильной цепи церамида колеблется от средней (12-14С), длинной (16-20С), очень длинной (22-26С) до сверхдлинной (>26С) цепи жирных кислот. Экспериментально показано, что активирование/ блокировка церамидсинтаз может иметь широкий спектр функциональных и тканеспецифических эффектов [20]. Результаты настоящего исследования свидетельствуют о том, что в ЖТ подкожной, эпикардиальной и периваскулярной локализации экспрессируются все 6 ферментов церамидсинтаз независимо от наличия коронарогенной или неко-
ронарогенной нозологии. Экспрессия гена CERS4 и CERS2 была максимальной, а CERS6 самой минимальной (независимо от локализации ЖТ). Наличие коронарогенной патологии (ИБС) сопровождалось наиболее высокими значениями экспрессии CERS2 в ПЖТ, ЭЖТ, ПВЖТ, CERS4 и 5 в ЭЖТ. Имеющиеся на сегодняшний день данные экспериментальных и клинических исследований не позволяют однозначно трактовать полученные результаты. Так, отсутствует однозначное мнение о протективной или негативной роли изученных нами церамидсинтаз. Согласно данным Kim YR, et al. (2019), ингибиро-вание экспрессии CERS4 улучшает метаболический профиль печени у мышей [21]. С другой стороны, CERS4 может генерировать С20 и С22 церамиды, обладающие защитной функцией при развитии сердечной недостаточности [22]. CERS2 синтезирует церамиды с длиной цепи С22-С24. Отличительной особенностью гена CERS2 является его организация, характерная для гена "домашнего хозяйства" и расположение в хромосомных областях, которые реплицируются на ранних стадиях клеточного цикла [23]. В физиологии клеток, в т.ч. адипоцитов, CERS2 имеет ключевое значение, поскольку нокдаун CERS2 приводит к нарушению цитокинеза [24]. Гомозиготные мыши с нокаутом CERS2 отличались высокой восприимчивостью к дезадаптивным метаболическим нарушениям при диете, вызывающей ожирение. Следует отметить, что сверхэкспрессия CERS2 была защитной при стрессовой реакции эндо-плазматического ретикулума, индуцированной паль-митатом, предположительно потому, что она предотвращала индукцию CERS6, приводящую к усилению липогенеза в печени [21]. Другие исследования свидетельствуют о негативной роли CERS2. Так, избыточная экспрессия CERS2 (и накопление церамидов C20-C24) вызывает окислительный стресс и мито-хондриальную дисфункцию посредством липидной перегрузки, что в конечном итоге приводит к апоп-тозу кардиомиоцитов [25]. Некоторые авторы полагают, что CERS2-зависимое повреждение митохондрий клеток может являться объединяющим другие патологические состояния — инсулинорезистент-ность, окислительный стресс, усиление аутофагии и митофагии — патофизиологическим механизмом, приводящим в конечном итоге к гибели кардиомио-цитов. Показано также, что CERS2 синергично усиливает экспрессию CERS5, для которой однозначно показано участие в индукции окислительного стресса и апотоза [25]. Мыши с нулевым CERS5 жизнеспособны, фертильны, не имеют каких-либо очевидных морфологических и фенотипических изменений при нормальном питании [26]. Однако при диете с высоким содержанием жиров потеря CERS5 была ассоци-
ирована со снижением прибавки в весе, улучшением общего состояния, уменьшением воспалительной активации белой ЖТ и снижением уровня лептина по сравнению с животными дикого типа [26].
Завершающим этапом работы была оценка экспрессии гена десатуразы, заключительного фермента пути de novo. Последняя стадия пути de novo считается не менее важной, поскольку именно церамиды, а не дигидроцерамиды, являются конечными продуктами, которые обладают разными профилями метаболической и клеточной активности. Результаты проведенного исследования свидетельствуют о более высоком уровне мРНК DEGS1 в ЭЖТ у пациентов с ИБС. Ранее проведенные исследования не обнаружили подобных различий, более того, отмечена более высокая экспрессия DEGS1 в образцах ЖТ подкожных адипоцитов по сравнению с адипоцитами медиастинального депо у пациентов с избыточной массой тела (ИМТ 29,4±4,9 кг/м2, n=10), направленных на плановую операцию на аортальном клапане и/или на восходящей грудной аорте [27]. Обращает на себя внимание тот факт, что у пациентов с ИБС значения уровня мРНК DEGS1 в ПЖТ были существенно меньше, чем значения мРНК первого фермента пути de novo SPT. Напротив, значения мРНК DEGS1 в ЭЖТ были сопоставимы с экспрессией фермента SPT. Возможным объяснением избыточной экспрессии десатуразы в ЭЖТ является нивелирование патологических эффектов гипоксии, некоторые исследователи рассматривают DES1 в качестве клеточных сенсоров кислорода [28].
Заключение
Таким образом, ЖТ сердца при коронарогенной патологии характеризуются активацией синтеза це-рамидов по пути de novo, преимущественно в эпикар-диальной локализации, что может приводить к аккумуляции церамидов, потенцируя многие патологические процессы, ассоциированные с атеросклерозом. Управление биосинтезом церамидов за счет ингиби-рования ферментов пути de novo является привлекательной терапевтической стратегией по снижению уровня церамидов не только в плазме, но и в периферических тканях, в т.ч. в сердце и сосудах, и имеет огромные перспективы для лечения широкого спектра сердечно-сосудистых патологий.
Отношения и деятельность. Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда № 22-15-20007 "Церамидный профиль локальных жировых депо сердца: клинико-патогенетическое значение и терапевтический потенциал" https://rscf.ru/ project/22-15-20007/ и средств Министерства науки и высшего образования Кузбасса.
Литература/References
1. lacobellis G. Epicardial adipose tissue in conternporary cardiology. Nat Rev Cardiol. 2022;19(9):593-606. doi:101038/s41569-022-00679-9.
2. Brel NK, Gruzdeva OV, Kotov AN, et al. Relationship of coronary calcinosis and local fat deposts in patients with coronary artery disease. Cornplex Issues of Cardiovascular Diseases. 2022;11(3):51-63. (In Russ.) Брель Н. К., Груздева О. В., Коков А. Н. и др. Взаимосвязь кальциноза коронарных артерий и локальных жировых депо у пациентов с ишемической болезнью сердца. Комплексные проблемы сердечно-сосудистых заболеваний. 2022;11(3):51-63. doi:1017802/2306-1278-2022-11-3-51-6.
3. Gruzdeva OV, Dyleva YA, BeM EV, et al. Relationship between Epicardial and Coronary Adipose Tissue and the Expression of Adiponectin, Leptin, and InterleuHn 6 in Patients with Coronary Artery Disease. J Pers Med. 2022;12(2):129. doi:10.3390/jpm12020129.
4. Chatharn JC, Young ME. Metabolic rernodeling in the hypertrophic heart: fuel for thought. Circ. Res. 2012;111:666-8. doi:10.1161/circresaha.112.277392.
5. Surnrners SA, Chaurasia B, Holland WL. Metabolic Messengers: Cerarnides. Nat. Metab. 2019;1(11):1051-8. doi:101038/s42255-019-0134-8.
6. Mie^e MM, Bandaru VV, Han D, et al. Factors affecting longitudinal trajectories of plasrna sphingornyelins: the Baltirnore Longitudinal Study of Aging. Aging Cell. 2015;14(1):112-21. doi:101111/acel12275.
7. MiddleRauff HR, Williarn KJ, Su B, et al. Changes in lipid cornposition associated with electronic cigarette use. J Transl Med. 2020;18:379. doi:10.1186/s12967-020-02557-9.
8. Turpin SM, Nicholls HT, Willrnes DM, et al. Obesity-induced CerS6-dependent C16:0 cerarnide production prornotes weight gain and glucose intolerance. Cell Metab. 2014;20(4):678-86. doi:101016/j.crnet.2014.08.002.
9. Chathoth S, Isrnail MH, Algharndi HM, et al. Insulin resistance induced by de novo pathway-generated C16-cerarnide is associated with type 2 diabetes in an obese population. Lipids Health Dis. 2022;21:24. doi:101186/s12944-022-01634-w.
10. Pa^ TS, Rosebury W, Kindt EK, et al. Serine palrnitoyltransferase inhibitor rnyriocin induces the regression of atherosclerotic plaques in hyperlipidernic ApoE-deficient rnice. Pharrnacol Res. 2008;58(1):45-51. doi:101016/j.phrs.2008.06.005.
11. McGurk KA, Keavney BD, Nicolaou A, et al. Circulating cerarnides as biorna^ers of cardiovascular disease: Evidence frorn phenotypic and genornic studies. Atherosclerosis. 2021;327:18-30. doi:10.1016/j.atherosclerosis.2021.04.021.
12. Mantovani A, Bonapace S, Lunardi G, et al. Associations between specific plasrna cerarnides and severity of coronary-artery stenosis assessed by coronary angiography. Diabetes Metab. 2020;46(2):150-7. doi:10.1016/j.diabet.2019.07.006.
13. Li Y, Talbot CL, Chaurasia B. Cerarnides in Adipose Tissue. Front. Endocrinol. 2020;11:407. doi:10.3389/fendo.2020.00407.
14. Tidhar R, Zelnik ID, Volpert G, et al. Eleven residues deterrnine the acyl chain specificity of cerarnide synthases. J. Biol. Chern. 2018;287:3197-206. doi:101074/jbc. RA118.001936.
15. Shah C, Yang G, Lee I, et al. Protection from high fat diet-induced increase in ceramide in mice lacking plasminogen activator inhibitor 1. J Biol Chem. 2008;283(20):13538-48. doi:10.1074/jbc.M709950200.
16. Chaurasia B, Kaddai VA, Lancaster GI, et al. Adipocyte Ceramides Regulate Subcutaneous Adipose Browning, Inflammation, and Metabolism. Cell Metab. 2016;24(6): 820-34. doi:10.1016/j.cmet.2016.10.002.
17. Choi RH, Tatum SM, Symons JD, et al. Ceramides and other sphingolipids as drivers of cardiovascular disease. Nat Rev Cardiol. 2021;18(10):701-11. doi:101038/s41569-021-00536-1.
18. B+achnio-Zabielska AU, Baranowski M, Hirnle T, et al. Increased bioactive lipids content in human subcutaneous and epicardial fat tissue correlates with insulin resistance. Lipids. 2012;47(12):1131-41. doi:101007/s11745-012-3722-x.
19. Goossens GH. The role of adipose tissue dysfunction in the pathogenesis of obesity-related insulin resistance. Physiol Behav. 2008;94:206-18. doi:10.1016/j.physbeh.2007.10.010.
20. Ginkel C, Hartmann D, vom Dorp K, et al. Ablation of neuronal ceramide synthase 1 in mice decreases ganglioside levels and expression of myelin-associated glycoprotein in oli-godendrocytes. J Biol Chem. 2012;287(50):41888-902. doi:101074/jbc.M112.413500.
21. Kim YR, Lee EJ, Shin KO, et al. Hepatic triglyceride accumulation via endoplasmic reticulum stress-induced SREBP-1 activation is regulated by ceramide synthases. Exp Mol Med. 2019;51(11):1-16. doi:10.1038/s12276-019-0340-1.
22. Goldenberg JR, Carley AN, Ji R, et al. Preservation of Acyl Coenzyme A Attenuates Pathological and Metabolic Cardiac Remodeling Through Selective Lipid Trafficking. Circulation. 2019;139(24):2765-77. doi:10.1161/CIRCULATIONAHA.119.039610.
23. Laviad EL, Albee L, Pankova-Kholmyansky I, et al. Characterization of ceramide synthase 2: tissue distribution, substrate specificity, and inhibition by sphingosine 1-phosphate. J biol chem. 2008;283:5677-84. doi:10.1074/jbc.M707386200.
24. Atilla-Gokcumen GE, Muro E, Relat-Goberna J, et al. Dividing cells regulate their lipid composition and localization. Cell. 2014;156(3):428-39. doi:10.1016/j.cell.2013.12.015.
25. Law BA, Liao X, Moore KS, et al. Lipotoxic very-long-chain ceramides cause mitochondrial dysfunction, oxidative stress, and cell death in cardiomyocytes. FASEB J. 2018;32(3):1403-16. doi:10.1096/fj.201700300R.
26. Gosejacob D, Jäger PS, Vom Dorp K, et al. Ceramide Synthase 5 Is Essential to Maintain C16:0-Ceramide Pools and Contributes to the Development of Diet-induced Obesity. The Journal of biological chemistry. 2016;291(13):6989-7003. doi:10.1074/jbc.M115.691212.
27. Kolak M, Gertow J, Westerbacka J, et al. Expression of ceramide-metabolising enzymes in subcutaneous and intra-abdominal human adipose tissue. Lipids Health Dis. 2012;11: 115. doi:101186/1476-511X-11 -115.
28. Devlin CM, Lahm T, Hubbard WC, et al. Dihydroceramide-based response to hypoxia. J Biol Chem. 2011;286(44):38069-78. doi:10.1074/jbc.M111.297994.
