CC BY
42© Коллектив авторов, 2014 УДК 615.462:677.021.122.6].03:616-001.17].015.4
СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА БИОСОВМЕСТИМОСТИ ПОЛИМЕРНЫХ МАТРИКСОВ, ПОЛУЧЕННЫХ ПУТЕМ ЭЛЕКТРОФОРМОВАНИЯ, И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДЛЯ СОЗДАНИЯ ОБЪЕМНЫХ ДЕРМАЛЬНЫХ ЭКВИВАЛЕНТОВ
Е.В. Сытина1, кандидат биологических наук, Т.Х. Тенчурин1, кандидат химических наук, С.Г. Рудяк2, кандидат биологических наук, В.П. Сапрыкин1, доктор медицинских наук, О.А. Романова1, кандидат биологических наук, А.С. Орехов1, А.Л. Васильев1, доктор физико-математических наук, А.А. Алексеев3, доктор медицинских наук, профессор, С.Н. Чвалун1, доктор химических наук, профессор, М.А. Пальцев1, академик РАН, профессор, А.А. Пантелеев1, кандидат биологических наук
'НИЦ «Курчатовский институт», Российская Федерация, 123182, Москва, пл. Академика Курчатова, д. 1; 2МираксБиоФарма, Российская Федерация, 141401, Московская обл., Химки, ул. Рабочая, 2а, корп. 1; 3ФГБУ «Институт хирургии им. А.В. Вишневского» Минздрава России, Российская Федерация, 117997, Москва, ул. Большая Серпуховская, 27 E-mail: a.a.pantel@gmail.com
Актуальность. Одним из наиболее перспективных подходов в лечении больных с обширными ожоговыми поражениями кожных покровов является создание искусственного аналога дермы, способного стать структурной основой для восстановления полноценного соединительнотканного каркаса кожи и формирования покрывающего его эпидермиса. При этом выбор материала искусственного матрикса остается ключевой проблемой в процессе разработки дермального эквивалента. Несмотря на разнообразие предлагаемых синтетических продуктов, материала, однозначно признанного эффективным и удовлетворяющего всем требованиям клинической практики, пока не найдено. Это связано прежде всего с недостатком сравнительных исследований различных искусственных материалов в отношении их способности поддерживать рост и миграционную способность клеток кожи.
Цель работы — оценка влияния структурных характеристик нетканых полимерных матриксов (ацетата целлюлозы, поликапро-лактона, смеси поликапролактона с поливинилпирролидоном, поли-Ь-лактида, поли-Б-Ь-лактида, хитозана и фторопласта Ф-42В) на основные клеточные функции первичных фибробластов кожи человека: пролиферацию, миграцию, синтез межклеточного матрикса.
Результаты. Толщина волокон 2—3 мкм и размер пор материала ~20 мкм являются минимально достаточными для обеспечения высокого уровня пролиферации фибробластов и их проникновения в толщу полимерного матрикса. На хитозане дермальные фибробласты образуют специфические рыхлые скопления клеток, никогда не встречающиеся на образцах других материалов. Фибробласты способны синтезировать фибриллярный матрикс на полимерных образцах без добавок компонентов естественного межклеточного матрикса, заполняя им поры размером ~75 мкм и нивелируя значительные дефекты поверхности образца. Активность синтеза фибробластами межклеточного матрикса напрямую зависит от трехмерной структуры среды, определяющей нормальное функционирование клеток этого типа.
Заключение. Электроформование является эффективным методом получения основы для дермальных эквивалентов. При этом пространственные характеристики материала, наряду с его химическими свойствами, являются ключевым фактором. Полученные данные могут служить основой для создания высокофункциональных дермальных эквивалентов и их последующего эффективного применения в клинической практике.
Ключевые слова: биосовместимость, дермальный эквивалент, кожа, нетканые волокнистые материалы, фибробласты, электроформование
COMPARATIVE BIOCOMPATIBILITYOF NONWOVENPOLYMER SCAFFOLDS OBTAINED BY ELECTROSPINNING AND THEIR USE FOR DEVELOPMENT OF 3D DERMAL EQUIVALENTS E.V. Sytina',T.H. Tenchurin', S.G. Rudyak2, V.P. Saprykin1, O.A. Romanova', A.S. Orehov', A.L. Vasiliev', A.A. Alekseev3, S.N. Chvalun', M.A. Paltsev', A.A. Panteleyev'
'National Research Centre «Kurchatov Institute», Akademika Kurchatovapl., 1, Moscow, Russian Federation, 123182;
2MiraksBioFarma, str. Working, and 2, Bldg. 1; Khimki, Moscow region, Russian Federation, 141401;
3Federal State Institution «A.V. Vishnevsky Institute of Surgery» the Ministry of Health of the Russian Federation, str. Large Serpukhov, 27, Moscow, Russian Federation,117997
Introduction. One of the most prospective approaches in therapy of deep skin burns is the development of artificial dermal equivalents with a potential to provide efficient scaffoldingfor dermis reconstruction and re-epithelisation.
The choice of material for such scaffolds remains a key issue in design and development of artificial dermal substitutes. Materials based on natural components of the extracellular matrix of the skin (e.g., collagen) have low mechanical strength, are easily deformed by biodegradation, and are very expensive. Synthetic polymers could provide an alternative to the use of materials of natural origin. However, despite the fact that a large variety of synthetic matrices is available on the market, the material that is unequivocally accepted as effective in the treatment of deep burns and meets all the requirements of clinical practice has not yet been identified. This is primarily due to the lack of comparative studies of various synthetic materials for their ability to support the growth and migration of dermal cells, as well as due to the limited understanding of the mechanisms of interaction between fibroblasts and an artificial scaffold.
The aim of the study. In this work, we have evaluated the biocompatibility of nonwoven polymeric matrices of different origin (cellulose acetate, polycaprolactone, polycaprolactone mixture with polyvinylpyrrolidone, poly-L-lactide, poly-D-L-lactide, chitosan andpolytetrafluoroethylene) as well as the influence of their structural andphysicochemical characteristics on the physiology of primary human dermal fibroblasts.
Results. The fiber thickness of 2—3 microns and a pore size of about 20 microns of material are minimally sufficient for high levels ofproliferation of fibroblasts and their penetration into the thickness of the polymeric matrix. On chitosan dermal fibroblasts do not proliferate and form specific loose clusters which are never found on other materials. Fibroblasts are capable of synthesizing extracellular matrix on polymer samples without addition of natural components of the extracellular matrix, filling the pores of about 75 microns and significant surface defects. Obviously, the normal functioning of dermal fibroblasts on artificial scaffolds and particularly their synthetic activity depends on the three-dimensional structure of the microenvironment.
Conclusion. The data obtained in our study may be used for development offunctional dermal equivalents with high efficiency in treatment of deep burns and other skin defects associated with extensive loss of tissue.
Keywords: biocompatibility, dermal equivalent, skin, nonwoven fibrous materials, fibroblasts, electrospinning
ВВЕДЕНИЕ
До настоящего времени клиническим «золотым стандартом» хирургического лечения обширных ожоговых поражений кожи и трофических язв является применение аутологичных кожных трансплантатов (главным образом, расщепленного кожного лоскута) [1]. Однако данная методика неэффективна при ожоговых поражениях >20—40% поверхности тела. В этих случаях при дефиците аутологичной кожи для временного покрытия ожоговых ран может использоваться донорская кожа (аллогенная трансплантация) или кожа животных (ксеногенная трансплантация). Однако их использование связано с рядом проблем, включая иммунное отторжение, возможность передачи инфекций, а также правовые и этические проблемы [2]. Наиболее перспективной альтернативой алло- и ксенотрансплантации является использование кожных эквивалентов на основе искусственных полимерных матриксов [3, 4].
Благодаря развитию методов получения полимерных материалов, в частности, технологии электроформования (электроспининга) стали доступны материалы, по физико-химическим свойствам приближающиеся к природным матриксам тканей и органов, в том числе кожи [5]. В настоящее время в развитых странах летальность при тяжелых ожогах значительно снижается за счет выращивания фибро-бластов и(или) кератиноцитов на полимерных носителях и получения на этой основе искусственного эквивалента кожи [3, 6, 7]. В России коммерческое производство кожных эквивалентов с включением клеточных компонентов отсутствует.
Хорошо известно, что применение взвеси культивированных аллогенных фибробластов положительно влияет на заживление ожогов и трофических язв [1, 8—10]. Вместе с тем в случае глубоких и обширных повреждений кожи использование только клеточного компонента малорезультативно, так как основной проблемой становится утрата значительного объема матрикса дермы. Наиболее эффективным решением этой проблемы является создание искусственного аналога дермы, способного стать структурной основой для восстановления полноценного соединительнотканного каркаса кожи [11, 12], обеспечивающего как безрубцовое восстановление дермы, так и формирование кератиноцитами функционального эпидермиса.
Наиболее простым и очевидным вариантом субстрата для тканеинженерных аналогов кожных по-
кровов являются природные фибриллярные белки межклеточного матрикса кожи, в первую очередь — коллаген. Однако материалы на коллагеновой основе обладают низкой механической прочностью, слишком быстро деформируются и разрушаются в результате биодеградации, а также являются весьма дорогостоящими. Использование синтетических полимерных материалов могло бы быть альтернативой матриксам природного происхождения. Несмотря на разнообразие предлагаемых синтетических продуктов [4], материала, однозначно признанного эффективным в лечении глубоких поражений кожи, пока не выявлено. Связано это в значительной мере с недостатком сравнительных исследований различных искусственных материалов в отношении их способности поддерживать рост и миграционную способность клеток кожи, а также с ограниченным пониманием механизмов взаимодействия фибро-бластов и матрикса. Сравнительные исследования поведения фибробластов на материалах различного происхождения остаются единичными.
Цель настоящей работы — сравнительное изучение влияния структурных, механических и химических характеристик серии нетканых волокнистых материалов (как синтетических, так и природного происхождения) на миграцию и пролиферацию первичных дермальных фибробластов человека. В работе использовались полученные методом электроформования материалы на основе ацетата целлюлозы (АЦ), поликапролактона (ПКЛ), смеси ПКЛ с поливинилпирролидоном (ПКЛ/ ПВП), поли-Ь-лактида (ПЛЛА), поли^-Ь-лактида (ПДЛА), хитозана и фторопласта (Ф-42В).
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Процесс электроформования волокнистых материалов
В настоящей работе для изготовления экспериментальных образцов использовалась электрокапиллярная установка, разработанная в отделении кристаллографии НИЦ «Курчатовский институт». Межэлектродное расстояние подбиралось таким образом, чтобы пористость материала составляла 85—97%. Процесс электроформования проводился при комнатной температуре и относительной влажности 20—40%.
Для получения образцов нетканых волокнистых материалов использовали следующие полимеры:
♦ низкомолекулярный хитозан со степенью деацетилирования 75—85%, производитель SigmaAldrich;
♦ АЦ, содержащий 39,7% ацетильных групп среднечисленной молекулярной массой 50 кДа, производитель SigmaAldrich;
♦ ПКЛ среднечисленной молекулярной массой 80 кДа, производитель SigmaAldrich;
♦ ПЛЛА марки 4032D, производитель NatureWorks;
♦ ПДЛА, синтезированный в НБИКС-центре Курчатовского института, средневесовой молекулярной массой 121 кДа [13];
♦ сополимер тетрафторэтилена с винилиденфто-ридом марки Ф-42В (фторопласт), молекулярная масса 80—100 кДа, производитель Кирово-Чепецкий химический комбинат [14];
Все перечисленные полимеры биосовместимы и разрешены для применения в медицине [15].
С целью повышения гидрофильных свойств материала на основе ПКЛ в состав полимерного раствора №4 (табл. 1) в качестве добавки (20% веса основного полимера или 2,2% массы раствора) вводили средне-молекулярный медицинский ПВП (Болоховский химкомбинат) молекулярной массой 35 кДа. Далее этот вариант ПКЛ обозначен как ПКЛ/ПВП.
Таблица 1
СОСТАБ И СБОЙС^ ИСПОЛЬЗОБАННЫХ ПОЛИМЕРНЫХ РAСTBOРOB
№ раствора Состав раствора Бязкость, Пас Электропроводность, мкСм/см
1 Хитозан 6,5%/0,12% ПЭО: (70% УК + 30% вода) 3 2500
2 АЦ 9%: ЭА 0,85 0,15б
3 ПКЛ 8,0%: ХФ -
4 ПКЛ 11,0%: (2,2% ПВП + 80% ЭA + 20% ЭС) 0,94 б,!
5 ПЛЛЛ l,5%: ХФ - 1,5
б Ф-42В 8%: (90% ЭA + 10% ЭС) 0,б 5
l ПДЛЛ15%: (l0% ЭA + 30% ЭС) 0,8 2,5
Примечание. ПЭО — полиэтиленоксид; УК — этилацетат, ЭС — этиловый спирт. уксусная кислота; ХФ — хлороформ, ЭA —
ПАРАМЕТРЫ ПРОЦЕССА ЭЛЕКТРОФОРМОВАНИЯ ПОЛИМЕРНЫХ РАСТВОРОВ Таблица 2
№ раствора Основной полимер Напряжение, кБ Расстояние между электродами, см Объемный расход, мл/ч Обдувка, л/ч
1 Хитозан 25 19 2,5 -
2 AЦ 2l 14 68 8
3 ПКЛ 10 42 33 8
4 ПКЛ/ПВП 8 23 7,8 8
5 ПЛЛЛ ll 14 2,5 10
б Фторопласт 25 15 140 20
l ЦДЛЛ 18 18 1 15
В качестве волокнообразующей добавки, увеличивающей упругие свойства раствора хитозана и обеспечивающей непрерывность жидкого волокна этого полимера, использовался ПЭО средневязкостной молекулярной массой 2000 кДа (SigmaAldrich). Поскольку все хитозановые образцы были получены с добавлением ПЭО, далее они обозначаются просто как хитозан (раствор №1, см. табл. 1).
На основании предварительно проведенной серии экспериментов была определена оптимальная концентрация растворов полимеров, использованных для получения образцов (см. табл. 1). Экспериментальные образцы изготавливали при параметрах электроформования, обеспечивающих устойчивый во времени процесс получения волокон (табл. 2).
Сканирующая электронная микроскопия экспериментальных образцов
Морфологию поверхности нетканых волокнистых материалов и их геометрические характеристики (рис. 1) определяли с помощью сканирующего электронного микроскопа Helios 600i (FEI, США). С помощью программного обеспечения ScopePhoto (ScopeTek) на полученных микрофотографиях измеряли от 70 до 100 волокон для расчета среднего диаметра волокна (табл. 3), а также стандартного отклонения (с) и коэффициента вариации (V) полученных показателей.
Определение пористости и размера пор нетканых волокнистых материалов
Пористость (А%) образцов определяли из отношения объема занимаемого волокнами и объема всего материала (см. табл. 3).
Размер пор образцов определяли методом точки пузырька. Данным методом по уравнению Лапласа (1) можно рассчитать размер крупных (образование 1-го пузырька) и средних пор (начало кипения) в образцах:
D=4-y(cos0)/P, (1) где у — поверхностное натяжение на границе этиловый спирт — воздух 22,8 мН/м при 20°С; 0 — краевой угол смачивания; P — давление в точке пузырька, Па.
Измерение краевых углов смачивания нетканых материалов проводили с помощью системы анализа формы капли KRUSS DSA 30E (Германия). Поскольку степень смачиваемости материалов определялась по воде, полученные результаты позволяли также судить о гидрофильных свойствах получаемых волокнистых материалов (табл. 4).
Определение механических характеристик нетканых волокнистых материалов
Определение механических характеристик образцов нетканых волокнистых материалов проводили с использованием разрывной машины Ин-строн-5965 (Instron®, США) при температуре 23°С, относительной влажности 60%, скорости растяжения 25 мм/мин, рабочей длине и ширине образца соответственно 50 и 10 мм.
Расчет прочности (Р) проводили по формуле (2), определяя условное сечение образцов через их массу и плотность соответствующего полимера [16]:
F
P = —- = S
усл.
1 ■ р ■ F
m
, (2)
где Бр — разрывная нагрузка, Н; — длина рабочей части образца, м; т — масса рабочей части образца, кг; р — плотность полимера, кг/м3.
Относительное удлинение и модуль Юнга рассчитывали по стандартным методикам. Результаты иссле-
дования прочностных свойств материалов приведены с указанием стандартной ошибки (см. табл. 4).
Выделение первичных дермальных фибробластов Первичные фибробласты кожи человека были получены в соответствии с ранее описанным методом [17]. Для работы использовались клетки не позднее 5-го пассажа. Клетки культивировали на среде DMEM-GlutaMAX, содержащей 10% фосфатно-солевой буфер, аскорбиновую кислоту — 50 мкг/мл, гентамицин — 10 мкг/мл и фунгизон — 0,25 мкг/мл. Смену среды проводили 2 раза в неделю.
Подготовка матриксов к культивированию клеток Подготовка образцов матриксов к культивированию клеток проводилась, как описано ранее [18]: замачивание в 96% этаноле на 20 мин для смачивания и стерилизации, затем замачивание в 70% этаноле на 20 мин с 3 последующими отмывками от этанола в ФСБ по 3—5 мин, после чего образцы на ночь замачивали в среде для культивирования. Образец ПДЛА подвергался обработке только 70% этанолом и не бо-
в
_;
'-
I" ™ ■
l=!
i.
а = 0,5; V = 33,1
..... I-
II.
u=0,34; V=58,8
Г:
»Ii..
0=0,5; V=33J
lllll...
0Л li u u u u u u
u=l,65; У =75,1
Г!
tr=0,35; V=ll
Ilia.
H H II t» n
1; V—57,1
! -
I1:
III.
7; V-39,8
Рис. 1. Гистограммы распределения волокон по размерам, рассчитанные на основе анализа соответствующих микрофотографий материалов: А — хитозан; Б — ПКЛ/ПВП; В — ПДЛА; Г — ПКЛ; Д — ПЛЛА; Е — фторопласт Ф-42В;Ж — АЦ; а — стандартное отклонение, V — коэффициент вариации. Увеличение: А—Е: х2500;Ж: х1500. В верхнем правом углу каждого изображения — вставка с более высоким увеличением того же образца (*12 000)
лее 3—5 мин, так как этот материал дает значительную усадку в 9б% этаноле.
Оценка пролиферации с помощью М^-теста
Оценка интенсивности пролиферации фибро-бластов на матриксах с помощью МТТ-теста проводилась по протоколу AMSBM (MTTcell viability assay of cultures grown on Alvetex® in 3D; http://www.amsbio. com) с незначительными модификациями.
Бизуальная оценка состояния клеток методом конфокальной микроскопии
Визуальная оценка состояния клеток при помощи системы флюоресцентных красителей «живой/ мертвый» (LIVE/DEAD® Viability/Cytotoxicity Kit, Molecular Probes, L-3224) проводилась в соответствии с протоколом производителя с использованием конфокального сканирующего микроскопа Fluoview FV10i (Olympus, Япония).
Приготовление гистологических препаратов
Для проведения гистологического анализа первичные дермальные фибробласты человека высевали в количестве 200 тыс. клеток на образец площадью 1,0 см2.
СTРУКTУFHЫЕ ХAРAКTЕРИСTИКИ МATЕРИAЛOB, ПОЛУЧЕННЫХ МЕTOДOМ ЭЛЕКГРОФОРМОБАНИЯ
№ раствора Основной полимер ^мщина, мкм Пористость А, % Диаметр волокна d(,, мкм Диаметр пор, D .. мкм medium пор
1 Хитозан 300 93,9 0,53 2,3
2 ПКЛ/ПВП бб0 8l,9 0,58 3,4
3 ДДЛЛ 5б0 90,2 1,5 3,8
4 ПКЛ 1350 90,0 2,2 24,8
5 ПЛЛЛ б0 86,1 3,1 23,3
б Фторопласт 430 93,2 l,0 3l,2
l AЦ б00 96,6 8,9* l4,4
Примечание. * — условная величина диаметра волокна.
Таблица 4
ПРОЧНОСТНЫЕ СБОЙСТБА И КРАЕБЫЕ УГЛЫ СМАЧИБАНИЯ
МАтаРИАЛОБ, ПОЛУЧЕННЫХ МЕTOДOМ ЭЛЕОТРОФОРМОБАНИЯ
№ раствора Основной полимер Модуль Юнга, МПа Прочность, МПа Относительное удлинение, % Краевой угол смачивания, град.
1 ПКЛ 21,0±0,б 5,0+0,2 210,0+25,0 144
2 ПЛЛЛ 1!3,0±28,6 6,0+0,1 ll4,0+l,3 137
3 Фторопласт 2б,0±1,9 l,0+l,3 242,0+l,l 141
4 ПДЛA 33l,0±6,l 10,0+0,2 40,0+4,2 129
5 ПКЛ/ПВП 128,0+1,5 10,0+0,5 10,0+0,5 — *
б AЦ 43l,0±l9,l l2,0+0,l 4,0+0,3 121
l Хитозан 53l,0±45,l 1б,0+1,1 l0,0+0,l — *
Примечание. *Для хитозана и ПКЛ/ПВП контактный угол смачивания определить не уда-
лось вследствие чрезвычайно быстрого впитывания капли воды б исследуемый образец.
Криосрезы приготовляли, как описано ранее [18], с использованием заливочной среды Tissue-Tek® O.C.T. Compound (производитель EMS) и 30% раствора сахарозы. Срезы толщиной 8—12 мкм были получены на криостате Leica CM1950 и окрашены гематоксилином и эозином по стандартной методике [19].
Ввиду того, что все использованные материалы, за исключением хитозана, растворяются в ксилоле и хлороформе, для обезвоживания и парафиновой проводки использовали изопропиловый спирт в возрастающей концентрации (50, 60, 70, 80 и 100%). Последующую заливку в парафин, приготовление и окрашивание срезов (7—10 мкм) проводили по стандартной методике [19].
Сканирующая электронная микроскопия в режиме естественной среды
Для анализа образцов методом сканирующей электронной микроскопии в режиме естественной среды (ESEM) первичные дермальные фибробласты человека высевали на образцы площадью 1,0 см2 в количестве 200 тыс. клеток на 1 образец. Далее образцы с клетками фиксировали 2,5% раствором глутарового альдегида [20]. Образцы анализировали с использованием сканирующего электронного микроскопа Versa 3D (FEI, США), позволяющего работать с влажными образцами.
Таблица 3
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Зависимость структуры волокнистых материалов от состава исходного раствора полимеров
Результаты исследования структуры полученных материалов и оценки их свойств приведены на рис. 1 и в табл. 3. Большая часть исследованных образцов состоит из волокон преимущественно круглого сечения. Единственным исключением является образец на основе АЦ, содержащий волокна ленточной (уплощенной) формы (см. рис. 1). В связи с этим для материалов на основе АЦ термин «диаметр волокна» применим лишь условно (см. табл. 3). Стоит отметить, что АЦ является единственным из исследованных материалов, сочетающим значительный размер пор (и, соответственно, высокую рыхлость) с высокой прочностью. Высокая прочность АЦ определяется тем, что это жесткоцепной полимер, в котором практически не проявляется гибкость макромоле-
кул. Именно поэтому модуль Юнга этого материала имеет такое высокое значение.
Поверхность волокон материалов из хитозана, ПКЛ/ПВП, ПДЛА и АЦ гладкая, тогда как для материалов на основе ПКЛ, ПЛЛА и Ф-42В характерна пористая поверхность волокон.
Однородность распределения волокон по размерам характерна только для материалов на основе хитозана, ПЛЛА и ПДЛА. Для всех остальных материалов значения диаметра волокон характеризуются большей дисперсностью, которая может объясняться либо неустойчивостью процесса формования, либо делением волокон в межэлектродном пространстве. Степень однородности толщины волокон имела некоторую положительную корреляцию с плотностью материалов (см. рис. 1, табл. 3).
В табл. 3 также представлены рассчитанные значения среднего диаметра волокон (d , мкм), пористости материалов (А, %) и среднего размера пор (D , , мкм), а также толщина материалов. Из по-
v medium пор' '' ^ *
лученных данных видно, что увеличение диаметра волокон существенно влияет на размер пор в материале и, в меньшей степени — на его пористость. Примечательно, что все материалы с толщиной волокон до 1,5 мкм (хитозан, ПКЛ/ПВП и ПДЛА) имеют размер пор не более 4 мкм, тогда как в материалах с толщиной волокон >2 мкм размер пор резко увеличивается и составляет от 23 до 74 мкм (см. табл. 3).
Оценка свойств материалов, полученных методом электроформования
Прочностные свойства полученных материалов приведены в табл. 4. Наибольшей прочностью и, соответственно, более высокими значениями модуля Юнга обладают материалы на основе жесткоцепных полимеров (таких, как хитозан и АЦ), а наибольшим относительным удлинением — материалы на основе более эластичных и мягких полимеров (таких, как ПКЛ и Ф-42В). Наши исследования на нетканых материалах показали, что в отличие от монолитных полимерных конструкций [21] прочность при разрыве волокнистых материалов на основе ПДЛА (в среднем 10 МПа) выше, чем в образцах на основе ПЛЛА (6 МПа), а относительное удлинение образцов на основе ПДЛА — ниже (см. табл. 4).
Оценка метаболических характеристик и пролиферации дермаль-ных фибробластов на образцах материалов
Для оценки влияния состава и структуры полимерных матриксов
на основные физиологические показатели фибробла-стов дермы человека использовался МТТ-тест. По результатам предварительно проведенного теста LIVE/ DEAD у всех выбранных для исследования материалов отсутствовала клеточная токсичность, поэтому данные МТТ-теста в большей мере отражают способность клеток к пролиферации, чем какие-либо другие характеристики физиологического состояния клеток на тестируемом типе матрикса.
Наибольшие значения активности пролиферации первичных фибробластов характерны для всех материалов с толстыми волокнами и большим диаметром пор, которые обеспечивают активное проникновение фибробластов в их внутренние слои. К таким материалам относятся, в первую очередь, АЦ и матриксы на полилактидной основе (см. рис. 2 А—В), а также ПКЛ и фторопласт (см. рис. 2 Д, Е). На образцах материалов, состоящих из тонких, плотно упакованных волокон (хитозан и ПКЛ/ПВП), показания МТТ-теста были существенно ниже (см. рис. 2 Г, Ж).
Кроме того, нами было показано, что размер пор у ПКЛ/ПВП в 7 раз меньше, чем у чистого ПКЛ (соответственно 3,4 и 24,8 мкм). Хотя причины этих отличий могут быть самыми разными, они значительно влияют на интенсивность пролиферации и миграцию фибробластов, а также на синтез ими естественного межклеточного матрикса (см. далее).
о о О
е
•л
я
С
(J
13 <
Здня 7 дней 14 дней
I
1 1 3 4 5 6 7
Природные/синтетические с с п С С с П
Порисги^гпэдкие п г г F п п F
Плотные/рыхлые п п р Г Р Р п
Жесткие-прочные/мягкие-эласгичные м м ж м м м ж
Толщина волокон средняя, мкм 3,1 1,5 3,9 0,53 2,2 7,0 0,53
Размер пор средний, мкм 233 3,8 74,4 ЗА 24,8 37,2 га
Пористости % Е6Д 90,2* 96,6 87,9 90,0 93,2 93,9
Однородность ++ - - + - - +4
Проникновение ++ +А ++ + ++ -
Синтез матрикса + + ++ - + +4- -
(А) (Б) (В) (Г) (Д) (Е) (Ж)
Рис. 2. Сравнительная оценка интенсивности пролиферации и жизнеспособности первичных дермальных фибробластов методом МТТ с характеристиками образцов нетканых материалов; время культивирования 3, 7 и 14 дней; А - ПЛЛА; Б - ПДЛА; В - АЦ; Г - ПКЛ/ПВП; Д - ПКЛ; Е -фторопласт; Ж -хитозан. * ПДЛА дает усадку при обработке этанолом
Анализ распределения клеток на образцах методами световой, флюоресцентной и электронной микроскопии
Фибробласты активно распространяются по поверхности всех протестированных материалов, принимая характерную для нормальных фибробластов ве-ретеновидную форму. Однако проникновение вглубь образца и способность мигрировать в его толще напрямую зависят от пространственных характеристик материала. Наши результаты показали, что слишком тонкие и, соответственно, плотно упакованные волокна препятствуют эффективной миграции клеток. В мелкопористые хитозан и ПКЛ/ПВП клетки не проникают, образуя монослой на их поверхности (напоминая поведение клеток на гладкой поверхности пластика; см. рис. 3 Д), тогда как на матриксах из фторопласта, АЦ и ПЛЛА фибробласты пронизывают всю толщу материала (рис. 4), причем наиболее равномерно они распределяются в ПЛЛА. Стоит отметить, что в матрикс на основе ПДЛА, близкого к ПЛЛА по химической структуре, но с порами значительно меньшего размера, клетки проникают только в поверхностные слои материала. В хитозановых матриксах фибробласты, хотя и пролиферируют, но в толщу матрикса проникают плохо и, в основном, в местах поверхностных дефектов матрикса. При этом в толще матрикса фибробласты образуют специфические рыхлые скопления клеток округлой формы, никогда не встречающиеся в других исследованных материалах (ПЛЛА, ПДЛА, АЦ, ПКЛ/ПВП, ПКЛ, фторопласт Ф-42В), на которых клетки имеют ха-
рактерную для нормальных фибробластов веретено-видную форму, распластаны вдоль волокон матрикса параллельно друг другу и не формируют объемных скоплений. Стоит отметить, что даже материал на основе ПКЛ/ПВП, сходный с хитозаном по структурным характеристикам (см. табл. 3) и по невысокой способности поддерживать пролиферацию клеток, значительно отличается от него характером распределения фибробластов. Формирование скоплений на хитозане и сохранение клетками округлой формы могут определяться специфическими адгезионными свойствами этого материала [22]. Сходный эффект описан ранее для хитозановых мембран, используемых для получения сфероидов и выделения популяции стволовых клеток из гингивальных фибробластов
[23], а также для поддержания стволовости стволовых клеток, выделенных из жировой ткани и плаценты
[24]. Также было показано, что фибробласты, в отличие от других типов клеток, хуже прикрепляются и не приобретают характерной веретеновидной формы на покрытом хитозаном пластике, причем эти эффекты сопряжены с пространственной реорганизацией молекул актина и интегрина Р1 [25].
Наши результаты показали, что в АЦ и фторопласте (материалы с самыми крупными порами) клетки эффективно связываются с волокнами и перемещаются по ним, образуя своеобразные «потоки» клеток, распределенных вдоль отдельных волокон или их групп (см. рис. 3, З). Вместе с тем расстояния между волокнами обоих этих образцов слишком велики
Рис. 3. Морфология дермальных фибробластов и их распределение в объеме полимерных материалов; конфокальная микроскопия (А—Ж). Культивировние на образцах в течение 21 дня. Живые клетки окрашены кальцеином (зеленый), ядра мертвых клеток — йодидом пропидия (красный). А — ПЛЛА; Б — ПДЛА; В — АЦ; Г— хитозан; Д— ПКЛ/ПВП; Е — ПКЛ; Ж — фторопласт Ф-42В; З — распространение клеток вдоль волокон фторопласта (флюоресцентный микроскоп). Шкала — 50мкм
для свободного перехода клетки с одного волокна на другое (это возможно только в местах их соприкосновения). В образцах ПЛЛА, ПДЛА и ПКЛ расстояние между волокнами не так велико, чтобы препятствовать переходу клеток с волокна на волокно, что, очевидно, обусловливает однородное распределение клеток по их объему без формирования «потоков» (особенно это характерно для ПЛЛА).
Значительное влияние на поведение фибробла-стов оказывает и диаметр волокон искусственного матрикса. На всех образцах с большим диаметром волокна (>2,0 мкм — АЦ, ПЛЛА, ПКЛ и фторопласт) заметны распластанные клетки с типичной для фи-бробластов морфологией (см. рис. 3, В, Е, Ж). Клетки располагаются вдоль волокон и (за редким исключением) каждая из них контактирует только с одним волокном (см. рис. 3 В).
На фотографиях, полученных методом сканирующей электронной микроскопии (СЭМ), также видно,
что фибробласты легко проникают в рыхлые образцы с относительно толстыми волокнами — АЦ и фторопласт Ф-42В (соответственно 8,9 и 7,0 мкм; рис. 5 Д, Ж и З) и несколько хуже — в матриксы с волокнами средней толщины: на основе ПЛЛА и ПКЛ (соответственно 3,1 и 2,2 мкм; рис. 5 А, Г). На остальных образцах (рис. 5 Б, В и Е) хорошо различим монослой фибро-бластов на поверхности матрикса, но внутрь образца проникают только отдельные клетки (ПДЛА; волокна 1,5 мкм) или не проникают совсем (ПКЛ/ПВП, хито-зан; волокна соответственно 0,58 и 0,53 мкм).
Таким образом, толщина волокон 2—3 мкм (и, соответственно, размер пор материала от 20 мкм) — минимально достаточная для обеспечения проникновения фибробластов в толщу полимерного матрикса.
Синтез внеклеточного матрикса фибробластами
Способность синтезировать межклеточный ма-трикс и откладывать его на поверхности материала, т.е. выполнять свои нормальные функции служит
Рис. 4. Распределение первичных дермальных фибробластов в объеме полимерных материалов (окраска гематоксилином и эозином). Культивирование фибробластов на образцах в течение 14 дней. Примечание. А — ПЛЛА; Б — ПДЛА; В — АЦ; Г — хитозан; Д — ПКЛ/ПВП; Е — ПКЛ; Ж — фторопласт Ф-42В. На нижней части каждого изображения представлено 4-кратное увеличение участка этого же образца. Стрелками обозначены волокна вновь синтезированного межклеточного матрикса; З — заполнение клетками и вновь синтезированным матриксом дефекта поверхности на образце ПДЛА, 21-й день культивирования; красной пунктирной линией обозначена граница поверхности нетканого материала. Шкала А—Ж: 200мкм, 3:100мкм. Все срезы, кроме Д, — парафиновые; Д — криосрезы
важной характеристикой состояния фибробластов. Известно, что в материале на коллагеновой основе (около 70% коллагена) нормальные фибробла-сты способны заполнять вновь синтезированным межклеточным матриксом поры размером до 160 мкм [12]. По результатам проведенного нами гистологического исследования (окрашивание гематоксилином и эозином) и данным СЭМ, фибробласты способны синтезировать межклеточный матрикс и на полимерных образцах без добавок компонентов естественного межклеточного матрикса, заполняя поры размером ~75 мкм (АЦ) и значительные дефекты поверхности образца (см. рис. 4). При культивировании на рыхлых образцах, обеспечивающих интенсивное проникновение клеток внутрь материала (АЦ, ПКЛ и фторопласт, где диаметр пор составляет соответственно 74,4; 24,8 и 37,2 мкм; рис 4 В, Е, Ж; см. табл. 3), фибробласты синтезируют хорошо различимые тонкие волокна нового межклеточного матрикса (отмечены стрелками). Количество подобных структур в толще более плотных образцов ПЛЛА несколько ниже. На образцах ПДЛА и ПКЛ/ПВП (поры размером соответственно 3,8 и 3,4 мкм), в которые клетки проникают относительно плохо, их количество крайне низкое, что свидетельствует о способности фибробластов нормально синтезировать внеклеточный матрикс лишь в объеме, но не в монослое. На хитозановых матриксах (поры 2,3 мкм) фибробласты синтезируют естественный внеклеточный матрикс также в основном в местах повреждения/нарушения поверхностной структуры образца и трансформации их монослоя в объемные структуры (см. рис. 4 Г).
На электронных фотографиях образцов АЦ, ПКЛ и фторопласта, в которые клетки проникают наиболее активно, можно различить тонкие волокна вновь синтезированного фибробластами естественного межклеточного матрикса в толще полимерного материала (см. рис. 5 Б, Е, Ж и З). Эти материалы об-
ладают относительно толстыми волокнами и рыхлой структурой. На остальных образцах волокна естественного межклеточного матрикса незначительны или отсутствуют. Следовательно, активность синтеза фибробластами межклеточного матрикса прямо зависит от способности образца обеспечить проникновение клеток в свои глубокие слои, т.е. от трехмерности микросреды (контакт клеток с волокнами матрикса по всем направлениям).
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Результаты физико-химического, а также биологического анализа нетканых материалов на основе как природных (АЦ, хитозан), так и синтетических (ПЛЛА, ПДЛА, ПКЛ/ПВП, ПКЛ, фторопласт Ф-42В) полимеров показали, что метод электроформования позволяет получать искусственные матрик-сы, в целом способные обеспечить пролиферацию и перемещение фибробластов, однако значительно отличающиеся по этим показателям.
Показано, что пространственные характеристики матрикса непосредственно определяют способность материала поддерживать рост и нормальное функционирование фибробластов. Полученные результаты дают основание заключить, что толщина волокон 2—3 мкм (и, соответственно, размер пор материала ~20 мкм) минимально достаточная для обеспечения высокого уровня пролиферации фибробластов и их проникновения в толщу полимерного матрикса. Фиб-робласты активно распространяются по поверхности всех протестированных материалов, принимая характерную для нормальных фибробластов веретеновид-ную форму. При этом на хитозане дермальные фибро-бласты образуют специфические рыхлые скопления клеток, никогда не встречающиеся на образцах других материалов. Согласно результатам проведенного нами гистологического исследования и данным СЭМ, фи-бробласты способны синтезировать межклеточный
Рис. 5. СЭМ образцов с фибробластами (культивирование - 14 дней). А - ПЛЛА; Б - ПДЛА; В - АЦ; Г - хитозан; Д - ПКЛ/ПВП; Е - ПКЛ; Ж и З - фторопласт Ф-42В. Шкала/отрезок: 50 мкм. Стрелками обозначены фибробласты (для В и Е - граница монослоя)
матрикс на полимерных образцах без добавок компонентов естественного межклеточного матрикса, заполняя поры размером ~75 мкм и значительные дефекты поверхности образца. Очевидно, активность синтеза фибробластами межклеточного матрикса напрямую зависит от трехмерной структуры среды, определяющей нормальное функционирование клеток этого типа. Таким образом, с точки зрения воздействия на клетки пространственные характеристики (микро- и наноструктура) материала не менее важны, чем его химические свойства. Вместе с тем для оптимального влияния матрикса на клетки необходим строгий баланс между различными параметрами его структуры.
Авторы выражают признательность Т.Е. Григорьеву, А.Ю. Хоменко, А.Д. Шепелеву и В.Г. Мамагу-лашвили (отделение кристаллографии НБИКС-центра Курчатовского института) за помощь в получении некоторых образцов нетканых материалов, а также С.Г. Силиной и Е.А. Тверье (отделение молекулярной биологии НБИКС-центра Курчатовского института)
за помощь в получении криосрезов.
* * *
Гранты:
Исследования поддержаны грантом РФФИ (13-0412038 офи_м).
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
1. Федоров В.Д.,Алексеев А.А., Крутиков М.Г., Кудзоев О.А. Комбустиология: история, проблемы и современные методы хирургического лечения обожженных. Комбустиология.1999; 1: 2-12. [Fedorov VD., Alekseev A.A., Krutikov M.G., Kudzoev O.A. History, problems and modern methods of surgical treatment of the burned. Combustiology. 1999; 1: 2-12 (in Russian)]
2. Mansbridge J. Tissue-Engineered Skin products. In: Principles of Tissue Engineering. Eds: Lanza R., Langer R., Vacanti J.P. Fourth edition, Academic press, Chapter. 2013; 81:1697-715.
3. Boyce S.T., Kagan R.J., Greenhalgh D.G., Warner P., Yakuboff K.P., Palmieri T., Warden G.D. Cultured skin substitutes reduce requirements for harvesting of skin autograft for closure of excised, full-thickness burns. J. Trauma.2006; 60(4):821-9.
4. Shevchenko R.V., James S.L., James S.E. A review of tissue-engineered skin biocon-structs available for skin reconstruction. J. R.Soc. Interface. 2010;7 (43): 229-58.
5. Rim N.G., Shin C.S., Shin H. Current approaches to electrospunnanofibers for tissue engineering. Biomed Mater.2013; 8(1):014102.
6. Chern P.L., Baum C.L., Arpey C.J. Biologic Dressings: Current Applications and Limitations in Dermatologic Surgery. Dermatol. Surg. 2009; 35: 891-906.
7. Limovâ M. Active Wound Coverings: Bioen-gineered Skin and Dermal Substitutes. Surg Clin. N. Am. 2010; 90: 1237-55.
8. Глущенко Е.В. Восстановление кожных покровов у обожженных с помощью культивированных фибробластов человека. Медицинские Диссертация. Москва, 1994 http://medical-diss. com/medicina/vosstanovlenie-kozhnyh-pokrovov-u-obozhzhennyh-s-pomoschyu-kultivirovannyh-fibroblastov-cheloveka / [Gluschenko E.V. Restore burned skin using cultured human fibroblasts. Medical Dissertation. Moscow, 1994 http://medical-diss. com/medicina/vosstanovlenie-kozhnyh-pokrovov-u-obozhzhennyh-s-pomoschyu-kultivirovannyh-fibroblastov-cheloveka / (in Russian)]
9. Алексеев А.А., Кашин Ю.Д., Яшин А.Ю., РахаевA.M. Тактика лечения тяже-лообожженных на основе применения культивированных аллофибробластов. Новые методы лечения ожогов с использованием культивированных клеток кожи. Саратов, 1998, c. 9-12.
[Alekseev A.A., Kashin Ju.D., Jashin A.Ju.,
Rahaev A.M. Severely burned treatment strategy based on the use of cultured al-lofibroblasts. New methods of treatment of burns with cultured skin cells. Saratov, 1998, р. 9-12 (in Russian)]
10. Матчин Е.Н., Потапов В.Л., Алексеев А.А. Клинико-морфологическая оценка результатов комбинированной аутодермо-пластики с трансплантацией культивированных фибробластов у обожженных. Комбустиология. 2000; 2: 35-42. [Matchin E.N., Potapov V.L., Alekseev A.A. Kliniko-morfologichesky assessment of results combined by auto-dermoplastiki with transplantation of the cultivated fibroblast at the burned. Combustiology. 2000; 2: 35-42 (in Russian)]
11. Yim H., Yang H.T., Cho Y.S., Seo C.H., Lee B.C., Ko J.H., Kwak I.S., Kim D., Hur J., Kim J.H., Chun W. Clinical study of cultured epithelial autografts in liquid suspension in severe burn patients. Burns. 2011; 37(6): 1067-71.
12. Bonvallet P.P., Culpepper B.K., Bain J.L., Schultz M.J., Thomas S.J., Bellis S.L. Micro-porous dermal-like electrospun scaffolds promote accelerated skin regeneration. Tissue Eng Part A. Epub ahead of print. Mar 31, 2014.
13. Богданова О.И., Седуш Н.Г., Овчинникова Т.Н., Белоусов С.И., Поляков Д.К., Чвалун С.Н. Полилактид - биоразлагаемый, биосовместимый полимер на основе растительного сырья. Экология и промышленность России. Спец. вып: Био-разлагаемые полимеры: исследования и разработки. 2010; 18-23. [Bogdanova O.I., Sedush N. G., Ovchin-nikova T. N., Belousov S. I., Poljakov D. K., Chvalun S.N. Polylactide - a biodegradable, biocompatible polymer based on vegetable raw materials. Ecology and Industry of Russia. Special Issue: Biodegradable polymers: research and development. 2010; 18-23 (in Russian)]
14. Баскин З.Л., Шабалин Д.А., Выражейкин Е.С., Дедов С.А. Ассортимент, свойства и применение фторполимеров Кирово-Чепецкого химического комбината. Рос. хим. ж. 2008; LII (3): 13-23.
[Baskin Z.L., Shabalin D.A., Vyrazhejkin E.S., Dedov S.A. Range, properties and applications of fluoropolymers Kirov-Chepetsk Chemical Plant; Russian Journal of General Chemistry.2008; LII(3): 13-23 (in Russian)]
15. Севастьянов В.И. Биосовместимые материалы. Под ред. В.И. Севастьянова, М.П. Кирпичникова. М.: Медицинское
информационное агентство, 2011. 560 с. [Sevast'janov V.I. Biocompatible materials, Ed. Sevastianov V.l., Kirpichnikov M.P. M.: Medical News Agency; 2011; 356 (in Russian)]
16. Малкин А.Я., Аскадский А.А., Коврига В.В. Методы измерения механических свойств полимеров. М.:Химия, 1978. 336 с. [Malkin A.Y., Askadskii A.A., Kovriga V.V. Methods for measuring the mechanical properties of polymers. M.: Chemistry, 1978. 336 р. (in Russian)]
17. Aasen T., Izpisüa Belmonte J.C. Isolation and cultivation of human keratinocytes from skin or plucked hair for the generation of induced pluripotent stem cells. Nat. Protoc.2010; 5 (2): 371-82.
18. Farrugia B.L., Brown T.D., Upton Z., Hutmacher D.W., Dalton P.D., Dargaville T.R. Dermal fibroblast infiltration of poly (е-caprolactone) scaffolds fabricated by melt electrospinning in a direct writing mode. Biofabrication. 2013; 5 (2): 025001
19. Саркисов Д.С., Перов Ю.М. Микроскопическая техника. М.: Медицина, 1996, с. 16-20.
[Sarkisov D.S., Perov Yu. M. Microscopic technique. M.: Medicine; 1996;544(in Russian)]
20. McGregor J.E., Staniewicz L.T., Guthrie Nee Kirk S.E., Donald A.M. Environmental scanning electron microscopy in cell biology. Methods Mol. Biol. 2013; 931: 493-516.
21. Штилман М.И. Полимеры медико-биологического назначения. Под ред. А.А. Картошкина. М.: ИКЦ «Академкнига», 2006. 400 с. [Shtilman M.I. Polymeric biomaterials. Ed. A.A. Kartoshkin. M.: ICC «Akademkniga»; 2006. 400 р. (in Russian)]
22. Zhu X., Chian K.S., Chan-Park M.B., Lee S.T. Effect of argon-plasma treatment on proliferation of human-skin-derived fibroblast on chitosan membrane in vitro. J. Biomed. Mater Res. A. 2005; 73 (3): 264-74.
23. Hsu S.H., Huang G.S., Feng F. Isolation of the multipotent MSC subpopulation from human gingival fibroblasts by culturing on chitosan membranes. Biomaterials. 2012; 33 (9): 2642-55.
24. Huang G.S., Dai L.G., Yen B.L., Hsu S.H. Spheroid formation of mesenchymal stem cells on chitosan and chitosan-hyaluronan membranes. Biomaterials. 2011; 32 (29): 6929-45.
25. Iyer S., Udpa N., Gao Y. Chitosan selectively promotes adhesion of myoblasts over fibroblasts. J. Biomed. Mater Res. Part A. Online Ahead of Print: 6 Jan 2014.
Поступила 01 июля 2014 г.
* * *
