CC BY
42
УДК 611-018.2+611-013:616-003.93
СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ВОЛОКНИСТОГО СОСТАВА РУБЦА ПОСЛЕ ВВЕДЕНИЯ АУТО- И ГЕТЕРОФИБРОБЛАСТОВ В РАНУ У МЫШЕЙ
Шаповалова Е.Ю., Морозова М.Н., Барановский Ю.Г., Бойко Т.А., Барановский А.Г.
Медицинская академия имени С.И. Георгиевского, ФГАОУ ВО «КФУ имени В.И. Вернадского» Министерство образования и науки Российской Федерации, Республика Крым, г. Симферополь, Россия.
Аннотация. Исследование выполнено на 30 белых половозрелых мышах линии С57/В1 в возрасте до 1 года. Вокруг и в дно хирургической модельной кожной раны в лопаточной области вводили 0,4 мл взвеси фибробла-стов в ростовой среде DMEM F12 (ПанЭко) в количестве 1,33 млн клеток. На 23-25 сутки рубец заливали в парафин, окрашивали гематоксилином и эозином, а также по Вейгерту-Ван-Гизону для визуализации эластических и коллагеновых волокон. Трансплантация в хирургическую рану взвеси гетеро- или аутофибробластов уменьшает срок эпителизации раны на одни сутки, на 23-и сутки заживления раны увеличивает толщину эпидермиса на 16,39% и 21,09%, снижает площадь коллагеновых волокон на 16,66% и 30,30% и снижает площадь кровеносных капилляров на 21,8% и 34,96% соответственно. Наилучшие морфологические характеристики эпидермиса и фиб-розирующейся грануляционной ткани рубец имеет после введения аутофибробластов. Ключевые слова. фибробласт, рубцы, регенеративная медицина.
Введение. Регенерация ран подразумевает 2 типа биологических процессов, которые могут спровоцировать патологическое заживление: отек и грануляции. Они являются нормальными и обусловливают системные события - адаптацию и морфогенез. При патологическом пути заживления ран эти два главных феномена, зависящих от клеток (в основном фибробластов) и продукции ими молекул основного вещества и волокон межклеточного вещества, отклоняются от нормы. Если продукция межклеточного вещества интенсивна, а ферментов, разрушающих его избыток недостаточна, развивается грубый гипертрофический рубец. Если созревание межклеточного вещества неполное, то это проявляется келоидным рубцом. Решающим звеном признано изменение функции фибробластов, регуляция которой во многом мало понятна и требует дальнейшего пристального изучения. Ни один из современных способов профилактики образования патологических рубцов после хирургического
вмешательства не в состоянии кардинально повлиять на функцию фибробластов, поэтому предложено так много способов профилактики и лечения [1].
Одним из перспективных современных методов лечения длительно незаживающих ран, когда собственного регенеративного потенциала недостаточно, и имеющихся патологических рубцов, является использование различных культур эмбриональных фибробластов [2] и мезенхимных стволовых клеток (МСК) [3]. В первом случае привлекает факт о безрубцовом заживлении ран в период гестации у млекопитающих и человека [4], во втором случае - возможность МСК дифференцироваться в различные клетки регенеративного каскада [5].
Как известно, образование рубца - неизбежное следствие любой хирургической операции [6]. Проблема трансплантации собственных или гетерогенных дермальных фибробластов, как ключевого фактора репаративной регенерации, в
свежую операционную рану кожи с целью профилактики патологического рубцевания актуальна и не получила должного освещения в морфологических и клинических исследованиях.
Цель исследования. Оценить морфологическое строение, коллагенообразование и ангиоге-нез в новообразованных рубцах после введения ауто- и гетерофиброластов в экспериментальную первичную хирургическую рану.
Материал и методы Исследование выполнено на 30 белых половозрелых мышах линии С57/В1 в возрасте до 1 года, которые содержались в виварии Медицинской академии имени С.И. Георгиевского. Животные были разделены на контрольную группу в составе 10 особей и две экспериментальные группы: первую и вторую по 10 особей в каждой. Эксперименты проводили со следованием всем принципам гуманности, содержащихся в директиве Европейского Сообщества (86/609/ЕС), и в соответствии с «Правилами выполнения работ с привлечением экспериментальных животных». Во всех группах операцию по моделированию кожной раны в лопаточной области производили после внутрибрюшинного введения 2,5% раствора авертина 0,3-0,4 мл. Кожу иссекали в виде круга диаметром 12 мм, к краям раны кожно-фасциальными узловыми швами фиксировалось силиконовое кольцо с наружным диаметром 12 мм атравматичным шовным материалом «Полипропилен» 5-0 для исключения возможности эпителизации раны и закрытия её мобильной кожей области спины. Из иссеченной кожи мышей выделяли фибробласты в условиях стерильного бокса с ламинарным потоком воздуха. Кусочки кожи после ферментативного удаления эпидермиса помещали в среду DMEM F12 (ПанЭко) и измельчены сосудистыми ножницами до размера 1-2 мм. Затем к кусочкам ткани добавляли равные объемы растворов коллагеназы I типа (200 ед/мл, Sigma) и дис-пазы (30 ед/мл) (Gibco). Полученную смесь инкубировали в течение 1 часа при 370 С и постоянном перемешивании. После фильтрации суспензии через фильтр диаметром 0,40мкм и центрифугирования в течение 7 мин. при 1000 об/мин, фибробласты ресуспендировали и культивировали в среде DMEM F12 (ПанЭко) с добавлением 10% телячьей сыворотки и 50 ед./мл пенициллина - стрептомицина (ПанЭко) в чашках Петри в инкубаторе при 370 и концентрации СО2 - 5% до достижения 100% конфлюента. Для
пересева клеток использовали 0,25% трипсин-0,02% ЭДТА.
В экспериментальных группах интраопера-ционно в дно раны и вокруг нее вводили 0,4 мл взвеси фибробластов 1-го или 2-го пассажа в ростовой среде DMEM F12 (ПанЭко) в количестве 1,33 млн клеток. В первой экспериментальной группе вводили гетерофибробласты, во второй -аутофибробласты.
На 23-й день после операции у мышей всех групп интраоперационно иссекали образовавшийся рубец и фиксировали 10% забуференным формалином для морфологического исследования. Материал заливали в парафин и окрашивали гематоксилином и эозином, а также по Вейгерту-Ван-Гизону для визуализации эластических и коллагеновых волокон. Морфологическое исследование гистологических препаратов проводили с помощью светооптического микроскопа OLIMPUS СХ-31 с цифровой камерой OLIMPUS 35050Z. Толщину эпидермиса, количество микрососудов в срезах, площадь коллагеновых волокон и микрососудов в дерме рубцов измеряли с помощью программы "ImageJ". Статистическую обработку цифровых данных проводили с использованием лицензионного программного обеспечения Microsoft Office Excell и Statistica 10.0
Результаты исследования и их обсуждение. У мышей контрольной группы на 23 сутки после операции по созданию модельной раны образовался нежны белый рубец с четкими границами. Силиконовое кольцо отпало на 12-й день после операции одновременно с полной эпителизацией раны. На срезах рубца эпидермис представлен не полностью сформированным многослойным эпителием толщиной 62,32+0,12мкм (таблица 1). Зернистый слой имеется на некоторых участках, роговой слой очень тонкий (рис. 1А). Дерма рубца не образует сосочков вдающихся в эпидермис и граница между эпидермисом и дермой ровная. Сосочковый и сетчатый слои дермы не разграничиваются и образованы равномерно локализованными коллагеновыми волокнами, между которыми присутствуют клетки, преимущественно фибробласты (рис. 2А). Коллагеновые волокна занимают в среднем 81,52+0,22% от площади дермы. Эластические волокна отсутствуют. Кровеносные капилляры не расширены и их площадь составляет в среднем 2,66+0,12%.
Волосяные фолликулы в зоне рубца не обнаружены.
Рис. 1. Рубцы кожи мыши. А - контрольная группа; Б - первая экспериментальная группа; В - вторая экспериментальная группа. 1 - эпидермис; 2 - кровеносный сосуд; 3 - волосяной фолликул; 4 - фиб-робласты; 5 - коллагеновые волокна. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение: ок. 10 об. 10.
Таблица 1 Количественные характеристики рубцов кожи мышей контрольной и экспериментальных групп
Рубцы кожи Толщина эпидермиса в мкм Площадь дермы на срезах в мкм Площадь сосудов в дерме в % Площадь коллаге-новых волокон в дерме в %
Рубцы кожи в контрольной группе 62,32+0,12 76800+1,10 2,66+0,12 81,52+0,22
Рубцы кожи в первой экспериментальной группе 74,54+14 23715,94+1,05 2,08+0,16 67,94+0,15
Рубцы кожи во второй экспериментальной группе 78,98+0,17 766096,83+1,13 1,73+0,07 56,63+0,16
У мышей первой экспериментальной группы эпителизация раны и отпадение силиконового кольца зафиксировано на один день раньше, чем в контроле, на 11-е сутки после операции и введения взвеси гетерофибробластов в ростовой среде ДМЕМ F12. Образовался более плотный белый рубец с четкими границами. Толщина эпидермиса на 16,39% больше, чем в контроле, и составляет 74,54+14 мкм. На 25-е сутки эпидермис полностью сформирован и состоит из четырех слоев. В области прикрепления силиконового кольца имеется струп, под которым эпидермис отсутствует (рис. 2А). Дерма рубца образует сосочки, вдающиеся в эпидермис. Волосяные фолликулы на стадии формирования. Сосочковый и сетчатый слои дермы слабо разграничиваются. Непосредственно под базальной мембраной эпидермиса присутствует фиброзирующаяся соединительная ткань, где коллагеновые волокна образуют тонкую сеть (рис. 2Б). Более глубокий
сетчатый слой состоит из толстых коллагеновых волокон с небольшим количеством фибробла-стов. Коллагеновые волокна занимают в среднем 67,94+0,15% от площади дермы, что на 16,66% меньше, чем в контрольной группе. Эластические волокна отсутствуют во всех участках дермы. Площадь кровеносных капилляров уменьшилась на 21,8% по сравнению с контролем.
У мышей второй экспериментальной группы на фоне введения взвеси аутофибробластов в ростовой среде ДМЕМ F12 эпителизация раны и отпадение силиконового кольца зафиксировано также на один день раньше, чем в контроле. На 23-и сутки толщина эпидермиса рубца, имеющего все четыре слоя кератиноцитов (рис. 1В), составила 78,98+0,17 мкм, что на 21,09% толще, чем в контрольной группе (см. табл. 1). В дерме рубца под базальной мембраной эпидермиса ле-
жит тонкий слой рыхлой волокнистой соединительной ткани с нежной сеткой коллагеновых волокон (рис. 2В). Глубже эти волокна формируют толстые преимущественно параллельно ориентированные пучки. Коллагеновые волокна и кровеносные капилляры занимают в среднем 56,63+0,16% и 1,73+0,07% площади дермы, что на 30,3% и 34,96% соответственно меньше, чем в контрольной группе. Эластические волокна отсутствуют во всех участках дермы.
Рис. 2. Рубцы кожи мыши. А - контрольная группа; Б - первая экспериментальная группа; В - вторая экспериментальная группа. 1 - эпидермис; 2 - кровеносный сосуд; 3 - волосяной фолликул; 4 - фибробласты; 5 - коллагеновые волокна. Окраска по Вейгерту-Ван-Гизону. Увеличение: ок. 10 об. 40.
Раневой процесс начинается сразу же после повреждения тканей. Все стадии заживления раны состоят из упорядоченной хронологической последовательности событий, охарактеризованных специфическим приходом специализированных клеток в рану. Фибробласты мигрируют из окружающей дермы в рану на 4-е сутки, где начинают синтезировать большое количество белков внеклеточного матрикса, различных факторов роста и ферментов. После наработки коллагенового матрикса большая часть фиб-робластов разрушается за счет апоптоза и происходит постепенный переход от грануляционной ткани к формированию рубца [7]. Исследования ряда авторов выявило, что общее количество фибробластов и их пролиферативная способность в дерме кожи взрослого человека относительно не велики и с возрастом прогрессивно уменьшаются [8]. Введение в первичную рану активных фибробластов изменяет сроки заживления и меняет характеристики рубца в лучшую сторону.
Выводы. 1. Трансплантация в хирургическую рану взвеси гетеро- или аутофибробластов уменьшает срок эпителизации раны на одни сутки, на 23-и сутки заживления раны увеличивает толщину эпидермиса на 16,39% и 21,09%, снижает площадь коллагеновых волокон на 16,66% и 30,30% и снижает площадь кровеносных капилляров на 21,8% и 34,96% соответственно.
2. Наилучшие морфологические характеристики эпидермиса и фиброзирующейся грануляционной ткани имеет рубец после введения аутофибробластов.
Работа поддержана проектом академической мобильности «РНИЭМ» ФГАОУ ВО «КФУ имени В.И. Вернадского» и выполнена с использованием инфраструктуры ФГБУН «Институт цитологии РАН».
ЛИТЕРАТУРА
1. Carantino I,. Florescu I.P., Carantino A. Overview about the keloid scars and the elaboration of a non-
invasive, unconventional treatment // J Med Life. 2010. Vol. 3. N2. P. 122-127.
2. Prospects of use human fetal fibroblasts in the treatment of various etiology wounds / Kolokol'tseva T.D., Iurcnenko N.D., Kolosov N.G., Nechaeva E.A., Shumakova O.V., Khrtisto S.A. // Vestn Ross Akad Med Nauk. 1998. N3. P. 32-35.
3. Wound therapy by marrow mesenchymal cell transplantation / Yoshikawa T., Mitsuno H., Nonaka I., Sen Y., Kawanishi K., Inada Y., Takakura Y., Okuchi K., Nonomura A. // Plast Reconstr Surg. 2008. Vol. 121. N 3. P. 860-877.
4. Namazi M.R., Fallahzadeh M.K., Schwartz R.A. Strategies for prevention of scars. What can we learn from fetal skin? // Int J Dermatol. 2011. Vol, 50, N 1. - P. 5051.
5. Lau K., Paus R., Tiede S., Day P., Bayat A. Exploring the role of stem cells in cutaneus wound healing // Exp Dermatol. - 2009. Vol. 18. N 11. P. 921-933.
6. Белоусов А.Е. Рубцы и их коррекция. С-Пе-тербург., "Командор-SPB", 2005. 348 с.
7. Дермальный эквивалент на основе фибрина и восстановление соединительной ткани в результате его трансплантации на раны экспериментальных животных / Юдинцева Н.М., Самусенко И.А., Блинова М.И., Пинаев Г.П. // Аутологичные стволовые клетки: экспериментальные исследования и перспективы клинического применения / Под редакцией В.А. Ткачука. - М.: Литтерра, 2009. - С. 209-221.
8. Age-related changes in the number of CD45+ cells in human dermis / V.V. Petrov [et al.] // Adv Gerontol. 2012. Vol. 25, N 4. P. 598-603.
THE COMPARATIVE CHARACTERISTIC OF SCAR FIBER COMPOSITION AFTER IMPLANTATION OF AUTO- AND HETEROFIBROBLASTS INTO THE WOUND FOR MICE
Shapovalova Ye. Yu., Morozova M.N., Baranovskiy Yu.G., Boyko T.A., Baranovskiy A.G.
Medical Academy named by S.I. Georgievsky V.I. Vernadsky Crimean Federal University Ministry of Education and Science of Russia, 295006, Crimean Republic, Simferopol, Russia.
Annotation. The study was performed on 30 adult white mice C57 / B1 at the age of 1 year. Around and into the bottom of surgical skin wound model in the scapular region were administered 0.4 ml fibroblasts suspended in growth medium DMEM F12 (PanEco) in an amount of 1.33 million cells. On day 23-25 scar embedded in paraffin, stained with hematoxylin and eosin, and also by Weigert-Van-Gieson for visualizing elastic and collagen fibers. Transplantation in the surgical wound suspension hetero- or autofibroblastov shortens wound epithelialization for one day. At 23 day and wound healing increases epidermal thickness at 16.39% and 21.09%, reduces the collagen fibers in the area of 16,66 and 30%, 30% and reduces the area of the capillaries of 21.8% and 34.96% respectively. Best morphological characteristics of the epidermis and granulation tissue fibrosis has scar after administration autofibroblasts.
Key words. fibroblast, scars, regenerative medicine.
REFERENCES
1. Carantino I., Florescu I.P., Carantino A. Overview about the keloid scars and the elaboration of a non-invasive, unconventional treatment // J Med Life. 2010. Vol. 3. N2. P. 122-127.
2. Prospects of use human fetal fibroblasts in the treatment of various etiology wounds / Kolokol'tseva T.D., Iurcnenko N.D., Kolosov N.G., Nechaeva E.A., Shumakova O.V., Khrtisto S.A. // Vestn Ross Akad Med Nauk. 1998. N3. P. 32-35.
3. Wound therapy by marrow mesenchymal cell transplantation / Yoshikawa T., Mitsuno H., Nonaka I., Sen Y., Ka-wanishi K., Inada Y., Takakura Y., Okuchi K., Nonomura A. // Plast Reconstr Surg. 2008. Vol. 121. N 3. P. 860-877.
4. Namazi M.R., Fallahzadeh M.K., Schwartz R.A. Strategies for prevention of scars. What can we learn from fetal skin? // Int J Dermatol. 2011. Vol, 50, N 1. - P.50-51.
5. Lau K., Paus R., Tiede S., Day P., Bayat A. Exploring the role of stem cells in cutaneus wound healing // Exp Dermatol. - 2009. Vol. 18. N 11. P. 921-933.
6. Belousov A.E. Scars and their correction. St. Petersburg., "Commander-SPB", 2005. 348 p.
7. Dermal equivalent fibrin-based recovery and connective tissue as a result of his wounds on transplantation in experimental animals / Yudintseva N.M., Samusenko I.A., Blinova M.I., Pinaev G.P. // Autologous stem cells: experimental study and clinical application prospects / Edited by VA Tkachuk. - M .: Litterra, 2009. - P. 209-221.
8. Age-related changes in the number of CD45+ cells in human dermis / V.V. Petrov [et al.] // Adv Gerontol. 2012. Vol. 25, N 4. P. 598-603.
