CC BY
63
УДК 616.36-097-092.9
СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЦИТОХИМИЧЕСКОГО СОСТОЯНИЯ ПЕРИТОНЕАЛЬНЫХ И АЛЬВЕОЛЯРНЫХ МАКРОФАГОВ ПОТОМСТВА САМОК КРЫС С ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫМ ПОРАЖЕНИЕМ ПЕЧЕНИ
Г.В. Брюхин, Е.Ю. Шаврина
Челябинская государственная медицинская академия
Изучено влияние экспериментального хронического поражения печени (обусловленного введением гепатотропного яда Б(+) - галактозамина гидрохлорида) на цитохимическую активность перитонеальных и альвеолярных макрофагов потомства на разных этапах постнатального развития. Установлено, что патология гепатобилиарной системы матери обусловливает снижение функциональной активности макрофагальных клеток потомства, что отражается в подавлении лизосомальной и пероксидазной активности, а также снижении содержания кислой фосфатазы.
Ключевые слова: поражение печени, макрофаги, лизосомы, пероксидаза, кислая фосфатаза.
Введение. С позиции оценки системы резистентности человека огромное значение имеют клетки системы мононуклеарных фагоцитов (СМФ). Данные клетки, участвуя в процессе формирования и регуляции иммунного ответа, являются одним из элементов, от функциональной активности которого зависит интенсивность иммунной реакции и поддержание гомеостаза в организме [8]. В сложном комплексе биохимических, физиологических и морфологических изменений, в которых реализуется ответная реакция макрофагов, особая роль принадлежит лизосомальному аппарату и его важнейшим составляющим - кислой фосфатазе и пероксидазе. Данные лизосомальные ферменты играют одну из главных ролей в патофизиологии системного воспаления [7].
В связи с вышеизложенным целью настоящего исследования явилась оценка активности лизосомального аппарата альвеолярных и перитонеальных макрофагов потомства матерей с хронической патологией печени на разных стадиях по-стнатального онтогенеза.
Методика исследования. Работа проведена на белых лабораторных крысах Вистар (18 взрослых самок) и их потомстве (72 животных из 18 пометов) в различные сроки постнатального развития (на 15-е и 45-е сутки).
Исследование проводилось с учетом суточных и сезонных колебаний. При этом животные содержались в одинаковых условиях вивария и получали стандартный пищевой рацион. Контрольных и опытных животных на протяжении всего эксперимента содержали в пластиковых клетках при естественном освещении и неограниченном доступе к воде и пище.
Работа с экспериментальными животными проводилась строго в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных», утвержденными Приказом МЗ СССР № 755 от 12.08.77.
Исходя из поставленной цели экспериментальные животные были разделены на 2 группы. В 1-ю группу были выделены животные от ин-тактных родителей (контрольная группа). Во 2-ю группу вошло потомство от матерей с экспериментальным хроническим D-галактозаминовым поражением печени (опытная группа). Данную модель патологии печени создавали путем однократного внутрибрюшинного введения взрослым половозрелым самкам D(+) - галактозамина гидрохлорида («Sigma - G500», США) - на 0,9%-ном растворе натрия хлорида в дозе 250 мг/кг массы тела животного. Через 10 дней после введения галактоза-мина к самкам производилась подсадка здоровых самцов.
Поражение гепатобилиарной системы экспериментальных животных верифицировали с помощью морфологических (дискомплексация печеночных балок, расширение синусоидных капилляров, гидропическая и мелкокапельная вакуольная дистрофия гепатоцитов, очаговые некробиотиче-ские изменения гепатоцитов в различных отделах дольки, диффузная инфильтрация портальной и внутридольковой стромы нейтрофилами, лимфоцитами, макрофагами), биохимических (повышение активности ферментов АлАт, АсАт и ЛДГ, увеличение свободного билирубина, общего холестерина и триглицеридов) и иммунологических (повышение титра противопеченочных антител 1:640 и 1:1280) критериев.
Проблемы здравоохранения
В качестве объекта исследования были выбраны перитонеальные и альвеолярные макрофаги, которые получали с использованием общепринятых методик [4].
Для определения лизосомальной активности на стекло, содержащее монослой клеток, вносили
0,1 мл акридинового оранжевого (концентрация 2 мкг/мл), вызывающего избирательно красное окрашивание лизосом. После часовой инкубации при 37 °С клетки 2 раза отмывали раствором Хен-кса. Затем стекло вынимали и смотрели влажный препарат в люминесцентном микроскопе. С целью выявления пероксидазы мазки фиксировали в течение 1 мин в формалиновом спирте, затем на мазки на 4 мин наносили инкубационную смесь следующего состава: 40 мг бензидина, 10 мл 40%-ного спирта и 0,02 мл 3%-ного раствора перекиси водорода. В местах локализации пероксидазы в клетках выявлялись гранулы желтовато-коричневого или темно-коричневого цвета. Активность кислой фосфатазы изучали с помощью реакции азосочетания. Приготовленные мазки фиксировали 30 с в холодном 60%-ном водном ацетоне, а затем помещали на 1 ч при 37 °С в инкубационную среду, содержащую 10 мг нафтол-Л8-фосфата (растворенного в 1 мл диметилформамида), 50 мл 0,1 М ацетатного буфера и 50 мг прочного синего ВВ или КЯ. В результате в цитоплазме клеток появлялась краска синего или фиолетового цвета. При оценке лизосомальной и пероксидазной активности исследуемых фагоцитов макрофаги относили к одной из двух групп: 1) клетки, содержащие лизосо-мы (пероксидазу), т. е. акридиноранж-позитивные или пероксидазо-позитивные; 2) клетки, в которых лизосомы (пероксидаза) отсутствовали. Для количественного выражения результатов цитохимического исследования фермента кислой фосфатазы использовали средний цитохимический коэффициент (СЦК). Результаты обрабатывали статистически с использованием пакета прикладных компьютерных программ 8Р88-10.0. Полученные данные представляли в виде средней арифметической и ее стандартной ошибки (М ± т).
Результаты исследования. Общеизвестно, что неспецифическая резистентность организма человека во многом зависит от характера фагоцитар-
ных свойств мононуклеарных фагоцитов, тогда как эффективность фагоцитоза определяется прежде всего наличием в цитоплазме субклеточных структур - лизосом, содержащих целый комплекс гидролитических ферментов. Кроме того, согласно современным представлениям [6], лизосомам принадлежит центральное место в клеточном метаболизме.
В результате проведенного нами исследования было установлено, что в ходе постнатального онтогенеза у экспериментальных животных обеих групп происходят изменения численного состава клеток СМФ с различной степенью лизосомальной активности. Так, у крысят контрольной группы на 45-й день развития выявлено увеличение числа активных (т. е. содержащих лизосомы) перитонеальных и альвеолярных макрофагов соответственно в 1,10 и в 1,05 раза (по сравнению с 15-м днем). В подопытной группе на 45-й день количество макрофагов перитонеального экссудата возросло в 1,15, а легочных макрофагов - в 1,05 раза по сравнению с 15-м днем постнатального развития. В результате изучения влияния заболевания материнского организма на лизосомальную активность фагоцитов ее потомства было выявлено, что у потомства самок крыс с экспериментальным поражением печени на 15-й день произошло снижение числа активных перитонеальных макрофагов в 1,45 раза, а альвеолярных фагоцитов - в 1,41 раза по сравнению с контролем. На 45-й же день онтогенеза количество активных клеток перитонеального экссудата подопытных крысят снизилось в 1,38 раза, а легочных макрофагов - в 1,41 раза в отличие от контрольных величин соответствующего возраста (табл. 1).
В настоящее время известно более 40 веществ, продуцируемых микрофагами, тогда как основными ферментами клеток СМФ, реализующими переваривание образующихся фагосом, являются пероксидаза и кислая фосфатаза. Пероксидаза является ферментом, который наряду с кислородными радикалами и перекисью водорода составляет эффекторное звено кислородзависимого аппарата бактерицидности фагоцитов [3]. Рядом авторов установлено, что различия в степени активности и локализации пероксидазы макрофагов коррелируют
Таблица 1
Характеристика лизосомальной активности макрофагов различных компартментов у потомства самок крыс с экспериментальным поражением печени (М ± т)
Число акридиноранж-позитивных клеток
Группа Перитонеальные макрофаги Альвеолярные макрофаги
15-й день 45-й день 15-й день 45-й день
Контроль 75,30 ± 7,39 (п = 12) 83,2 ± 5,08 (п = 12) 82,5 ± 6,02 (п = 12) 86,6 ± 5,56 (п = 12)
Опыт 52,10 ± 3,03* (п = 10) 60,10 ± 4,20* (п = 10) 58,5 ± 11,16 (п = 10) 61,6 ± 4,43* (п = 10)
Примечание. Здесь, на рисунке и в табл. 2 * - результаты статистически достоверны по сравнению с контролем (р < 0,05).
86
Вестник ЮУрГУ, № 28, 2012
Брюхин Г.В., Шаврина Е.Ю.
Сравнительная характеристика цитохимического состояния перитонеальных и альвеолярных макрофагов...
30 25 20 15 10 5 0
Перитонеальные Альвеолярные Перитонеальные Альвеолярные
■ Контроль □ Опыт
Содержание пероксидазо-позитивных макрофагов у потомства экспериментальных животных
с их функциональным состоянием и завершенностью процесса фагоцитоза [5].
Исследование характера изменений распределения пероксидазы в цитоплазме перитонеальных макрофагов в ходе постнатального развития показало, что у крысят как контрольной, так и подопытной группы на 45-й день происходит снижение числа пероксидазо-позитивных макрофагов -соответственно в 1,47 и 2,48 раза по сравнению с 15-м днем. В результате исследования влияния экспериментального хронического поражения печени на содержание пероксидазы в перитонеальных фагоцитах было выявлено, что у потомства опытной группы на 15-й день постнатального онтогенеза происходит достоверное снижение числа пероксидазо-позитивных клеток в 1,71 раза по сравнению с контрольной группой. Аналогичная тенденция в изменении содержания исследуемого фермента в перитонеальных макрофагах наблюдается и на 45-й день развития. При этом в подопытной группе отмечено значительное достоверное снижение количества содержащих пероксидазу макрофагов в 2,89 раза в отличие от контрольных величин. Анализ возрастных изменений распределения пероксидазы в альвеолярных макрофагах выявил следующую закономерность: у контрольных крысят на 45-й день онтогенеза число перок-сидазо-позитивных клеток снизилось незначительно - в 1,33 раза по сравнению с предыдущим этапом. Количество же легочных фагоцитов подопытной группы животных, содержащих гликоген, на 45-й день постнатального развития сократилось в 1,75 раза (по сравнению с 15-м днем). Изучение влияния патологии гепатобилиарной системы матери на характер распределения пероксидазы в альвеолярных макрофагах потомства показало, что как на 15-й, так и на 45-й день онтогенеза число пероксидазо-позитивных клеток у потомства опытных животных достоверно снизилось в 7,27 раза и
9,55 раза соответственно по сравнению с аналогичными показателями контрольной группы животных (см. рисунок).
Кислая фосфатаза является маркерным лизо-сомальным гидролитическим ферментом, играющим важную роль в обеспечении защитных реакций организма.
В ходе исследования было установлено, что у крысят контрольной группы к 45-му дню в перитонеальных макрофагах выявлено увеличение СЦК в 1,09 раза, тогда как в опытной группе на 45-й день произошло снижение СЦК в 1,19 раза (по сравнению с предыдущим этапом). Анализ возрастных изменений содержания кислой фосфатазы в альвеолярных макрофагах выявил, что у контрольных крысят на 45-й день онтогенеза СЦК возрос в 1,22 раза по сравнению с 15-м днем. У опытных же животных СЦК на 45-й день увеличился незначительно - в 1,10 раза. У потомства матерей с экспериментальным поражением печени на всех сроках исследования произошло снижение СЦК перитонеальных макрофагов по сравнению с контролем. Так 15-й и 45-й день СЦК при выявлении кислой фосфатазы в перитонеальных фагоцитах у подопытных животных оказался достоверно ниже соответственно в 1,52 раза и 1,97 раза, чем в контроле. Аналогичная тенденция наблюдалась и при исследовании влияния патологии гепатобилиарной системы матери на содержание кислой фосфатазы в альвеолярных макрофагах потомства. Анализ данных показал, что как на 15-й, так и на 45-й день онтогенеза СЦК легочных фагоцитов у потомства опытных животных снизился в 1,58 и 1,75 раза соответственно по сравнению с аналогичными контрольными показателями (табл. 2).
Заключение. Таким образом, в ходе проведенного эксперимента было установлено, что экспериментальное поражение гепатобилиарной системы у самок крыс обусловливает отклонение по-
Проблемы здравоохранения
Таблица 2
Интенсивность цитохимической реакции на кислую фосфатазу в клетках СМФ потомства самок крыс в различные сроки постнатального развития (М ± т)
Группа СЦ К
Перитонеальные макрофаги Альвеолярные макрофаги
15-й день 45-й день 15-й день 45-й день
Контроль 1,32 і 0,13 (n = 12) 1,44 і 0,15 (n = 12) i,2S і 0,31 (n = 12) 1,56 і 0,13 (n = 12)
Опыт 0,S7 і 0,10* (n = 10) 0,73 і 0,19* (n = 10) 0,S1 і 0,12 (n = 10) 0,S9 і 0,17* (n = 10)
казателей от нормы функционального состояния макрофагов у потомства. Так, клетки СМФ у подопытных животных подвергаются существенным качественным изменениям: в перитонеальных и альвеолярных макрофагах на разных этапах пост-натального онтогенеза происходит снижение лизо-сомальной активности, угнетение пероксидазной активности, а также сокращение содержания кислой фосфатазы.
Одновременное снижение лизосомальной и пероксидазной активности, а также существенные сдвиги в активности основного маркера лизосом -кислой фосфатазы - наводят на мысль, что моделируемая патология печени, не оказывая непосредственного токсического действия на клеточную мембрану, вызывает все-таки дестабилизацию внутриклеточных мембранных структур и в первую очередь лизосомального аппарата. Общеизвестным является полифункциональность макрофагов, их активное участие в поддержании гомеостаза в организме, способность моментально включаться в развитие различных патологических процессов [2]. Именно поэтому нарушение лизо-сомальной активности макрофагов может привести к снижению восприимчивости организма к различным бактериальным и вирусным инфекциям и в целом привести к снижению неспецифической реактивности организма [i].
Литература
1. Барышева, С.В. Морфофункциональные особенности перитонеальных макрофагов у животных с экспериментальным гепатитом / С.В. Барышева, Г.В. Брюхин // Вестн. Челяб. гос. ун-та.
Серия «Биология». - 2008. - Вып. 1. - № 4. -С. 60-64.
2. Бахшинян, М.З. Изменения структуры и функции макрофагов селезенки в условиях злокачественного роста /М.З. Бахшинян, А.В. Азнаурян // Морфология. - 2004. - № 5. - С. 45-48.
3. Долгушин, И.И. Нейтрофильные внеклеточные ловушки и методы оценки функционального статуса нейтрофилов / И.И. Долгушин, Ю.С. Андреева, А.Ю. Савочкина. - М.: Изд-во РАМН, 2009. -208 с.
4. Иммунологические, цитохимические и биохимические методы исследования фагоцитирующих клеток: метод. рекомендации / под ред. Э.А. Имельбаевой. - Уфа: БГМИ, 1996. - 85 с.
5. Маслов, К.А. Бактерицидный эффект и активность миелопероксидазы макрофагов при персистировании микобактерий туберкулеза и лепры / К.А. Маслов // Вестник новых медицинских технологий. - 1999. - № 1. - С. 76-79.
6. Роль лизосомальных ферментов в генезе ведущих клинико-патофизиологических синдромов: факты и гипотезы /А.В. Ефремов, Л.А. Руяткина, О.В. Цыганкова, З.Г. Бондарева // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. - 2007. -№ 1. - С. 18-21.
7. Цыганкова, О.В. Лизосомальные ферменты. Новый взгляд на фундаментальные материи с позиций кардиолога / О.В. Цыганкова, Л.А. Руяткина, З.Г. Бондарева // Цитокины и воспаление. -2009. - № 4. - С. 11-17.
8. Шпак, С.И. Альвеолярные макрофаги при воздействии ксенобиотиков / С.И. Шпак, Ю.И. Шрам-ко // Морфология. - 2000. - № 6. - С. 66-68.
Поступила в редакцию 15 июня 2012 г.
SS
Вестник ЮУрГУ, № 2S, 2012
