CC BY
14"BicHUK стоматологИ", № 1, 2015
15. Bukharin O. V., Valyshev A. V. Microbe inhibitors of lyso-zyme. ZhMEI. 2006; 4: 8-13.
16. Lysenkova I. I., Abdusalamova B. F., Saakyan T. Sh. The
effectiveness of the use of "Hexalys" pills for the reduction of inflammatory phenomena in periodontal tissues. Dental Forum. 2008; 1: 6366.
17. Furdychko A. I., Knava O. E. The biochemical markers of inflammation and dysbiosis at the application on oral mucous membrane of rats with gel with phytolysozyme, adsorbed on chitosan. Visnyk stomatologii. 2012; 2(79): 22-25.
18. Levitsky A. P., Selivanskaya I. A., Lapinskaya A. P. [i dr.]. Lysozyme as feed additive. Zernovi produkty i kombikormy. 2012; 2(46): 45-47.
19. Levitsky A. P., Glazunov O. А., Meladze I. N. Influence of quertulin on condition of parodont in rats with experimental metabolic syndrome. Journal of Health Sciences. 2014; 4(11): 133-144.
20. Novik G. I., Astapovich N. I., Ryabaya N. E. The production of hydrolases and antibiotic resistance of lactobacilli and bifidobacilli. Prikladnaya biokhimiya i mikrobiologiya. 2007; 43 (2): 184-192.
21. Bazarnova M. A. Rukovodstvo po klinicheskoy laboratornoy diagnostike [Manual of Clinical Laboratory Diagnostics]. Ch. 1. Kiev, Vyshcha shkola,1981: 55.
22. Goryachkovskiy A. M. Klinicheskaya biokhimiya v laboratornoy diagnostike [The clinical biochemistry in laboratorial diagnostics] [3rd ed.]. Odessa, Ekologiya, 2005: 616.
23. The instruction to the set of reagents for the determination of triglycerides in blood serum and plasma with enzymatic colorimetric method / TU U 24.4-24607793-020-2003.
24. Levitsky A. P., Denga O. V., Makarenko O. A. [i dr.]. Biokhimicheskie markery vospaleniya tkaney rotovoy polosti: metodicheskie rekomendatsii [Biochemical markers of inflammation of oral cavity tissue: method guidelines]. Odessa, KP OGT, 2010:16.
25. Levitsky A. P., Denga O. V., Selivanskaya I. A. [ta in.]. The method of estimation of the degree of dysbiosis (dysbacteriosis) of organs and tissues. Patent of Ukraine 43140. IPC (2009) G01N 33/48. Application number u 200815092. Date of filling: 26.12.2008. Publ.: 10.08.2009. Bul. № 15.
26. Lapach S. N., Chubenko A. V., Babich P. N. Statisticheskiye metody v medico-biologicheskikh issledovaniyakh s ispolzovaniem Excel [Statistical methods in medical and biological research by using Excel]. Kiev, Morion, 2000: 320.
Поступила 16.02.15
благоприятно по сравнению с введением стволовых клеток, полученных из жировой ткани.
Ключевые слова: направленная регенерация, аутологичные стволовые клетки, костный мозг, жировая ткань, колла-пан.
В. Ф. Куцевляк, В. I. Куцевляк, О. А. Омельченко*, А. С. Забгрник*, I. В. Циганова
Харквська медична академ1я тслядипломно! освгги Лабораторш «В1рола»*
ПОР1ВНЯЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА ОСТЕОГЕННИХ ВЛАСТИВОСТЕЙ АУТОЛОГ1ЧНИХ КЛ1ТИН К1СТКОВОГО МОЗКУ ТА ЖИРОВО1 ТКАНИНИ КРОЛИКА В ЕКСПЕРИМЕНТ1
В результатi проведеного до^дження вивчет особливостi динамт регенерацп юсткових дефектiв нижньог щелепи на 16 кроликах породи Шиншила. Вводили стовбуровi mi-тини, вилучен з юсткового мозку та жировог тканини, у поеднанн з коллапаном в зону дiрчастого дефекту 3х3 мм. Встановлено, що направлена регенеращя юсткових дефек-тiв нижньог щелепи у експериментальних тварин з введен-ням стовбурових клтин юсткового мозку протжае найсп-риятливше, порiвняно з введенням стовбурових клтин жировог тканини.
Ключовi слова: спрямована регенеращя, аутологичн стов-буровi клтини, юстковий мозок, жирова тканина, колла-пан.
V. F. Kutsevlyak, V. I. Kutsevlyak, E. A. Omelchenko*, A. S. Zabirnyk*, I. V. Tsyganova
Kharkiv Medical Academy of Postgraduate Education Laboratory «Virola»*
COMPARATIVE CHARACTERISTICS OF THE OSTEOGENIC PROPERTIES OF AUTOLOGOUS STROMAL CELLS OF BONE MARROW AND ADIPOSE TISSUE OF RABBIT IN EXPERIMENT
УДК [616.314.18-002.4-003.93:612.112]-089-092.9
В. Ф. Куцевляк, д. мед. н., В. И. Куцевляк, д. мед. н., Е. А. Омельченко*, к. биол. н., А. С. Забирник*, И. В. Цыганова
Харьковская медицинская академия последипломного образования Лаборатория «Вирола»*
СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ОСТЕОГЕННЫХ СВОЙСТВ АУТОЛОГИЧНЫХ КЛЕТОК КОСТНОГО МОЗГА И ЖИРОВОЙ ТКАНИ КРОЛИКА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ
В результате проведенного исследования изучены особенности динамики регенерации костных дефектов нижней челюсти на 16 кроликах породы Шиншилла. Вводили аутологичные стволовые клетки, полученные из костного мозга и жировой ткани в сочетании с коллапаном, в зону дырчатого дефекта объемом 3х3 мм. Установлено, что направленная регенерация костных дефектов нижней челюсти экспериментальных животных с введением стволовых клеток, полученных из костного мозга, протекает наиболее
ABSTRACT
The study examined features of the dynamics of regeneration of bone defects of the mandible 16 Chinchilla rabbits. Administered autologous stromal cells derived from bone marrow and adipose tissue in combination with kollapan in zone holey defect in an amount 500 thousand. It was established that the regeneration of bone directed mandible experimental animals with administration of stromal cells derived from bone marrow proceeds more favorably then stromal cells from adipose tissue. Keywords: directed regeneration, autologous stem cells, bone marrow, adipose tissue, collapan.
Проблема регенерации костной ткани является одной из древнейших в медико-биологической науке. В последние десятилетия, в связи с ухудшением экологической обстановки, воздействием мощных стрессовых факторов на организм, отмечено снижение регенераторных возможностей костной ткани, и, следовательно, интенсивности регенераторных процессов.
Одним из перспективных и новых направлений коррекции процесса регенерации является применение биологически активных тканей эмбриофетапла-центарного комплекса, а также трансплантация ство-
© Куцевляк В. Ф., Куцевляк В. И., Омельченко Е. А., Забирник А. С., Цыганова И. В., 2015.
"В1сник стоматологИ", № 1, 2015
ловых клеток различного происхождения.
Ранее, в тканевой инженерии, использовались стромальные клетки костного мозга. Сейчас внимание привлекает жировая ткань, имеющая мезодермальное происхождение, хорошо развитую строму, она муль-типотентна [5, 6, 8, 9].
По сравнению со стромальными клетками костного мозга (СККМ) стромальные клетки жировой ткани (СКЖТ) имеют ряд преимуществ - они более доступны, выделяются в большем количестве, их способность дифференцироваться в остеогенном направлении меньше зависит от возраста донора [4,7,10].
Цель работы. Проанализировать морфологические изменения, происходящие в костной ткани челюсти кролика при использовании аутологичных стволовых клеток, полученных из костной и жировой ткани.
Материалы и методы. Аутологичные стволовые клетки костного мозга получали из бедренной кости экспериментальных животных. Аутологичные стволовые клетки жировой ткани получали из подкожного жира, полученного из паховой области животных.
Изучение процесса заживления костных дефектов размером 3х3мм проведено на 16 кроликах породы Шиншилла. 12 животных составили основную
группу, 4 - контрольную. Основная группа была поделена на четыре подгруппы по 3 кролика. Аутоло-гичные стволовые клетки, полученные из жировой ткани и костного мозга, на коллапановой подложке вводили в зону дырчатого дефекта нижней челюсти кроликов основной группы. Забой первой половины животных производили на 42, второй - на 90 сутки. Выделяли фрагменты челюстей с зоной регенерата, фиксировали в формалине и заключали в парафиновые блоки. Гистологические препараты готовили из фрагментов нижних челюстей и окрашивали гематоксилин-эозином и по Ван-Гизон.
Результаты собственных исследований. На 42 сутки после введения аутологичных СКЖТ на гисто-топограммах определялась зональность структуры регенерата с разделением на поверхностную и глубокую зоны.
Если в первой преобладала клеточно-волокнистая ткань с многочисленными капиллярами, во второй обнаруживалась сеть новообразованных костных трабекул с многочисленными остеобластами на поверхности, богатая клеточными элементами и кровеносными сосудами в межтрабекулярных пространствах (рис. 1).
Рис. 1. Формирование клеточных элементов остеоген-ной направленности в зоне регенерата после введения СК из жировой ткани с коллапаном на 42-е сутки. Окрашивание гематоксилин-эозин х 100.
Рис. 2. Гистотопограмма Введение СК из костного мозга с коллапаном на 42 сутки Окрашивание Ван-Гизон х100.
Рис. 3. Сравнительная характеристика репаративного остеогенеза костной ткани челюсти кролика при использовании аутологичных стволовых клеток, полученных из костной и жировой ткани на 42 сутки.
"Вicнuк стоматологИ", Ж 1, 2015
Coraacro мoрфoмeтричecким дaнным пocлe ввe-дeния ayтoлoгичныx CKЖT в cтрyктyрe рeгeнeрaтa 1 % зaнимaли ocтaтки гeмaтoмы в пoвeрxнocтнoй зo-нe, 55 % - клeтoчнo-вoлoкниcтaя ткaнь, 12 % - ocreo-идныe и 32 % нoвooбрaзoвaнныe мeлкиe ^arable трэ-бeкyлы.
Mикрocкoпичecки (риc. 2) га 42 cyтки пocлe ввe-дeния ayтoлoгичныx CKKM c кoллaпaнoм прoцeccы пeрecтрoйки в зoнe дeфeктa нижнeй чeлюcти имeли вbфaжeннbш xaparaep. В зoнe рeгeнeрaтa нэблюдэ-лжь пeриocтaльныe нacлoeния пo нижнeмy крэю чe-люcти. В aльвeoлярнoм oтрocткe, в cрaвнeнии c ^e-дыдущим нaблюдeниeм, измeнeний нe былo вbIявлe-нo. Пeриocтaльнoe кocтeoбрaзoвaниe coпрoвoждaлocь aктивнoй рeзoрбциeй кocтнoгo вeщecтвa oтлoмкoв и прoлифeрaциeй клeтoчныx элeмeнтoв.
Ha 42 cy^H ra гиcтoтoпoгрaммax пocлe ввeдeния ayтoлoгичныx CKKM c кoллaпaнoм из oбщeй плoщa-ди пeрecтрaивaющeгocя рeгeнeрaтa 1 % зaнимaли учэ-стки нeкрoтичecки измeнeнныx ткaнeй, клeтoчнo-вoлoкниcтaя ткэнь - 13 %, 4 % ocтeoиднaя ткэнь, 36 % мeлкoпeтлиcтaя кocтнaя ткэнь, 46% крyпнoпeтлиcтaя кocтнaя ткэнь (риc. 3).
Тэким oбрaзoм, га 42 cyтки в c^y^^pe pere^-рэтэ пocлe ввeдeния ayтoлoгичныx CKЖT c кoллaпa-
шм пpeoблaдaлa клeтoчнo-вoлoкниcтaя ткэнь xopoшo вacкyляpизoвaннaя, пoчти бeз лeйкoцитapнoй ин-фильтpaции, a зoны ocтeoгeнeзa зэнимэли глyбoкиe oтдeлы дeфeктa, a в групш живoтныx c ввeдeниeм CKKM нaблюдaлocь знaчитeльнoe yвeличeниe кге-тoчныx элeмeнтoв ocтeoгeннoгo xapaктepa зэ cчeт ш-pиocтaльнoгo кocтeoбpaзoвaния.
Ha 9O cyтки пocлe ввeдeния ayтoлoгичныx CKЖT c кoллaпaнoм ra гиcтoтoпoгpaммax, coглacнo мopфo-мeтpичecким дэнным, клeтoчнo-вoлoкниcтaя ткaнь cocтaвлялa в cтpyктype peгeнepaтa вceгo S %, a теть нoвooбpaзoвaнныx кocтныx тpaбeкyл 85 %, пpичeм 9 % из ниx имeли кpyпнo-пeтлиcтый xapaктep. В ш-pифepичecкиx yчacткax ceти кocтныx тpaбeкyл o6M-pyживaлocь фopмиpoвaниe нoвooбpaзoвaний юэрти-кaльнoгo cлoя, кoтopый зэнимэл 7 % (в^го 92 %).
Mикpocкoпичecки в peгeнepaтe кocти, пocлe ввe-дeния ayтoлoгичныx CKЖT c кoллaпaнoм, га 9O cyтки га o^e^mix yчacткax, пpeимyщecтвeннo вoкpyг фpaгмeнтoв из плacтинчaтoй тости oпpeдeлялacь лэ-кугаргая peзopбция c нaплacтoвaниями нoвooбpaзo-вaннoй кocтнoй ткэни пo пepиcтaльнoй и эндocтaль-шй пoвepxнocти и нeзнaчитeльнoй oчaгoвoй лeйкo-цитapнoй инфильтpaциeй гpaнyляциoннoй ткэни, o^ pyжaющeй эти пoля (pиc. 4.)
Риа 4. Ввeдeниe CK из жиpoвoй ткaни c кoллaпaнoм нэ 9O cxyEn. Учacтки лaкyнapнoй peзopбции вoкpyг фpaгмeнтoв плacтинчaтoй кocти c нaплacтoвaниями ш-вooбpaзoвaннoй кocтнoй ткэни в зoнe peгeнepaтa Ок-paшивaниe гeмaтoкcилин-эoзин x 1OO
Риc. 5. Ввeдeниe CK из кocтнoгo мoзгa c кoллaпaнoм нэ 9O cyrea Интeнcивнoe кocтeoбpaзoвaниe зэ cчeт фopмиpoвaния ceти мeлкoпeтлиcтыx и кpyпнoпeтлиcтыx тpaбeкyл в зoнe peгeнepaтa. Oкpaшивaниe Вaн-Гизoн x1OO.
Риc. 6. Cpaвнитeльнaя xapaктepиcтикa peпapaтивнoгo ocтeoгeнeзa кocтнoй ткaни чeлюcти кpoликa при иcпoльзoвaнии ayro-лoгичныx cтвoлoвыx клeтoк, пoлyчeнныx из tomtom и жиpoвoй ткэни нэ 9O cyrea
"BicHUK стоматологИ", № 1, 2015
Микроскопически на 90 сутки после введения аутологичных СККМ с коллапаном развитие остеогене-за имело более выраженный характер, что приводило к интенсивному костеобразованию и восстановлению целостности кости нижней челюсти, но с наличием тех компонентов (сеть мелкопетлистых и крупнопетлистых трабекул), которые будут подвергаться окончательной перестройке еще на протяжении длительного периода времени (рис. 5.)
На 90 сутки на гистотопограммах после введения аутологичных СККМ с коллапаном обнаруживалась, согласно морфометрическим данным, целостная структура из новообразованной костной ткани, в которой 38 % занимает мелкопетлистая сеть костных трабекул, 46 % - крупнопетлистая сеть костных трабекул, 16 % занимал кортикальный слой, который без четкой границы формировался из сети костных трабе-кул (рис. 6).
Таким образом, в регенерате кости, после введения аутологичных СКЖТ с коллапаном в период с 42 до 90 суток определялось существенное качественное изменение темпов остеогенеза в структуре регенерата, что привело к значительному увеличению новообразованных костных структур.
Введение аутологичных СККМ в зону дырчатого дефекта экспериментальным животным в сочетании с коллапаном на 90 сутки в зоне регенерата создавали условия для более интенсивного развития остеогенеза и на этой основе приводили к интенсификации про-лиферативных процессов и процессов дифференциации по остеогенному типу.
Выводы. 1. Введение аутологичных СККМ в сочетании с коллапаном усиливает восстановительные процессы в зоне регенерата и приводит к более быстрому формированию новообразованной костной ткани, чем приведении СКЖТ.
2. Введение аутологичных СКЖТ с коллапаном в зону регенерата также во все сроки исследований оказывали влияние на перестройку в дифференцированные костные структуры. Однако полноценного восстановления дефекта кости не происходило, что свидетельствует о замедленных темпах морфогенеза за счет неравномерного распределения клеточных элементов для пролиферативных процессов.
Список литературы
1. Алексеева И. С. Первый опыт применения комбинированного клеточного трансплантата на основе мультипотентных стромальных клеток (МСК) из жировой ткани у пациентов с выраженным дефицитом костной ткани в области верхней и нижней челюстей / И. С. Алексеева, А.В. Волков, А.А. Кулаков, А. С. Гри-горьян [и др.] //Материалы Всеросс. науч. школы-конф. для молодежи «Аутологичные стволовые клетки: экспериментальные и клинические исследования». - М., 2009. - С. 53.
2. Воложин А. А. Мультипотентные клетки жировой ткани: перспективы использования в челюстно-лицевой хирургии / А.А. Воложин, Е.В. Киселева, Т.Г. Калашникова // Кафедра. - 2007. - № 6. - С. 20-25.
3. Карпюк В. Б. К изучению свежевыделенных - аутологичных стромальных клеток подкожной жировой клетчатки для регенерации биологических тканей / В. Б. Карпюк, М. Д., Перова М. Г. Шубич // Институт стоматологии. - 2009 - N° 3 - С. 74-76.
4. Стромальные клетки костного мозга, жировой ткани и кожи человека в ходе экспансии, иммунофенотип и дифференциро-вочный потенциал мезенхимальных стволовых клеток / А. Ю. Петренко, Ю. А. Петренко, Н.Г. Скоробогатова [и др.] // Трансплантолопя. - 2008. - Т. 10, №1. - С. 84-86.
5. Савченкова И. П. Дифференцировка мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток, выделенных из костного мозга и подкожно жировой клетчатки, в клетки костной ткани / И. П. Савченкова, М. С. Ростовская, Н. И. Чупикова, С. З. Шарифул-лина // Цитология. - 2008. - №5. - С. 855-860.
6. Сергеев В. С. Иммунологические свойства мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток / В. С. Сергеев // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. - 2005. - N° 2. - С. 39-42.
7. Трактуев Д. О. Стромальные клетки жировой ткани -пластический тип клеток, обладающих высоким терапевтическим потенциалом / Д. О. Трактуев, Е. В. Парфенова, В. А. Ткачук, К. Л. Марч // Цитология - 2006. - С. 83-94.
8. Cao Y. Zhao human adipose tissue- derived stem cells differentiate into endothelial cells in vitro and improve postnatal neovascularization in vivo/ Y. Cao, Z. Sun, I. Iiao, Y. Meng, G. Han // Biochem biophys res commun. - 2005. - P. 370-379.
9. Adipose-Derived Stem Cells for Regenerative Medicine / J. M. Gimble, A. J. Katz, B. A. Bunnell [et al] // Circulation Research -2007. - №100. - Р.1249-1260.
10. Rubina K. Adipose stromal cells stimulate angiogenesis via promoting progenitor cell differentiation, secretion of angiogenic factors, and enhancing vessel maturation / K. Rubina, N. Kalinina, A. Eflmenko, Т. Lopatina, V. Melikhova [et al.] // Tissue Eng Part A. -2009. - № 15.(8). - P. 2039-2050.
REFERENCES
1. Alekseeva I. S., Volkov A.V., Kulakov A.A., Grigoryan
A.S. i dr. Pervyiy opyit primeneniya kombinirovannogo kletochnogo transplantata na osnove multipotentnyih stromalnyih kletok (MSK) iz zhirovoy tkani u patsientov s vyirazhennyim defitsitom kostnoy tkani v oblasti verhney i nizhney chelyustey. [The first experience of the combined cell transplant on the basis of multipotent stromal cells (MSCs ) from adipose tissue in patients with severe deficiency of bone tissue in the upper and lower jaws]. Materialyi Vseross. nauch. shkolyi-konf. dlya molodezhi «Autologichnyie stvolovyie kletki: eksperimentalnyie i klinicheskie issledovaniya. M., 2009:53.
2. Volozhin A. A. Kiseleva E. V., Kalashnikova T. G. Multipotent adipose tissue cells: prospects for use in oral and maxillofacial surgery. Kafedra. 2007; 6: 20-25.
3. Karpyuk V. B., Perova M. D., Shubich M. G. By studying the freshly - autologous stromal cells of subcutaneous fat for regeneration of biological tissues. Institut stomatologii. 2009; 3: 74-76.
4. Petrenko A. Yu., Petrenko Yu. A., Skorobogatova N. G. i dr. Bone marrow stromal cells , adipose tissue and skin of the person in the course of expansion, the immunophenotype and differentiation potential of mesenchymal stem cells. TransplantologIya. 2008; 10 (1): 8486.
5. Savchenkova I. P., Rostovskaya M. S., Chupikova N. I.,
Sharifullina S. Z. Differentiation of multipotent mesenchymal stromal cells isolated from the bone marrow and subcutaneous adipose tissue in bone cells. Tsitologiya. 2008; 5 (10): 855-860.
6. Sergeev V. S. Immunologicheskie svoystva multipotentnyih mezenhimalnyih stromalnyih kletok. [Immunological properties of multipotent mesenchymal stromal cells]. Kletochnaya transplantologiya i tkanevaya inzheneriya. 2005: 39-42.
7. Traktuev D. O., Parfenova E. V., Tkachuk V. A., March K. L. Adipose tissue -derived stromal cell - cell type plastic possessing a high therapeutic potential. Tsitologiya 2006; 83-94.
8. Cao Y., Sun Z, Iiao I., Meng Y., Han. G Zhao human adipose tissue- derived stem cells differentiate into endothelial cells in vitro and improve postnatal neovascularization in vivo. Biochem biophys res commun. 2005; 370-379.
9. Gimble J. M., Katz A.J., Bunnell B. A. Adipose-Derived Stem Cells for Regenerative Medicine. Circulation Research, 2007; 100: 1249-1260.
10. Rubina K., Kalinina N., Eflmenko A., Lopatina Т., Melikhova V. [et al.] Adipose stromal cells stimulate angiogenesis via promoting progenitor cell differentiation, secretion of angiogenic factors, and enhancing vessel maturation. Tissue Eng Part A. 2009; 15(8): 2039-2050.
Поступила 09.02.15
