CC BY
0Южно-Российский онкологический журнал. 2024. Т. 5, № 1. С. 25-33 4.0
https://doi.org/10.37748/2686-9039-2024-5-1-3
https://elibrary.ru/kcljwh
Южно-Российский
онкологический журнал 3.1.6. Онкология, лучевая терапия
South Russian Journal
of Cancer
ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ
Сравнительная характеристика ортотопической и гетеротопической
Tом 5
№ 1, 2024
моделей in vivo рака молочной железы человека
И. С. Ляшенко, М. В. Романова, А. С. Гончарова, Д. В. Ходакова, А. В. Галина, С. В. Гурова,
С. Ю. Филиппова, Ю. С. Шатова
ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации,
г. Ростов-на-Дону, Российская Федерация
fateyeva_a_s@list.ru
РЕЗЮМЕ
Цель исследования. Оценка приживления и динамики роста ксенографтов рака молочной железы (РМЖ) при
ортотопической и подкожной инъекции с использованием различных типов биологического материала, а также
разработка адекватной модели РМЖ для дальнейших исследований.
Материалы и методы. Использовали дезагрегированный фрагмент опухоли, полученной от пациентки, паспорти-
зированную клеточную линию РМЖ ВТ20 – карцинома молочной железы человека; первичную клеточную линию
карциномы молочной железы человека. В качестве животных-реципиентов использовали самок иммунодефицитных
мышей линии Balb/c Nude в количестве 36 голов. В работе были разработаны подкожные и ортотопические модели
РМЖ. Наблюдали рост опухоли в течение 28 суток с момента инъекции и осуществляли замеры опухолевых узлов
2 раза в неделю до конца эксперимента. Результаты оценивали с использованием медианы и процентилей. Для
оценки достоверности различий использовали непараметрический критерий Манна-Уитни.
Результаты. В ходе данной работы была определена динамика роста опухолевых узлов при инъекции в различные
сайты. Наиболее успешной, при подкожной инъекции, являлась инъекция опухолевых клеток, паспортизированной
линии ВТ20. На момент окончания эксперимента медиана опухолевых узлов данной группы составила 100,32 мм³.
При анализе динамики роста опухоли при ортотопической инъекции опухолевого материала было выявлено, что
в медиана объема опухолевых узлов в группе с паспортизированной культурой клеток ВТ20 и первичной культурой
клеток достигала сходных значений – 149,22 и 148,25 мм³. Было выявлено, что как при инъекции клеточных линий,
так и клеточной суспензии опухолевые узлы достигали значимо большего объема при ортотопической инъекции.
Заключение. Нами была получена опухолевая модель РМЖ при различных способах имплантации материала и с воз-
можностью дальнейшего использования при тестировании новых фармакологических субстанций.
Ключевые слова: рак молочной железы, ксенографт, Balb/c Nude, карцинома, ВТ20, первичная опухоль, клеточная
линия
Для цитирования: Ляшенко И. С., Романова М. В., Гончарова А. С., Ходакова Д. В., Галина А. В., Гурова С. В., Филиппова С. Ю., Шатова Ю. С.
Оценка приживления и динамики роста ортотопической и гетеротопической in vivo модели рака молочной железы человека. Южно-Российский
онкологический журнал. 2024; 5(1): 25-33. https://doi.org/10.37748/2686-9039-2024-5-1-3, https://elibrary.ru/kcljwh
Для корреспонденции: Гончарова Анна Сергеевна – к.б.н., заведующий испытательного лабораторного центра, ФГБУ «Национальный
медицинский исследовательский центр онкологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Ростов-на-Дону, Российская
Федерация
Адрес: 344037, Российская Федерация, г. Ростов-на-Дону, ул. 14-я линия, д. 63
E-mail: fateyeva_a_s@list.ru
ORCID: https://orcid.org/0000-0003-0676-0871
SPIN: 7512-2039, AuthorID: 553424
Scopus Author ID: 57215862139
Соблюдение этических стандартов: все манипуляции в ходе эксперимента были выполнены с соблюдением этических принципов, установленных
Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (ETSN 123, Страсбург,
18 марта 1986 г). Протокол исследования № 19/123 от 3.08.2021 г. был одобрен локальным этическим комитетом ФГБУ «НМИЦ онкологии»
Минздрава России. Пациенткой было предоставлено письменное согласие на передачу биологического материала
Финансирование: финансирование данной работы не проводилось
Конфликт интересов: все авторы заявляют об отсутствии явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи
Статья поступила в редакцию 08.09.2023; одобрена после рецензирования 10.02.2024; принята к публикации 27.02.2024
© Ляшенко И. С., Романова М. В., Гончарова А. С, Ходакова Д. В., Галина А. В., Гурова С. В., Филиппова С. Ю., Шатова Ю. С., 2024
25
South Russian Journal of Cancer. 2024. Vol. 5, No. 1. P. 25-33
https://doi.org/10.37748/2686-9039-2024-5-1-3
https://elibrary.ru/kcljwh
ORIGINAL ARTICLE
Evaluation of engraftment and growth dynamics of orthotopic and heterotopic in vivo models
of human breast cancer
I. S. Lyashenko, M. V. Romanova, A. S. Goncharova, D. V. Khodakova, A. V. Galina, S. V. Gurova, S. Yu. Filippova, Yu. S. Shatova
National Medical Research Centre for Oncology, Rostov-on-Don, Russian Federation
fateyeva_a_s@list.ru
ABSTRACT
Purpose of the study. This work was to assess the engraftment and growth dynamics of breast cancer xenografts during
orthotopic and subcutaneous injection using various types of biological material, as well as to develop an adequate model
of breast cancer for further research.
Materials and methods. We used a disaggregated fragment of a tumor obtained from the patient, a certified breast cancer
cell line VT20 – human breast carcinoma; a primary human breast carcinoma cell line. Female immunodeficient mice of the
Balb/c Nude line in the amount of 36 animals were used as recipient animals. The subcutaneous and orthotopic models of
breast cancer were developed in this project. Tumor growth was observed for 28 days from the moment of injection and tumor
nodes were measured 2 times a week until the end of the experiment. Results were assessed using medians and percentiles.
The nonparametric Mann-Whitney test was used to assess the significance of differences.
Results. The dynamics of the growth of tumor cells when injected into various sites was determined in the process of this
work. The most successful in terms of a subcutaneous injection was the injection of tumor cells of the certified VT20 line. By
the end of the experiment, the median tumor node of this group was 100.32 mm³. The analysis revealed tumor dynamics with
orthotopic injection of tumor material, and the median volume of the tumor node in the group with the passport culture cell
VT20 and the primary culture cell reached the same value – 149.22 and 148.25. mm³. It was found that both the cell line and
the cell suspension were injected into tumor nodes that reached a significantly larger volume when injected orthotopically.
Conclusion. We have obtained a tumor model of breast cancer using various methods of material implantation and with the
possibility of further use in testing new pharmacological substances.
Keywords: breast cancer, xenograft, Balb/c Nude, carcinoma, VT20, primary tumor, cell line
For citation: Lyashenko I. S., Romanova M. V., Goncharova A. S, Khodakova D. V., Galina A. V., Gurova S. V., Filippova S. Yu., Shatova Yu. S. Evaluation of
engraftment and growth dynamics of orthotopic and heterotopic in vivo models of human breast cancer. South Russian Journal of Cancer. 2024; 5(1): 25-33.
(In Russ.). https://doi.org/10.37748/2686-9039-2024-5-1-3, https://elibrary.ru/kcljwh
For correspondence: Anna S. Goncharova – Cand. Sci. (Biol.), head of testing Laboratory Center, National Medical Research Centre for Oncology, Rostov-on-
Don, Russian Federation
Address: 63 14 line str., Rostov-on-Don 344037, Russian Federation
E-mail: fateyeva_a_s@list.ru
ORCID: https://orcid.org/0000-0003-0676-0871
SPIN: 7512-2039, AuthorID: 553424
Scopus Author ID: 57215862139
Compliance with ethical standards: All manipulations during the experiment were performed in compliance with the ethical principles established by the
European Convention for the Protection of Vertebrate Animals Used for Experiments or Other Scientific Purposes (ETSN 123, Strasbourg, March 18, 1986).
Study Protocol No. 19/123 dated 08/3/2021 was approved by the local Ethical committee National Medical Research Centre for Oncology. The patient
provided written consent for the transfer of biological material
Funding: this work was not funded
Conflict of interest: the authors declare that there are no obvious and potential conflicts of interest associated with the publication of this article
The article was submitted 08.09.2023; approved after reviewing 10.02.2024; accepted for publication 27.02.2024
26
Южно-Российский онкологический журнал 2024. Т. 5, № 1. С. 25-33
Ляшенко И. С., Романова М. В., Гончарова А. С., Ходакова Д. В., Галина А. В., Гурова С. В., Филиппова С. Ю., Шатова Ю. С. Оценка приживления и динамики
роста ортотопической и гетеротопической in vivo модели рака молочной железы человека
ВВЕДЕНИЕ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Рак молочной железы (РМЖ) является одним Опухолевый материал
из наиболее распространенных онкологических Для данной работы использовали дезагрегиро-
заболеваний в мире. Так в 2022 г. в России было ванный фрагмент опухоли, полученной от пациент-
зарегистрировано около 68 тысяч новых случаев ки Е. 75 лет, с диагностированным раком молочной
данного заболевания [1]. Согласно общемировой железы сТ4N2Mo St IIIB, паспортизированную кле-
статистике заболеваемость РМЖ составляет точную линию РМЖ ВТ20 – карцинома молочной
11,6 % всех случаев рака, и около 626 000 случаев железы человека; первичную клеточную линию
смерти от РМЖ, что составило 6,6 % зарегистри- карциномы молочной железы человека. Пациент-
рованных смертей [2]. Кроме того, данное заболе- кой было предоставлено письменное согласие на
вание является в высокой степени гетерогенным передачу биологического материала.
и подразделяется на 4 различных молекулярных Клеточные линии культивировали в питатель-
подтипа, различающихся по геномике опухоли ной среде RPMI‑1640 с добавлением фетальной
и типу клеток, из которых инициируется опухоль. бычьей сыворотки (FBS), в СО2 инкубаторе при
Так к этим подтипам относят люминальный температуре 37 °C и 5 % содержании углекислого
А, люминальный В, Her2‑положительный и трой- газа. Для получения первичной линии фрагмент
ной негативный РМЖ [3]. Для изучения различных опухоли, полученной от пациента, помещали в пита-
подтипов учеными используются несколько видов тельную среду с добавлением гентамицина (10 %),
модельных систем: in silico, in vitro и in vivo [4]. Каж- после чего обрабатывали этиловым спиртом (70 %).
дый из данных методов обладает рядом преиму- Фрагмент измельчали, центрифгировали 2 мин.
ществ и недостатков. При помощи модельной при 3000 об./мин., после обрабатывали раствором
системы in silico учеными ведется поиск потен- коллагеназы. Культивировали полученную суспен-
циальных антигенов-мишеней, анализ транскрип- зию в СО2 инкубаторе, после процеживали и цен-
томных данных [5], анализ связи генотипа с фено- трифугировали клетки 2 мин. при 3000 об./мин.
типом для поиска гена в качестве перспективной Далее промывали суспензию стерильным DMEM
мишени для терапии, а также поиск прямо или с 5 % FBS, переносили во флакон Т25 в 5 мл среды
косвенно связанных генов, выбранных в качестве DMEM + 10 % FBS. и культивировали клетки опи-
альтернативы найденной мишени [6] и компьютер- санным выше методом. Для получения суспензии
ное прогнозирование комплементарности обла- клеток из ксенографта фрагмент опухолевой ткани,
сти связывания между лекарственным средством полученной от пациентки, промывали в питатель-
и терапевтической мишенью против РМЖ [7]. При ной среде с антибиотиком (гентамицин), очищали
использовании системы in vitro исследователи от фрагментов некроза, соединительной ткани
анализируют механизмы резистентности опухо- и сосудов. После очищения опухолевый фрагмент
левых клеток к препаратам, оценивают влияние измельчали в системе для дезагрегации тканей
новых фармакологических субстанций на жизне- с использованием автоматизированной системы
способность опухолевых клеток [8], исследуют BD Medimachine (BD, USA), добавляя 1 мл питатель-
механизмы органотоксичности препаратов [9] ной среды RPMI‑1640. После измельчения опухоле-
и многое другое. В настоящее время также акту- вой ткани отбирали полученную суспензию и филь-
альна разработка опухолевых моделей РМЖ in vivo тровали через нейлоновые фильтры с диаметром
с целью исследования биомаркеров чувствитель- ячейки 70 мкм и вводили полученную суспензию
ности опухоли к препаратам, изучения новых схем клеток РМЖ в питательной среде эксперименталь-
лечения, исследования развития опухоли в орга- ным животным.
низме [10]. Животные-реципиенты
Цель исследования: оценка приживления и дина- В качестве животных-реципиентов использовали
мики роста ксенографтов РМЖ при ортотопической самок мышей линии Balb/c Nude в количестве 36
и подкожной имплантации с использованием раз- голов, весом 20–22 гр., возрастом 4 недели, приоб-
личных типов биологического материала, а также ретены в НПП «Питомник лабораторных животных»
разработка адекватной модели РМЖ для дальней- ФИБХ РАН. Животные содержались в SPF-услови-
ших исследований. ях испытательного лабораторного центра ФГБУ
27
South Russian Journal of Cancer 2024. Vol. 5, No. 1. P. 25-33
Lyashenko I. S., Romanova M. V., Goncharova A. S., Khodakova D. V., Galina A. V., Gurova S. V., Filippova S. Yu., Shatova Yu. S. Evaluation of engraftment and growth
dynamics of orthotopic and heterotopic in vivo models of human breast cancer
«НМИЦ онкологии» Минздрава России, в индиви- Результаты оценивали с использованием медианы
дуально вентилируемых клетках при температуре и процентилей. Для оценки достоверности разли-
21–23 °C, со свободным доступом к воде и корму. чий использовали непараметрический критерий
Животные были разделены на 6 групп по 6 мышей Манна-Уитни.
в каждой. В группе 1 были животные с подкожной
инъекцией дезагрегированного фрагмента опухоли; РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
группа 2 – подкожная инъекция культуры клеток И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
ВТ20; группа 3 – подкожная инъекция первичной
клеточной культуры клеток; группа 4 – ортотопиче- В ходе данной работы была определена дина-
ская инъекция дезагрегированного фрагмента опу- мика роста опухолевых узлов при различном ме-
холи; группа 5 – ортотопическая инъекция культуры сте инъекции. При подкожной инъекции наиболее
клеток ВТ20; группа 6 – ортотопическая инъекция успешной являлась инъекция опухолевых клеток
первичной клеточной культурой клеток. паспортизированной линии ВТ20. На момент окон-
Все манипуляции в ходе эксперимента были чания эксперимента медиана опухолевых узлов
выполнены с соблюдением этических принципов, данной группы составила 100,32 [91,15; 113,99] мм3.
установленных Европейской конвенцией о защите Рост опухолевых узлов отмечали у 5 животных
позвоночных животных, используемых для экс- в группе (83,33 %). В группе с подкожной инъек-
периментов или в иных научных целях (ETSN 123, цией первичной культуры опухолевых клеток на
Страсбург, 18 марта 1986 г). Протокол исследо- 28 день эксперимента медиана опухолевых узлов
вания № 19/123 от 3.08.2021 года был одобрен составила 88,79 [86,60; 90,86] мм3, что на 11,49 %
локальным этическим комитетом ФГБУ «НМИЦ меньше, чем в группе с введением паспортизиро-
онкологии» Минздрава России. ванной культуры. Наблюдали образование опухо-
Разработка модели РМЖ левых узлов у 5 животных (83,33 %). Наименьшая
Для создания подкожной опухолевой модели на динамика роста отмечалась в группе с дезагреги-
боку животного делали кожную складку, в которую рованной опухолью, где медиана опухолевого узла
вводили 0,3 мл клеточной суспензии в питательной составила 41,28 [32,96; 44,73] мм3, что на 58 % мень-
среде RPMI‑1640. ше, чем в группе с паспортизированной культурой
Для создания ортотопической модели животных клеток. Опухолевые узлы наблюдали у 4 животных
вводили наркоз с использованием двухэтапной в группе (66,67 %). Данные о динамике роста под-
анестезии: премедикация ксилазином (20 мг/кг) кожных опухолевых узлов представлены на рис. 1.
и наркотизация золетилом (50 мг/кг). Наркотизи- При ортотопической инъекции опухолевого ма-
рованным животным вводили в жировую ткань териала было выявлено, что в данном варианте
молочной железы суспензию опухолевых клеток роста медиана объема опухолевых узлов в груп-
в объеме 0,2 мл в питательной среде RPMI‑1640. пе с паспортизированной культурой клеток ВТ20
Каждому животному вводили 3*107 клеток. и первичной культурой клеток достигала сходных
Наблюдали рост опухоли в течение 28 суток с мо- значений – 149,22 [145,43; 153,58] и 148,25 [144,09;
мента инъекции и осуществляли замеры опухоле- 149,81] мм3. При данной имплантации рост опухо-
вых узлов 2 раза в неделю до конца эксперимента. левых узлов наблюдали у всех 6 животных в груп-
Объем опухолевых узлов вычисляли по формуле: пах (100 %). В группе с инъекцией дезагрегирован-
V = (L*W*H) / 6*π, где ной опухоли медиана объема опухолевых узлов
V – объем опухолевого узла; L – длина опухоле- на 28 сутки эксперимента составила 73,24 [70,11;
вого узла; W – ширина опухолевого узла; H – высота 78,19] мм3, а наличие опухолевых узлов наблюдали
опухолевого узла. у 4 животных в группе (66,67 %). Данные о динамике
По истечении 28 суток животных эвтанизиро- роста ортотопических опухолевых узлов представ-
вали в СО2 камере. лены на рис. 2.
Статистический анализ результатов При сравнительном анализе динамики роста
Для анализа полученных результатов использо- опухолевых узлов при подкожном и ортотопиче-
вали пакет программ Microsoft 10, и Statistica 10. ском варианте инъекцией опухолевых клеток было
Для проверки на нормальность полученной выбор- выявлено, что как опухолевых линии, так и получен-
ки данных использовали критерий Шапиро-Уилка. ная суспензия клеток достигали значимо большего
28
Южно-Российский онкологический журнал 2024. Т. 5, № 1. С. 25-33
Ляшенко И. С., Романова М. В., Гончарова А. С., Ходакова Д. В., Галина А. В., Гурова С. В., Филиппова С. Ю., Шатова Ю. С. Оценка приживления и динамики
роста ортотопической и гетеротопической in vivo модели рака молочной железы человека
объема при ортотопической инъекции. Данные холевого узла, инициированию неоваскуляции
о сравнительном анализе роста опухолевых узлов и формированию метастазов [13, 14]. Данное ми-
представлены на рис. 3. кроокружение представлено стромой с клетками
При анализе полученных результатов было выяв- различного типа, к таким клеткам относят опухоле-
лено, что при ортотопической инъекции опухоле- ассоциированные фибробласты – в исследовании
вых клеток отмечали значимо большую скорость Чжан Я. и соавт. (2023 г.) показано, что данные
роста, чем при подкожной инъекции. При анали- клетки активируются за счет таких факторов ми-
зе различных литературных данных нами также кроокружения, как TGF-β, моноцитарный хемотак-
было подтверждено, что для более быстрого роста сический протеин‑1, фактор роста фибробластов;
и достижения большего объема опухолевого узла продуцируют такие сигнальные белки, как фактор
рекомендовано осуществлять ортотопическую роста гепатоцитов, инсулиноподобный фактор
имплантацию [11, 12]. При оценке особенностей роста‑1, стимулирующие пролиферацию опухоле-
роста ксенографтов в одной из работ ФГБУ «НМИЦ вых клеток [15]. Кроме того, в исследованиях Пас-
онкологии» Минздрава Росссии был проведен ана- тушенко Е. и соавт. (2018 г.) и Кубурич Н. А. и соавт.
лиз роста кардиоэзофагеального рака человека на (2023 г.) было продемонстрировано влияние опу-
мышиных моделях [12]. В работе Кита С. О. и соавт. холеассоциированных фибробластов на индукцию
(2020 г.), так же как и в нашей работе, было выяв- эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП)
лено существенное влияние места имплантации путем секреции TGF-β, который активирует гены,
на динамику роста опухолевого узла и шанс при- кодирующие белки, необходимые для мезенхи-
живляемости ксенографта, что, вероятно, связано мальных функций клеток (виментин, N-кадгерин,
с воздействием среды, окружающей опухолевый фибронектин‑1) и подавляет экспрессию белков,
узел [12]. В исследованиях Зибирова Р. Ф. и Мозе- важных для эпителиального фенотипа (Е-кадгерин,
рова С. А. (2018 г.), Чен С. и соавт. (2023 г.) было цитокератины и ламины) [16, 17]. К микроокруже-
показано, что микроокружение опухоли через нию опухоли также относят Т- и В-лимфоциты: в ра-
сигнальные молекулы способствует успешному боте Зибирова Р. Ф. и Мозерова С. А. (2018 г.) было
приживлению опухолевого фрагмента, росту опу- выявлено высокое содержание интерлейкина‑10
120 160
140
100
120
Объем опухолевого узла, мм3
Объем опухолевого узла, мм3
80
100
60 80
60
40
40
20
20
0 0
1 4 8 12 16 20 24 28 1 4 8 12 16 20 24 28
Сутки эксперимента Сутки эксперимента
Дезагрегированная опухоль Дезагрегированная опухоль
BT20 BT20
Первичная культура Первичная культура
Рис. 1. Динамика роста подкожных опухолевых узлов Рис. 2. Динамика роста ортотопических опухолевых
РМЖ в группе с дезагрегированной опухолью, с узлов РМЖ в группе с дезагрегированной опухолью, с
инъекцией BT20, с инъекцией первичной культурой инъекцией BT20, с инъекцией первичной культурой.
Примечание: данные представлены в виде медианы Примечание: данные представлены в виде медианы
29
South Russian Journal of Cancer 2024. Vol. 5, No. 1. P. 25-33
Lyashenko I. S., Romanova M. V., Goncharova A. S., Khodakova D. V., Galina A. V., Gurova S. V., Filippova S. Yu., Shatova Yu. S. Evaluation of engraftment and growth
dynamics of orthotopic and heterotopic in vivo models of human breast cancer
(ИЛ‑10), продуцируемого опухолевыми клетками ми является положительным прогностическим мар-
и способствующего угнетению цитотоксической кером. Такие клетки выполняют антигенпрезенти-
активности Т-лимфоцитов, что способствует выжи- рующую функцию и экспрессируют молекулы CD80,
ванию опухолевых клеток в организме [13]. Дан- CD86, активируя СD4+ и CD8+ Т-клетки [18]. Однако
ные о влиянии В-лимфоцитов на патогенез опухоли в исследовании Линднера С. и соавт. (2013 г.) было
неоднозначны – в работе Цинь Ю. и соавт. (2021 г.) показано, что регуляторные В-клетки секретируют
показано, что инфильтрация опухоли В-лимфоцита- интерлейкин‑10, интерлейкин‑35, интерлейкин‑6,
TGF-β, способствуя иммуносупрессии противоопу-
холевой реакции [19]. Также одними из основных
80 клеток микроокружения опухоли считаются тучные
клетки, активирующие ангиогенез через гистамин,
70
гепарин, основной фактор роста фибробластов, фак-
60 тор роста эндотелия сосудов, TGF-β [13]. В работе
Объем опухолевого узла, мм3
50
Лю С. и соавт. (2023 г.), несмотря на различные
противоречивые данные, показано протумороген-
40
ное влияние тучных клеток при злокачественных
30 образованиях различных нозологий [20]. Таким
образом, ортотопическая имплантация опухолевых
20
клеток в организм экспериментального животного
10 способствует развитию соответствующего ответа
микроокружения, которое, согласно проанализиро-
0
ванным литературным и экспериментальным дан-
1 4 8 12 16 20 24 28
ным, способствует более успешному приживлению
Сутки эксперимента
и росту ксенографта.
А Дезагрегированная опухоль (подкожно) В нашей работе мы также проводили анализ
Дезагрегированная опухоль (ортотопически) влияния типа перевиваемого материала на его
приживляемость и рост в организме реципиента.
160 160
140 140
120 120
Объем опухолевого узла, мм3
Объем опухолевого узла, мм3
100 100
80 80
60 60
40 40
20 20
0 0
1 4 8 12 16 20 24 28 1 4 8 12 16 20 24 28
Сутки эксперимента Сутки эксперимента
Б ВТ20 (подкожно) В Первичная культура (подкожно)
BT20 (ортотопически) Первичная культура (ортотопически)
Рис. 3. Сравнение динамики роста групп с дезагрегированной опухолью, с инъекцией BT20, с инъекцией первичной
культурой при подкожном и ортотопическом способах инъекции
Примечание: данные представлены в виде медианы, * – статистически значимые различия между группами по
критерию Манна-Уитни (р < 0,05)
30
Южно-Российский онкологический журнал 2024. Т. 5, № 1. С. 25-33
Ляшенко И. С., Романова М. В., Гончарова А. С., Ходакова Д. В., Галина А. В., Гурова С. В., Филиппова С. Ю., Шатова Ю. С. Оценка приживления и динамики
роста ортотопической и гетеротопической in vivo модели рака молочной железы человека
В ходе работы мы отмечали наиболее активный боте Крбала Л. и соавт. (2017 г.), при использова-
рост и больший успех приживляемости трансплан- нии механического способа диссоциации, удалось
тата паспортизированной клеточной линии BT20, сформировать первичную клеточную линию коло-
однако первичная клеточная линия, сформирован- ректального рака человека, полученную от первич-
ная в нашем учреждении, также демонстрировала ной опухоли эффективностью 39,4 %, а клеточная
близкий к паспортизированной культуре резуль- линия, выделенная из соответствующих метастазов
тат. Наименьшей динамикой роста и процентом в лимфатических узлах, обладала эффективностью
приживляемости обладала дезагрегированная до 70 % [22]. Однако многие исследователи счита-
опухоль, полученная от пациентки. Анализируя ют, что механическая диссоциация является более
литературные данные по теме, мы отмечали не- травмирующей для клеток, чем другие способы,
обходимость межклеточной коммуникации для и приводит к значительной их гибели, что не под-
развития физиологических и патологических про- ходит для получения опухолевых клеток [28–30].
цессов [21]. В лабораторной практике существует На основании различных литературных данных
несколько способов получения суспензии опухоле- можно предположить, что использование в нашей
вых клеток: ферментативная, химическая и меха- работе методов ферментативной или химической
ническая [22]. Для ферментативной диссоциации диссоциации в отношении первичной опухоли
зачастую используют такие протеолитические могло бы способствовать более успешному при-
ферменты, как папаин, трипсин, проназа, эластаза живлению образцов и большей динамике роста
и гиалуронидаза [23]. В исследовании Яник К. и со- полученных ксенографтов, чем при механическом
авт. (2016 г.) для получения суспензии опухолевых измельчении образца. Определение эффективного
клеток РМЖ была использована ферментативная способа разработки опухолевой модели РМЖ чело-
смесь, включавшая в себя коллагеназу, раствор века является необходимым для проведения нами
диспазы и ДНКазы [24]. Однако, согласно иссле- дальнейших исследований природы течения дан-
дованию Нишиката Т. с соавт. (2013 г.), наиболее ного заболевания, а также оценки эффективности
эффективным способом ферментативной диссо- новых методов лечения.
циации в отношении опухоли молочной железы
являлось применение диспазы II [25]. При хими- ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ческой диссоциации необходимо добиться вымы-
вания из клеток катионов кальция и магния ввиду В ходе работы была проведена оценка динамики
их немаловажной роли в поддержании целостно- роста ортотопической и гетеротопической in vivo
сти клеточной поверхности [26]. В исследовании модели рака молочной железы. При ортотопиче-
Дамм Г. с соавт. (2019 г.) для химической диссо- ской инъекции опухолевого материала наблюдали
циации использовали этилендиаминтетрауксусную более высокий процент приживляемости (66,67 %;
кислоту (ЭДТА), которая способствует удалению 100 %). Кроме того, полученная нами в ходе данной
катионов Са2+ и Mg2+ и приводит к уменьшению работы первичная линия РМЖ обладала близкой
межклеточных взаимодействий. Также в их работе к паспортизированной культуре динамикой роста
описано использование гипертонических раство- опухолевых узлов, что дает основания использо-
ров сахарозы, мальтозы и лактозы для нарушения вать данную линию в дальнейших исследованиях.
щелевых контактов между клетками [27]. Механи- В заключение можно отметить, что нами была
ческая диссоциация опухолевой ткани является разработана адекватная опухолевая модель РМЖ
простым и эффективным методом получения кле- при различных способах имплантации материала
точной суспензии, заключающимся в измельчении и с возможностью дальнейшего использования при
полученного образца ножницами, гомогенизации исследовании механизмов канцерогенеза и тести-
и фильтрации полученной суспензии [23]. Так, в ра- ровании новых фармакологических субстанций.
Список источников
1. Шахзадова А. О., Старинский В. В., Лисичникова И. В. Состояние онкологической помощи населению России в
2022 году. Сибирский онкологический журнал. 2023;22(5):5–13. https://doi.org/10.21294/1814-4861-2023-22-5-5-13,
EDN: PESHHL
31
South Russian Journal of Cancer 2024. Vol. 5, No. 1. P. 25-33
Lyashenko I. S., Romanova M. V., Goncharova A. S., Khodakova D. V., Galina A. V., Gurova S. V., Filippova S. Yu., Shatova Yu. S. Evaluation of engraftment and growth
dynamics of orthotopic and heterotopic in vivo models of human breast cancer
2. Zeng L, Li W, Chen CS. Breast cancer animal models and applications. Zool Res. 2020 Sep 18;41(5):477–494.
https://doi.org/10.24272/j.issn.2095-8137.2020.095
3. Lee RS, Sad K, Fawwal DV, Spangle JM. Emerging Role of Epigenetic Modifiers in Breast Cancer Pathogenesis and Thera-
peutic Response. Cancers (Basel). 2023 Aug 7;15(15):4005. https://doi.org/10.3390/cancers15154005
4. Rajagopal K, Kalusalingam A, Bharathidasan AR, Sivaprakash A, Shanmugam K, Sundaramoorthy M, et al. In Silico Drug
Design of Anti-Breast Cancer Agents. Molecules. 2023 May 18;28(10):4175. https://doi.org/10.3390/molecules28104175
5. Chan J, Wang X, Turner JA, Baldwin NE, Gu J. Breaking the paradigm: Dr Insight empowers signature-free, enhanced drug
repurposing. Bioinformatics. 2019 Aug 15;35(16):2818–2826. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btz006
6. Ma J, Wang J, Ghoraie LS, Men X, Haibe-Kains B, Dai P. A Comparative Study of Cluster Detection Algorithms in Protein-Pro-
tein Interaction for Drug Target Discovery and Drug Repurposing. Front Pharmacol. 2019;10:109.
https://doi.org/10.3389/fphar.2019.00109
7. Zhou H, Liu H, Yu Y, Yuan X, Xiao L. Informatics on Drug Repurposing for Breast Cancer. Drug Des Devel Ther. 2023;17:1933–
1943. https://doi.org/10.2147/DDDT.S417563
8. Centonze M, Di Conza G, Lahn M, Fabregat I, Dituri F, Gigante I, et al. Autotaxin inhibitor IOA-289 reduces gastrointestinal cancer
progression in preclinical models. J Exp Clin Cancer Res. 2023 Aug 8;42(1):197. https://doi.org/10.1186/s13046-023-02780-4
9. Gao X, Yourick JJ, Sprando RL. Toxicological applications of human induced pluripotent stem cell-derived hepatocyte-like
cells: an updated review. J Toxicol Sci. 2023;48(8):441–456. https://doi.org/10.2131/jts.48.441
10. Pellegrino B, Herencia-Ropero A, Llop-Guevara A, Pedretti F, Moles-Fernández A, Viaplana C, et al. Preclinical In Vivo Val-
idation of the RAD51 Test for Identification of Homologous Recombination-Deficient Tumors and Patient Stratification.
Cancer Res. 2022 Apr 15;82(8):1646–1657. https://doi.org/10.1158/0008-5472.CAN-21-2409
11. Singhal SS, Garg R, Mohanty A, Garg P, Ramisetty SK, Mirzapoiazova T, et al. Recent Advancement in Breast Cancer Re-
search: Insights from Model Organisms-Mouse Models to Zebrafish. Cancers (Basel). 2023 May 29;15(11):2961.
https://doi.org/10.3390/cancers15112961
12. Кит С. О., Максимов А. Ю., Гончарова А. С., Колесников Е. Н., Санамянц С. В., Кациева Т. Б. и др. Особенности
роста пациентоподобных подкожных и ортотопических ксенографтов кардиоэзофагеального рака человека
на иммунодефицитных мышах. Современные проблемы науки и образования. 2020;(2):90.
https://doi.org/10.17513/spno.29573, EDN: OWIDSM
13. Зибиров Р. Ф., Мозеров С. А. Характеристика клеточного микроокружения опухоли. Онкология. Журнал им. П. А.
Герцена. 2018;7(2):67–72. https://doi.org/10.17116/onkolog20187267-72
14. Chen S, Du Y, Guan XY, Yan Q. The current status of tumor microenvironment and cancer stem cells in sorafenib resistance
of hepatocellular carcinoma. Front Oncol. 2023;13:1204513. https://doi.org/10.3389/fonc.2023.1204513
15. Zhang Y, Lv N, Li M, Liu M, Wu C. Cancer-associated fibroblasts: tumor defenders in radiation therapy. Cell Death Dis. 2023
Aug 22;14(8):541. doi.org/10.1038/s41419-023-06060-z
16. Pastushenko I, Brisebarre A, Sifrim A, Fioramonti M, Revenco T, Boumahdi S, et al. Identification of the tumour transition
states occurring during EMT. Nature. 2018 Apr;556(7702):463–438. https://doi.org/10.1038/s41586-018-0040-3
17. Kuburich NA, Sabapathy T, Demestichas BR, Maddela JJ, den Hollander P, Mani SA. Proactive and reactive roles of TGF-β
in cancer. Semin Cancer Biol. 2023 Oct;95:120–139. https://doi.org/10.1016/j.semcancer.2023.08.002
18. Qin Y, Peng F, Ai L, Mu S, Li Y, Yang C, et al. Tumor-infiltrating B cells as a favorable prognostic biomarker in breast cancer: a
systematic review and meta-analysis. Cancer Cell Int. 2021 Jun 12;21(1):310. https://doi.org/10.1186/s12935-021-02004-9
19. Lindner S, Dahlke K, Sontheimer K, Hagn M, Kaltenmeier C, Barth TFE, et al. Interleukin 21-induced granzyme B-expressing
B cells infiltrate tumors and regulate T cells. Cancer Res. 2013 Apr 15;73(8):2468–2479.
https://doi.org/10.1158/0008-5472.CAN-12-3450
20. Liu X, Li X, Wei H, Liu Y, Li N. Mast cells in colorectal cancer tumour progression, angiogenesis, and lymphangiogenesis.
Front Immunol. 2023;14:1209056. https://doi.org/10.3389/fimmu.2023.1209056
21. Nail HM, Chiu CC, Leung CH, Ahmed MMM, Wang HMD. Exosomal miRNA-mediated intercellular communications and im-
munomodulatory effects in tumor microenvironments. J Biomed Sci. 2023 Aug 21;30(1):69.
https://doi.org/10.1186/s12929-023-00964-w
22. Krbal L, Soukup J, Stanislav J, Hanusova V. Derivation and basic characterization of colorectal carcinoma primary cell lines.
Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub. 2017 Dec;161(4):360–368.
https://doi.org/10.5507/bp.2017.040
32
Южно-Российский онкологический журнал 2024. Т. 5, № 1. С. 25-33
Ляшенко И. С., Романова М. В., Гончарова А. С., Ходакова Д. В., Галина А. В., Гурова С. В., Филиппова С. Ю., Шатова Ю. С. Оценка приживления и динамики
роста ортотопической и гетеротопической in vivo модели рака молочной железы человека
23. Тимофеева С. В., Филиппова С. Ю., Ситковская А. О., Гненная Н. В., Межевова И. В., Шамова Т. В. и др. Биоресурсная
коллекция клеточных линий и первичных опухолей ФГБУ НМИЦ онкологии Минздрава России. Кардиоваску-
лярная терапия и профилактика. 2022;21(11):3397. https://doi.org/10.15829/1728-8800-2022-3397
24. Janik K, Popeda M, Peciak J, Rosiak K, Smolarz M, Treda C, et al. Efficient and simple approach to in vitro culture of primary
epithelial cancer cells. Biosci Rep. 2016 Dec;36(6):e00423. https://doi.org/10.1042/BSR20160208
25. Nishikata T, Ishikawa M, Matsuyama T, Takamatsu K, Fukuhara T, Konishi Y. Primary culture of breast cancer: a model sys-
tem for epithelial-mesenchymal transition and cancer stem cells. Anticancer Res. 2013 Jul;33(7):2867–2873.
26. Charni-Natan M, Goldstein I. Protocol for Primary Mouse Hepatocyte Isolation. STAR Protoc. 2020 Sep 18;1(2):100086.
https://doi.org/10.1016/j.xpro.2020.100086
27. Damm G, Schicht G, Zimmermann A, Rennert C, Fischer N, Kießig M, et al. Effect of glucose and insulin supplementation
on the isolation of primary human hepatocytes. EXCLI J. 2019;18:1071–1091. https://doi.org/10.17179/excli2019-1782
28. Skarkova V, Krupova M, Vitovcova B, Skarka A, Kasparova P, Krupa P, et al. The Evaluation of Glioblastoma Cell Dissociation
and Its Influence on Its Behavior. Int J Mol Sci. 2019 Sep 18;20(18):4630. https://doi.org/10.3390/ijms20184630
29. Kapałczyńska M, Kolenda T, Przybyła W, Zajączkowska M, Teresiak A, Filas V, et al. 2D and 3D cell cultures – a comparison
of different types of cancer cell cultures. Arch Med Sci. 2018 Jun;14(4):910–919. https://doi.org/10.5114/aoms.2016.63743
30. Long Y, Xie B, Shen HC, Wen D. Translation Potential and Challenges of In Vitro and Murine Models in Cancer Clinic. Cells.
2022 Nov 30;11(23):3868. https://doi.org/10.3390/cells11233868
Информация об авторах:
Ляшенко Инна Сергеевна – аспирант, ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии» Министерства здраво-
охранения Российской Федерации, г. Ростов-на-Дону, Российская Федерация
SPIN: 5074-2896, AuthorID: 1165761
Романова Мария Вадимовна – младший научный сотрудник испытательного лабораторного центра, ФГБУ «Национальный медицинский
исследовательский центр онкологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Ростов-на-Дону, Российская Федерация
ORCID: https://orcid.org/0000-0001-8734-9210, SPIN: 5148-0830, AuthorID: 1032029, Scopus Author ID: 57217235360
Гончарова Анна Сергеевна – к.б.н., заведующий испытательного лабораторного центра, ФГБУ «Национальный медицинский исследо-
вательский центр онкологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Ростов-на-Дону, Российская Федерация
ORCID: https://orcid.org/0000-0003-0676-0871, SPIN: 7512-2039, AuthorID: 553424, Scopus Author ID: 57215862139
Ходакова Дарья Владиславовна – младший научный сотрудник испытательного лабораторного центра, ФГБУ «Национальный медицин-
ский исследовательский центр онкологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Ростов-на-Дону, Российская Феде-
рация
ORCID: https://orcid.org/0000-0003-3753-4463, SPIN: 8718-3983, AuthorID: 1056414, Scopus Author ID: 57221463056
Галина Анастасия Владимировна – младший научный сотрудник испытательного лабораторного центра, ФГБУ «Национальный меди-
цинский исследовательский центр онкологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Ростов-на-Дону, Российская
Федерация
ORCID: https://orcid.org/0000-0001-7823-3865, SPIN: 9171-4476, AuthorID: 1071933, Scopus Author ID: 57221460594
Гурова Софья Валерьевна – младший научный сотрудник испытательного лабораторного центра, ФГБУ «Национальный медицинский
исследовательский центр онкологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Ростов-на-Дону, Российская Федерация
ORCID: https://orcid.org/0000-0002-9747-8515, SPIN: 5413-6901, AuthorID: 1147419
Филиппова Светлана Юрьевна – научный сотрудник лаборатории клеточных технологий, ФГБУ «Национальный медицинский исследова-
тельский центр онкологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Ростов-на-Дону, Российская Федерация
ORCID: https://orcid.org/0000-0002-4558-5896, SPIN: 9586-2785, AuthorID: 878784, Scopus Author ID: 57189618843
Шатова Юлиана Сергеевна – д.м.н., ведущий научный сотрудник отдела опухолей мягких тканей и костей, ФГБУ «Национальный медицин-
ский исследовательский центр онкологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Ростов-на-Дону, Российская Федерация
SPIN: 8503-3573, AuthorID: 294376
Вклад авторов:
Ляшенко И. С. – проведение эксперимента;
Романова М. В. – написание исходного текста;
Гончарова А. С – формулирование концепции исследования;
Ходакова Д. В. – поиск литературных источников;
Галина А. В. – анализ полученных экспериментальных данных;
Гурова С. В. – итоговые выводы;
Филиппова С. Ю. – проведение эксперимента;
Шатова Ю. С. – научное руководство.
33
