CC BY
49
УДК 547.992.2
СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МОЛЕКУЛЯРНО-МАССОВОГО РАСПРЕДЕЛЕНИЯ ВОДОРАСТВОРИМЫХ ГУМИНОВЫХ ВЕЩЕСТВ, ГУМИНОВЫХ И ФУЛЬВОКИСЛОТ ДЕРНОВО-ПОДЗОЛИСТЫХ ПОЧВ1
Н.А. Куликова, И.В. Перминова, А.В. Кудрявцев
Методом эксклюзионной хроматографии с комбинированным использованием детекторов органического углерода и УФ-поглощения исследованы изменения, происходящие с органическим веществом водных вытяжек трех дерново-подзолистых почв при выделении водорастворимых гуминовых веществ. Проведено их сравнение с гуминовыми и фульвокис-лотами, полученными из этих же почв.
Ключевые слова: водорастворимые гуминовые вещества.
Растворенное органическое вещество (РОВ) почв и, в частности, гуминовые вещества (ГВ) почвенного раствора являются наименее изученными среди природной гумусовой компоненты, что связано с низкой концентрацией органического углерода (ОС) в почвенном растворе [4], а также трудоемкостью извлечения водорастворимых гуминовых веществ (ВГВ). С другой стороны, постоянно ведутся дискуссии о том, существуют ли гуминовые кислоты (ГК) и фульвокислоты (ФК) в реальных почвенных системах или они являются результатом гидролиза почвенного органического вещества в процессе щелочной экстракции, применяемой для их выделения [3].
Цель настоящей работы — проследить за моле-кулярно-массовыми изменениями, происходящими с органическим веществом водных вытяжек почв при выделении водорастворимых гуминовых веществ и сравнить их свойства с таковыми гуминовых кислот и фульвокислот, полученных из этих же почв.
Объекты и методы исследования
Препараты гуминовых веществ выделяли из трех почв различной степени окультуренности: целинной дерново-подзолистой слабодерновой глубокоподзолистой среднесуглинистой на покровном суглинке под лесом (ПДЦ; рНвод 5,0; ОС 4,3%), окультуренной дерново-подзолистой среднепахотной средне-суглинистой слабосмытой на покровном суглинке (ПДО; рНвод 7,8; ОС 1,5%) и культурной дерново-подзолистой глубокопахотной среднесуглинистой (ПДК; рНВод 7,3; ОС 3,8%).
Гуминовые кислоты выделяли по стандартной методике экстракцией 0,1М NaOH с последующим осаждением путем подкисления до рН 1—2 0,1М HCl [3]. Из полученного супернатанта выделяли фульвокислоты по методике [6]. Препараты очищали с помощью электродиализа. В результате полу-
чили по три препарата гуминовых кислот (ГК—ПДЦ, ГК-ПДО и ГК—ПДК) и фульвокислот (ФК—ПДЦ, ФК—ПДО и ФК—ПДК).
Для выщеления препаратов водорастворимыгх гу-миновыгх веществ навеску (1 кг) воздушно-сухой почвы, просеянной через сито с размером ячеек 1 мм, заливали дистиллированной водой (2 л), тщательно взбалтывали и оставляли на ночь. Полученную водную вытяжку отфильтровывали через бумажный фильтр «синяя лента» и мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм для отделения истинно растворенного органического вещества от коллоидного. Выщеление проводили из 10 кг каждой из использовании почв. Отфильтрованные вытяжки объединяли, подкисляли до рН 1—2 0,1М HCl и пропускали через стеклянную колонку, заполненную смолой Amberlite XAD-2, для осаждения водорастворимыгх гуминовых веществ (рис. 1). Дальнейшие процедуры их элюирования с колонки и последующего обессоливания были аналогичны описанным для фульвокислот. На каждом этапе отбирали пробы для анализа методом эксклюзионной хроматографии в целях контроля за изменениями, происходящими в их растворах. Кроме того, в получаемых растворах определяли концентрацию органического углерода с помощью анализатора Shimadzu 5000 TOC (Япония), что позволило оценить содержание различных фракций растворенного органического вещества в почвах.
Молекулярную массу препаратов гуминовыгх веществ определяли с помощью эксклюзионной хроматографии по методике [8]. Фракционирование их осуществляли на колонке, заполненной гелем Toyo-pearl-HW-50(S) (Япония), в качестве калибровочных веществ использовали полидекстраны с известной молекулярной массой. Концентрация ГВ в анализируемых пробах составляла 1—2 мг ОС/л; подвижной фазой служил фосфатный буфер (0,028 M,
1 Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (проект № 10-03-00803-а), Программы междисциплинарных научных проектов МГУ им. М.В. Ломоносова 2007 и 2008 гг. и Министерства образования и науки РФ (ГК П211).
ПОЧВА + ДИСТИЛЛИРОВАННАЯ ВОДА
Фильтрование через бумажный фильтр «синяя лента»
ВОДНАЯ ВЫТЯЖКА
Фильтрование через мембранный фильтр 0,45 мкм
РАСТВОРЕННОЕ ОРГАНИЧЕСКОЕ ВЕЩЕСТВО
Подкисление до рН 2 0,1 М НС1
РАСТВОРЕННОЕ ОРГАНИЧЕСКОЕ ВЕЩЕСТВО, рН 2
Осаждение на смоле АтЬегМе ХАО-2, отмывка от С1 , десорбция 0,1 М ЫаОН, очистка электродиализом
ВОДОРАСТВОРИМЫЕ ГУМИНОВЫЕ ВЕЩЕСТВА
Рис. 1. Схема выделения почвенных водорастворимых гуминовых веществ
рН 6,8), скорость элюирования — 1 мл/мин. Регистрацию ГВ на выходе из колонки проводили по содержанию органического углерода в элюате, используя проточный детектор органического углерода Огаеп17е1 (Германия), а также по поглощению элюатом излучения при 254 нм с помощью УФ-де-тектора. На основании получаемых гель-хромато-грамм рассчитывали молекулярную массу (ММ) препаратов гуминовых веществ в пике (Мр) и средне-весовую ММ (М^ с использованием программы ОеГГгеа! [5].
Результаты и их обсуждение
Контроль за изменениями, происходящими с растворенным почвенным органическим веществом на различных стадиях выделения ВГВ, проводили методом эксклюзионной хроматографии. При этом одновременное использование детектора ОС и УФ-поглощения позволяло следить как за различиями в суммарном пуле водорастворимого органического вещества, так и в его гумусовой компоненте. Соответствующие гель-хроматограммы приведены на рис. 2.
На гель-хроматограмме водной вытяжки почвы (рис. 2) с детекцией по ОС были зарегистрированы два плохо разрешенных пика на объемах элюирования (Уе) 26 и 35 мл. При этом пик, относящийся к фракции органического вещества с большей молекулярной массой (17—42 кДа), характеризовался практически полным отсутствием поглощения при 254 нм. Это свидетельствует о том, что вещества с данным объемом выхода не относятся к гу-миновым и представлены в основном полисахаридами. Наличие пика на гель-хроматограмме с УФ-детекцией при Уе = 35 мл позволяет трактовать второй пик (2—17 кДа) как гуминовые вещества.
Фильтрование исходной водной вытяжки через мембранный фильтр 0,45 мкм, используемое обыч-
но для отделения коллоидного органического вещества от истинно растворенного, не привело к заметным изменениям гель-хроматограмм. Учитывая, что концентрация органического углерода в растворах РОВ составляла 90—93% от концентрации в водных вытяжках, можно сделать вывод, что содержание коллоидного органического вещества незначительно. При под-кислении РОВ до рН 2 (рис. 2) объем элюирования пика «гуминовых веществ» увеличивается с 35 до 38 мл. При этом образуется второй пик с объемом элюирования 48 мл, для которого характерно отсутствие поглощения при 254 нм. В качестве объяснения наблюдаемого эффекта можно предложить две гипотезы. Первая заключается в том, что в исходном растворенном органическом веществе присутствуют комплексы железа и алюминия с гуминовыми веществами, характеризующиеся минимумом констант комплексообразования в области рН 1—3 [2]. Следовательно, можно предположить, что при снижении рН до 1—2 происходит разрушение этих комплексов, приводящее к уменьшению молекулярной массы. Второе возможное объ-
Рис. 2. Гель-хроматограммы препаратов почвенного органического вещества (на примере П^К почвы): сплошная линия — УФ-детекция, пунктирная — детекция по ОС
яснение — значительное изменение рН раствора при подкислении РОВ, что неизбежно сказывается на результатах хроматографического анализа вследствие возникновения неэксклюзионных эффектов, таких, как сорбция на геле из-за протонирования заряда гуминовых веществ [8]. Указанные процессы приводят к смещению пика на хроматограмме в сторону больших объемов элюирования, что мы и наблюдали.
Дополнительный максимум (Уе = 48 мл) представляет собой так называемый «солевой пик», время выхода которого совпадает с выходом фосфатного буфера из колонки. Данный максимум обусловлен элюированием низкомолекулярных кислот [7].
По гель-хроматограмме растворенного органического вещества, не сорбирующегося на смоле Лш-ЪегШе ХЛЭ-2, видно, что наибольшим сродством к сорбенту характеризовалось РОВ среднего (гумусового) пика. Относительная площадь первого и последнего пиков значительно увеличилась, тогда как среднего — уменьшилась. Массовые доли фракций с различной молекулярной массой для приведенных гель-хроматограмм даны в табл. 1.
Таблица 1
Относительное содержание фракций с различной молекулярной массой в растворах органического вещества П^К почвы на разных этапах выделения водорастворимых гуминовых веществ
Препарат почвенного органического вещества Относительное содержание фракций с разной молекулярной массой, %
17—42 кДа 2—17 кДа 0,1—2 кДа
Водная вытяжка 17 78 5
Растворенное органическое вещество 19 77 4
Растворенное органическое вещество, рН 2 19 65 16
Растворенное органическое вещество, не сорбировавшееся на ХЛБ-2 34 38 28
Водорастворимые гуми-новые вещества 5 83 12
но оценить содержание водорастворимых гумино-вых веществ в почвах. Полученные значения составили 43,0, 19,0 и 38,0 мг ОС/кг почвы для ПДЦ, ПДО и ПДК соответственно.
Молекулярная масса в пике и средневесовая ММ органического вещества на различных этапах выделения водорастворимых гуминовых веществ из почвенного раствора для всех исследованных почв приведены в табл. 2. Там же указана ММ выделенных из этих почв гуминовых кислот и фульвокислот.
Таблица 2
Молекулярная масса в пике (М^) и средневесовая молекулярная масса (М„,) выделенных препаратов ВГВ, ГК и ФК
Препарат почвенного органического вещества М , кДа М , кДа
ПДЦ ПДО ПДК ПДЦ ПДО пдК
Водная вытяжка 7,6 7,1 9,6 18,5 16,1 15,7
Растворенное органическое вещество 7,4 7,1 9,5 15,7 15,9 15,4
Растворенное органическое вещество, рН 2 6,0 6,0 6,6 12,8 12,8 11,0
Растворенное органическое вещество, не сорбировавшееся на ХЛБ-2 6,1 6,2 6,4 10,5 10,2 17,7
Водорастворимые гуми-новые вещества 6,2 7,2 8,0 6,3 7,2 7,9
Фульвокислоты 9,8 8,0 11,2 10,2 8,8 11,7
Гуминовые кислоты 16,0 17,0 18,3 14,5 16,6 14,2
На основании представленных гель-хромато-грамм можно прийти к выводу, что только средний пик растворенного органического вещества с рН 2 (2—17 кДа) (рис. 2) отвечает гуминовым веществам, так как имеет поглощение при 254 нм и сорбцию на ХЛЭ-2. Ввиду того что площадь этого пика составляет 65% от общего содержания органического углерода (табл. 1), можно предположить, что гуминовые вещества в исследованной нами водной вытяжке составили приблизительно 65% от растворенного органического вещества. Аналогичная величина для двух других почв — 49%. Таким образом, зная концентрацию органического углерода в растворах почвенного РОВ можно приблизитель-
Примечание. Доверительный интервал Мр и Мж составил ±3%.
Данные, приведенные в табл. 2, показывают, что при переходе от раствора водной вытяжки к растворенному органическому веществу происходит небольшое уменьшение Мш за счет отделения коллоидного органического вещества. При этом положение пика незначительно смещается в сторону меньших значений молекулярной массы. При подкислении растворенных органических веществ до рН 2 Мш органического вещества снижается на 3—4 кДа.
На основании близости значений М^ выделенных препаратов гуминовых веществ водной вытяжки и низкомолекулярного (гумусового) пика исходной водной вытяжки можно сделать вывод, что использованный в работе метод выделения позволяет получать препараты гуминовых веществ, близких к реально существующим в почвенном растворе.
Полученные значения Мш составили 8,0—11,7 и 14,2—16,6 кДа для препаратов фульвокислот и гуминовых кислот соответственно (табл. 2). Указанные величины хорошо согласуются с приводимыми в литературе значениями для аналогичных препаратов гумусовых кислот [1, 3]. Для образцов ФК и ГК, выделенных из одной почвы, большие
значения Мш наблюдали для препаратов гуминовых кислот, что соответствует данным других исследователей [3]. В целом препараты гуминовых веществ можно расположить в следующий ряд по возрастанию их Мш: ВГВ < ФК < ГК. При этом полученные значения М для фульвокислот и гумино-вых кислот превышали таковые для водораство-
римых гуминовых веществ в среднем на 3 и 8 кДа соответственно.
Авторы выражают признательность проф. Ф. Фрим-мелю, доктору Г. Аббт-Браун и доктору С. Хессе из Технического университета Карлсруэ (Германия) за предоставленное гель-хроматографическое оборудование и техническую поддержку.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Анисимова М.А, Перминова И.В., Лебедева Г.Ф. Детоксицирующая способность гуминовых кислот по отношению к гербициду трифлуралину // Почвоведение. 1998. № 9. С. 1079-1084.
2. Карпухин А.И, Фокин А.Д. Применение гелевой хроматографии для изучения фульвокислот и железофу-льватных соединений // Особенности почвенных процессов дерново-подзолистых почв. М., 1977.
3. Орлов Д.С., Гришина Л.А. Практикум по химии гумуса. М., 1981.
4. Dosskey M.G., Bertsch P.M. Transport of dissolved prganic matter through a sandy forest soil // Soil Sci. Soc. Amer. J. 1997. Vol. 61. P. 920-927.
5. Kudryavtsev A. V., Perminova I. V., Petrosyan V.S. Size-exclusion chromatographic descriptors of humic substances // Anal. Chim. Acta. 2000. Vol. 407, (1-2). P. 193-202.
6. Mantoura R.F.C, Riley J.R. The use of gel filtration in the stuly of metal binding by humic acids and related compounds // Anal. Chim. Acta. 1975. Vol. 78. P. 193-200.
7. Nobili M. de, Gjessing E, Sequi P. Sizes and ahpes of humic substances by gel chromatography // Humic substances. II / M.B.H. Hayes, P. MacCarthy, R.L. Malcolm, R.S. Swift (Eds). 1989. P. 562-591.
8. Perminova I. V., Frimmel F.H., Kovalevskii D. V. et al. Development of a predictive model for calculation of molecular weight of humic substances // Water Res. 1998. Vol. 32. P. 872-881.
Поступила в редакцию 14.03.2010
A COMPARATIVE STUDY OF MOLECULAR WEIGHT DISTRIBUTION
OF WATER-SOLUBLE HUMIC SUBSTANCES, HUMIC
AND FULVIC ACIDS EXTRACTED FROM SOD-PODZOLIC SOILS
N.A. Kulikova, I.V. Perminova, A.V. Kudryavtsev
An alteration of organic matter originated from three sod-podzolic soils in course of extraction of water-soluble humic substances has been studied by mean of size-exclusion chromatography using combined UV-DOC detector. A comparison of water-soluble humic substances with humic and fulvic acids extracted from the same soils has been carried out.
Key words: water-soluble humic substances, molecular weight distribution.
Сведения об авторах. Куликова Наталия Александровна, докт. биол. наук, ст. науч. сотр. каф. общего земледелия ф-та почвоведения МГУ им. М.В. Ломоносова, Ин-та биохимии им. А.Н. Баха РАН. Тел. 939-44-56. Перминова Ирина Васильевна, докт. хим. наук, профессор, вед. науч. сотр. каф. органической химии химического ф-та МГУ им. М.В. Ломоносова. Тел. 939-55-46. Кудрявцев Алексей Валерьевич, науч. сотр. каф. органической химии химического ф-та МГУ им. М.В. Ломоносова. Тел. 939-55-46.
