Сравнительная характеристика методов лабораторной диагностики описторхоза Текст научной статьи по специальности «Прочие медицинские науки»

микробиология

© О.Ю. СТАРОСТИНА, И.И. ПАНЮшКИНА, 2014 удк 616.995.122.21-078

О.Ю. Старостина, И.И. Панюшкина

сравнительная характеристика методов лабораторной диагностики описторхоза

ФБУН «Омский НИИ природно-очаговых инфекций» Роспотребнадзора, 644080, г. Омск, Россия

С целью сравнительной оценки эффективности лабораторных методов диагностики описторхозной инвазии проводилось исследование образцов сыворотки крови и копроматериала от людей. Для паразитологической диагностики применялся метод толстого мазка под целлофановой пленкой по Като-Миура и седиментационный метод уксусно-эфирного осаждения. Для серологической диагностики использовали метод иммуноферментного анализа. Анализ частоты обнаружения яиц описторхисов в копроматериале и уровня противоописторхозных антител в образцах сыворотки крови пациентов показал наличие сильной прямой корреляционной связи между этими показателями. Показано, что для лабораторной диагностики описторхоза нельзя ограничиваться каким-либо одним методом. Установлено, что на территориях со средним и низким уровнем инвазированности населения описторхисами целесообразно использовать комплекс методов, включающий исследование сыворотки крови на наличие специфических иммуноглобулинов к антигенам описторхисов и дву-или троекратное исследование кала двумя копроовоскопическими методами.

Ключевые слова: описторхоз; копроовоскопия; лабораторная диагностика гельминтозов. O.Yu. Starostina, I.I. Panushkina

THE COMPARATIVE CHARACTERISTIC OF METHODS OF LABORATORY DIAGNOSTIC OF OPISTHORCHIASIS

The Omsk research institute of naturofocal infections of Rospotrebnadzor, 644080 Omsk, Russia

The analysis of samples of blood .serums and copromaterial from patients was carried out to evaluate effectiveness of diagnostic of opisthorchiasis invasion. The Kato-Miura technique of thick film under cellophane layer and sedimentation technique of acetic etheric precipitation were applied for parasitologic diagnostic. The technique of immunoenzymometric analysis was applied for serological diagnostic. The analysis of detection rate of eggs of opistorchis in copromaterial and level of anti-opistorchis antibodies in samples of blood serum of patients demonstrated the presence of strong direct correlation relationship between these indicators. It is demonstrated that for laboratory diagnostic of opisthorchiasis it is impossible to limit oneself to some single technique. It is established that on the territories with middle and low level of population infection rate of opistorchis it is appropriate to apply complex of methods including analysis of blood serum for presence of specific immunoglobulins to antigens of opistorchis and twice or thrice analysis of feces with copro-ovoscopic methods.

Keywords: opisthorchiasis, copro-ovoscopy, laboratory diagnostic of opisthorchiasis

Введение. Одним из разделов эпидемиологического надзора за гельминтозами является совершенствование лабораторных методов диагностики и внедрение их в практику. В клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений в большинстве случаев используются малоэффективные методы копроовоскопии, которые не выявляют инвазии низкой интенсивности [1].

Описторхоз (возбудитель Opisthorchis felineus) является наиболее значимым биогельминтозом на территории Российской Федерации: в общей структуре биогельминтозов на его долю приходится 74,4%. Ежегодно на территории Российской Федерации регистрируется около 35 тыс. больных описторхозом. Наиболее неблагополучными являются Ханты-Мансийский (614,1 на 100 тыс. населения), Ямало-Ненецкий (279,8) автономные округа, Тюменская (211,6), Томская (222,2), Новосибирская (116,6), Омская (158,9) области. В 2011 г. показатель заболеваемости описторхозом по Сибирскому федеральному округу составил 70,5 на 100 тыс. населения при среднефедеративном уровне 22,4 [2].

Для корреспонденции: Старостина Ольга Юрьевна, науч. сотр. Адрес: 644080, Омск, прсп. Мира, 7. E-mail : olgastar27@mail.ru

В Омской области на описторхоз приходится 99,4% случаев от общего числа зарегистрированных гельминтозов [3].

С учетом существенной социально-экономической значимости описторхоза, его широкой распространенности на территории Обь-Иртышского бассейна, интенсификации миграции населения, в том числе из неблагополучных по опи-сторхозу регионов, оптимизация применения лабораторных методов диагностики с целью наиболее полного выявления инвазированных лиц приобретает важное значение.

Цель работы - оценка эффективности серологических и копроовоскопических методов диагностики описторхоза на территории со средним и низким уровнем инвазированности населения.

Материалы и методы. Для паразитологической диагностики описторхоза выбраны два метода копроовоскопии: метод толстого мазка под целлофаном по Като-Миура и седиментационный метод уксусно-эфирного осаждения [4]. Всего двумя этими методами обследовано 411 жителей г. Омска и Омской области. При использовании метода уксусно-эфирного осаждения подсчитывали число яиц гельминта на 1г фекалий (я/г). Для серологической диагностики использовали метод иммуноферментного анализа (ИФА) с целью выявления специфических иммуноглобулинов классов М (]^М) и О (]^0). ИФА проводили с помощью тест-системы производства ЗАО «Вектор-Бест», Россия, в соответствии с

МИКРОБИОЛОГИЯ

2 vP 5s

s „

аг га

и СО

ф о

т X

О.

l. О g

^ о

о S

1- с

s о

т

го s

о. аз

я S

с X

о ©

J

s с а. ф

CK ш

§ 1- S

а: о с

90 80 70 60 50 40 30 20 10 О

-♦80

200 400 600 Обратные титры IgG

800

Зависимость частоты обнаружения яиц описторхисов от титров специфических иммуноглобулинов (1§О).

инструкцией. Одновременное исследование копроматериала и сывороток крови проведено у 396 пациентов с подозрением на описторхозную инвазию, направленных на обследование из лечебно-профилактических учреждений г. Омска. Статистическая обработка полученных результатов исследования проводилась с использованием программы Statistica 6.0.

Результаты и обсуждение. Антитела к антигенам описторхисов выявлены у 233 (58,8 ± 2,5%) человек, из них ^О в титрах 1:100-1:3200 - у 208 (89,3 ±_2,0% от числа серопози-тивных лиц), у 17 (7,3 ± 1,7% от числа серопозитивных лиц) выявлены одновременно 1§О и IgМ в титрах 1:200-1:800, у 8 (3,4 ± 1,2%) пациентов обнаружены только IgМ. При ко-проовоскопическом исследовании методом уксусно-эфирного осаждения, описторхоз подтвержден у 148 человек из 233 серопозитивных лиц, т. е. у 63,5 ± 3,1% от всех серопозитивных лиц. Подавляющее большинство пациентов копроовоскопиче-ски обследовались однократно. Дву- или троекратно методом уксусно-эфирного осаждения обследовано 26 человек: 13 пациентов, у которых выявлены антитела к описторхисам в титрах 1:100-1:800 и 13 пациентов с отрицательным результатом ИФА. При дополнительном обследовании яйца описторхисов обнаружены у двух пациентов с положительным результатом ИФА (с титрами 1:400) во второй порции копроматериала в количестве 5 и 2 я/г и у одного пациента с отрицательным результатом ИФА в 4-й порции в количестве 1 я/г У 85 серо-позитивных пациентов исследование кала методом уксусно-эфирного осаждения дало отрицательный результат.

При исследовании копроматериала от 163 пациентов с отрицательными результатами ИФА яйца О. felineus обнаружены у 31 человека, т. е. у 19,0 ± 3,1% от числа серонегативных лиц.

Анализ частоты обнаружения яиц описторхисов в копрома-териале и уровня противоописторхозных антител в сыворотках крови пациентов показал наличие сильной прямой корреляционной связи между этими показателями (г = 0,86). Яйца опи-сторхисов чаще встречались в копроматериале лиц с высокими титрами специфических антител в сыворотке крови. В группе серопозитивных лиц с титром 1§О 1:100, яйца описторхисов обнаружены только у 50%, то среди пациентов с уровнем 1§О 1:400-1:800 - уже у 78,2 и 80% соответственно (см. рисунок).

Отсутствие яиц описторхисов при наличии специфических антител частично можно объяснить давностью заражения, небольшим количеством паразитов, недостаточной эффективностью копроовоскопического обследования. Нельзя забывать и о возможных ложноположительных реакциях у части обследованных. Ложноположительные результаты в ИФА с опи-сторхозным антигеном связаны с наличием у описторхисов антигенных детерминант, общих с некоторыми гельминтами (эхинококки, фасциолы, дикроцелии и др.), другими микроорганизмами и собственными антигенами хозяина [5-7]. Возможно существование еще одной причины: В.И. Иванских и

В.В. Близнюк [8] обнаружили, что при экспериментальном заражении хомячков описторхисами и вирусом простого герпеса 2-го типа (ВПГ-2) наблюдается отсутствие яиц в матке гельминтов и поражение семенников у 10-40% описторхисов, выделенных от зараженных животных. Не исключено, что вирусы ВПГ-1, ВПГ-2, ЦМВ, инфицированность населения которыми достигает 90%, могут проникать в паразитирующие у человека описторхисы, вызывая у них аналогичные изменения, что затрудняет постановку паразитологического диагноза.

Применение какого-то одного копроовоскопического метода, даже такого высокоэффективного, как метод уксусно-эфирного осаждения, на территориях с низким и средним уровнем инвазированности населения, к которым относится Омская область, не всегда дает удовлетворительные результаты. Средний уровень яйцепродукции (косвенно указывающий на интенсивность инвазии) у инвазированных, проживающих в г. Омске и на юге Омской области, достаточно низкий и составляет, по нашим данным, в среднем 33,1 ± 5,7я/г у серопозитивных лиц и 9,6 ± 2,3 я/г у серонегативных.

С целью сравнительной оценки информативности ко-проовоскопических методов было проведено обследование 411 жителей г. Омска и Омской области с параллельным использованием метода уксусно-эфирного осаждения и метода Като-Миура. У 26 (6,3 ± 4,8%) человек яйца описторхисов выявлены как методом уксусно-эфирного осаждения, так и методом Като-Миура. У 8 (1,95 ± 4,9%) человек яйца гельминтов обнаружены только при использовании для копро-овоскопии метода уксусно-эфирного осаждения и не обнаружены при просмотре толстых мазков под целлофаном. В то же время, у 4 (0,97 ± 4,9%) человек яйца описторхисов выявлены только при просмотре копроматериала методом Като-Миура, а эфирно-уксусный метод дал отрицательный результат. Всего при использовании одновременно двух методов паразитологической диагностики описторхоза выявлено 38 (9,2 ± 4,7%) инвазированных лиц.

Для лабораторной диагностики описторхоза нецелесообразно ограничиваться каким-либо одним методом. Метод ИФА кажется более эффективным, однако постановка диагноза на основании только этого теста неправомочна из-за высокой вероятности ложноположительных и ложноотри-цательных результатов [7, 9]. Среди паразитологических методов диагностики описторхоза не существует метода, обладающего 100% чувствительностью.

Заключение. На территориях со средним и низким уровнем инвазированности населения описторхисами целесообразно использовать комплекс методов, включающий исследование сыворотки крови на наличие специфических иммуноглобулинов к антигенам описторхисов и дву-троекратное исследование кала двумя указанными выше копроовоскопи-ческими методами, что позволит повысить качество диагностики описторхозной инвазии.

ЛИТЕРАТУРА

1. Гузеева Т.М. Состояние заболеваемости паразитарными болезнями в Российской Федерации в условиях реорганизации службы.

Медицинская паразитология и паразитарные болезни. 2008; 1: 3-11.

2. Заболеваемость протозоозами и гельминтозами населения Российской Федерации в 2010—2011 гг. Информационный сборник статистических и аналитических материалов. М., 2012.

3. О санитарно-эпидемиологической обстановке в Омской области в 2011 году. Гос. доклад. Available at: http://www.55.rospotrebnadzor.ru/249.

4. Лабораторные методы диагностики паразитарных заболеваний. МУК 4.2.735-99. М.: Минздрав России; 2000.

5. Лепехин А.В., Ратнер Г.М., Менявцева Т.А. Перекрестно реагирующие антигены Opisthorchis felineus и Salmonella typhi и их возможное влияние на клиническое течение брюшного тифа. Медицинская паразитология и паразитарные болезни. 1990; 4: 33-6.

6. Ратнер Г.М., Кускова З.Р., Менявцева Т.А., Стручкова С.В. О наличии антигенной общности у O. felineus c белками сыворотки крови человека. В кн.: Описторхоз. Современное состояние проблемы, перспективы развития: Сборник тезисов юбилейной конференции. Тюмень; 1991: 204-6.

7. Серологические методы лабораторной диагностики паразитарных заболеваний. МУ 3.2.1173-02. М.: Минздрав России; 2003.

8. Иванских В.И., Близнюк В.В. Влияние описторхисов на проявления вирусов герпеса второго типа в эксперименте и их возможное участие в механизме возникновения первичного рака печени. Медицинская паразитология и паразитарные болезни. 1996; 2: 23 - 6.

9. Актуальные биогельминтозы и протозоозы в Западной Сибири (эпидемиология, биология, диагностика, профилактика). Методические рекомендации. М.: Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека; 2008.

REFERENCES

1. Guzeeva T.M. State incidence of parasitic diseases in the Russian Federation in the reorganization of the service. Medicinskaja parazitologija i parazitarnye bolezni. 2008; 1: 3-11 (in Russian).

2. Morbidity protozoozami and worm infections in the Russian Federation in 2010-2011. Informatsionnyj sbornik statisticheskikh i analiticheskikh materialov. Moscow; 2012 (in Russian).

3. On the sanitary-epidemiological situation in the Omsk region in 2011. Gos. doklad. Available at : http://www.55.rospotrebnadzor.ru/249 (in Russian).

4. Laboratory methods for diagnosis of parasitic diseases. MUK 4.2.73599. Moscow: Minzdrav Rossii; 2000 (in Russian).

5. Lepehin A.V., Ratner G.M., Menjavtseva T.A. Cross-reactive antigens of Opisthorchis felineus and Salmonella typhi and their potential impact on the clinical course of typhoid fever. Meditskinskaja parazitologija i parazitarnye bolezni. 1990; 4: 33-6 (in Russian).

6. Ratner G.M., Kuskova Z.R., Menjavceva T.A., Struchkova S.V. The presence of an antigen common O.felineus with proteins of human blood serum. In: Opistorhoz. Sovremennoe sostojanie problemy, perspektivy razvitija: Sbornik tezisov jubilejnoj konferentsii. Tjumen'; 1991: 204-6 (in Russian).

7. Serological methods for the laboratory diagnosis of parasitic diseases. MU 3.2.1173-02. M.: Minzdrav Rossii; 2003 (in Russian).

8. Ivanskih V.I., Bliznjuk V.V. Influence of opistorhis on the manifestation second type of herpes virusin the experiment, and their possible involvement in the mechanism of primary liver cancer. Meditsinskaja parazi-tologija i parazitarnye bolezni. 1996; 2: 23-6 (in Russian).

9. Actual biogelmintozy and protozoozy in Western Siberia (epidemiology, biology, diagnosis, prevention). Metodicheskie rekomendatsii. M.: Federal'naja sluzhba po nadzoru v sfere zashchity prav potrebitelej i blagopoluchija cheloveka; 2008 (in Russian).

Поступила 02.10.13

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014 удк 578.825.12.083.2

О.Ю. Сильвейстрова, Э.А. Домонова, О.Ю. Шипулина

валидация набора реагентов для количественного определения ДНК цитомегаловируса человека в биологическом материале методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени

ФБУН «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологиии» Роспотребнадзора, 111123, г. Москва

Проведена валидация набора реагентов, предназначенного для выявления и количественного определения ДНК цитомегаловируса (ЦМВ) человека в биологическом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени, относительно международного стандарта ВОЗ - 1st WHO International Standard for human cytomegalovirus for nucleic acid amplification techniques NIBSC code 09/162, version 3.0, 30/11/2010 (Великобритания). Для выполнения измерений использовали набор реагентов "АмплиСенс® CMV-скрин/монитор-ГЬ» и стандартный образец предприятия (СОП) ДНК ЦМВ (ФБУН Центральный научно-исследовательский институт (ЦНИИ) эпидемиологии Роспотребнадзора). Пятикратные разведения международного стандарта ВОЗ и СОП проводили в концентрации ДНК ЦМВ от 106 до 102. Постановку ПЦР и анализ результатов выполняли на программируемом амплификаторе с системой детекции флюоресцентного сигнала в режиме реального времени «Rotor-Gene Q" ( Qiagen, ФРГ). По итогам трех серий экспериментов, включающих все этапы ПЦР-исследования, ввели коэффициент пересчета количественного определения ДНК ЦМВ из копии/мл в МЕ/мл для данного набора реагентов, равный 0,6.

Ключевые слова: валидация; количественное определение ДНК; Cytomegalovirus hominis; цитомегаловирус человека; ЦМВ; международный стандарт ВОЗ; ПЦР в режиме реального времени.

O.Yu. Silveiystrova, E.A. Domonova, O.Yu. Shipulina

THE VALIDATION OF KIT OF REAGENTS FOR QUANTITATIVE DETECTION OF DNA OF HUMAN CYTOMEGALOVIRUS IN BIOLOGICAL MATERIAL USING POLYMERASE CHAIN REACTION TECHNIQUE IN REAL TIME OPERATION MODE

The central research institute of epidemiology of Rospotrebnadzor, 111123 Moscow, Russia

The validation of kit of reagents destined to detection and quantitative evaluation of DNA of human cytomegalovirus in biological material using polymerase chain reaction technique in real time operation mode was implemented. The comparison was made against international WHO standard - The first WHO international standardfor human cytomegalovirus to implement measures the kit ofreagents "AmpliSens CMV-screen/monitor-FL" and standard sample of enterprise DNA HCMV (The central research institute of epidemiology ofRospotrebnadzor) was applied. The fivefold dilution of international WHO standard and standard sample of enterprise were carried out in concentrations of DNA HCMV from 106 to 102. The arrangement of polymerase chain reaction and analysis of results were implemented using programed amplifier with system of detection offluorescent signal in real-time mode "Rotor-Gene Q " ("Qiagen ", Germany). In the total ofthree series of experiments, all stages of polymerase chain reaction study included, the coefficient of translation of quantitative evaluation ofDNA HCMV from copy/ml to ME/ml equal to 0.6 was introducedfor this kit of reagents.

Keywords: validation, quantitative evaluation, DNA, cytomegalovirus hominis, human cytomegalovirus, international WHO standard, polymerase chain reaction, real-time mode

Для корреспонденции: Сильвейстрова Ольга Юрьевна, мл. науч. сотр. Адрес: 111123, Москва, ул. Новогиреевская, 3а. E-mail: olga.siveystrova@pcr.ms

В настоящее время во многих научно-исследо-вательских и клинико-диагностических лабораториях для диагностики цитомегаловирусной (ЦМВ) инфекции применяются современные методы анализа, основанные на полимеразной