CC BY
109
Оригинальные исследования
195
СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ИНВАЗИВНОЙ СПОСОБНОСТИ ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ PROTEUS MIRABILIS И MORGANELLA MORGAN//
Н.М. Замалютдинова, Л.М. Богомольная, И.Б. Частухина, М.Р. Шарипова, А.М. Марданова Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань, Россия
Invasive ability of proteus mirabilis and morganella morganii
N.M. Zamaliutdinova, L.B. Bogomolnaya, I.B. Chastukhina, M.R. Sharipova, A.M. Mardanova Kazan (Volga region) Federal University, Kazan, Russia
Исследовали цитотоксическую и инвазивную способность энтеробактерий Proteus mirabilis 5127-1 и Morganella morganii ZM в отношении клеток эпителиоидной карциномы шейки матки человека (HeLa-M). Показали, что оба штамма обладают инвазивной активностью, эффективность которой зависит от соотношения бактериальных и эукариотических клеток при инфицировании. P. mirabilis проявляет цитотоксический эффект в отношении клеток HeLa-M, выражающийся в откреплении клеток от пластикового носителя. Эффект может быть связан с наличием внеклеточной протеолитической активности у P. mirabilis в отличие от M. morganii, а также с более высокой гемолитической активностью штамма P. mirabilis.
Ключевые слова: энтеробактерии, HeLa-M, протеолитическая активность, инвазия, цитотоксичность.
Способность к инвазии и персистенции в клетках хозяина некоторых возбудителей уропатогенных инфекций определяет особенности патогенеза заболеваний и их терапии [1—4]. Так, например, показано что инфекции, вызванные инвазивными P. mirabilis, более устойчивы к терапии и их легче получить экспериментально у подопытных мышей в отличие от инфекций, вызванных уропатогенными, но неинвазивными E. coli [5].
Proteus mirabilis и Morganella morganii — оппортунистические патогены, способные вызывать инфекции различной локализации, но чаще всего — инфекции мочевыделительной системы [6, 7]. Более 70% случаев образования камней в почках инфекционной этиологии связано с инвазией клеток P. mirabilis [8, 9]. Установлено, что инвазивная способность бактерий P. mirabilis зависит от клеточной дифференци-ровки и многократно усиливается в культуре роящихся клеток [10, 11]. Данных литературы по инвазии бактерий M. morganii чрезвычайно мало. В отличие от таких хорошо изученных энтеробактерий как Salmonella [12], Shigella [13] и Yersinia [14] данных о механизме инвазии бактерий P. mirabilis и M. morganii нет.
Цель исследования — охарактеризовать инвазивную способность штаммов клинических изолятов P. mirabilis 5127-1 и M. morganii ZM, выделенных от урологических пациентов.
Материал и методы
Бактерии и их культивирование
В работе использовали штаммы клинических изолятов P. mirabilis 5127-1 и M. morganii ZM, выделенные от урологических больных и предоставленные Е.С. Божокиной (Институт цитологии, Санкт-Петербург). Бактерии культивировали в среде LB [15] с аэрацией 200 об/мин при 37°С.
Клеточная линия
Клетки стабильной линии HeLa-М (эпителио-идная карцинома шейки матки человека, сублиния
е-mail: nelya-zamalutdinova@mail.ru
Here we discuss the ability of Proteus mirabilis 5127-1 and Morganella morganii ZM to invade human cervical epithelial adenocarcinoma cells (HeLa-M) and to cause cytotoxicity in those cells. We found that ability of bacteria to invade HeLa-M cells depended on the multiplicity of infection for both strains. Cytotoxicity of P. mirabilis on HeLa-M cells was evaluated through quantification of eukaryotic cell detachment from plastic. We hypothesized that cytotoxicity of P.mirabilis could be due its extracellular proteolytic and hemolytic activities. In contrast, no cytotoxicity was detected in HeLa-M cells infected with M.morganii.
Key words: Enterobacteriaceae, HeLa-M cell lines, proteolytic activity, invasion, cytotoxicity.
HeLa), полученные из Российской коллекции клеточных культур позвоночных Института цитологии РАН, культивировали на 6-луночных планшетах (Nunc, Дания) в течение 48 ч в атмосфере 5% СО2 при 37°С в среде DMEM с добавлением 10% эмбриональной сыворотки (Sigma, США). Количество клеток подсчитывали с использованием камеры Горяева.
Оценка инвазии
Инвазию изучали гентамициновым методом [16]. Бактерии на 24 ч роста центрифугировали при 15000 об/мин 5 мин, отмывали 1 раз средой LB, ресуспендировали в 1 мл среды DMEM и добавляли к клеткам в количестве, необходимом для величины заражения. Количество клеток бактерий определяли по поглощению при 590 нм. За единицу СФ принимали 4х107 бактерий в 1 мл. Культуру клеток HeLa с бактериями центрифугировали при 2000 об/мин в течение 5 мин после чего инкубировали в атмосфере 5% СО2 при 37°С в течение 2 ч. Затем клетки промывали 3 раза натрий-фосфатным буфером (PBS) [15]. Прикрепившиеся к пластиковому носителю клетки HeLa удаляли,добавляя 1 мл раствора трипсина (Sigma, США), после чего к суспензии клеток добавляли гентамицин до конечной концентрации 50 мкг/мл и инкубировали в течение 2 ч при 37°С для уничтожения всех внеклеточных бактерий. Далее 400 мкл суспензии клеток HeLa лизировали 200 мкл 4,5% раствором дезоксихолата (Sigma, США). 100 мкл лизата быстро титровали в 900 мкл холодной среды LB и по 100 мкл суспензии высевали на чашки с твердым агаром для подсчета колониеобразующих единиц (КОЕ). За 100% КОЕ внутриклеточных бактерий принимали наибольшее число КОЕ.
Оценка жизнеспособности
Жизнеспособность клеток HeLa определяли методом исключения красителя с использованием три-панового синего [17]: живые клетки не проницаемы,
Гены & Клетки Том IX, № 3, 2014
196
Оригинальные исследования
а мертвые клетки проницаемы для красителя. Для определения количества живых клеток 200 мкл суспензии из 1 мл снятых раствором трипсина клеток смешивали с равным количеством 0,4% (w/v) раствора трипанового синего в PBS и выдерживали в течение 5 мин при комнатной температуре. Количество живых и мертвых клеток подсчитывали с использованием камеры Горяева. Жизнеспособность рассчитывали по формуле, учитывая результаты подсчета в 25 «больших квадратах»:
Ж = (n живых клеток / n общее) х 100%.
Статистический анализ
Статистическую обработку данных проводили с использованием программы Microsoft Excel путем расчета средних значений и средних квадратических отклонений (s). Для сравнения групп использовали критерий Стьюдента при P = 0,05.
Результаты
Исследовали динамику изменения количества клеток HeLa-М при культивировании в течение 48 ч в стандартных условиях (рис. 1). Как видно из графика, число клеток в культуре увеличивается линейно в процессе культивирования. Исходная плотность при посеве составляла около 1,5х104 клеток на см2, через 24 ч культивирования плотность достигала примерно 2,7х104 на см2, а через 48 ч — 4,7х104 на см2.
60 -л
О
0 ч 24 ч 48 ч
Рис. 1. Плотность клеток HeLa-М в монослое
при культивировании в течение 48 ч в среде DMEM
Таким образом, плотность клеток HeLa-М в данных условиях роста увеличивалась линейно, клетки росли с образованием монослоя, и окрашивание трипановым синим показало, что количество жизнеспособных клеток составляло не менее 96%.
На рис. 2 представлены данные по влиянию бактерий разных видов, P. mirabilis 5127-1 и M. morganii ZM, на жизнеспособность клеток HeLa-M и их адгезию. Видно, что два вида энтеробактерий оказывают различное влияние на клеточную культуру. Так, при инкубации клеток HeLa с бактериальной культурой M. morganii ZM в течение 2 ч не наблюдали значительного изменения в монослое клеток. Отсутствовал цитотоксический эффект, проявляющийся в виде открепления клеток от субстрата (рис. 2А). Увеличение количества бактериальных клеток с 1:10 (10 бактерий на одну эукариотическую клетку) до 1:100 не оказывало видимого эффекта. В отличие от M. morganii, бактерии P. mirabilis оказывали цитотоксическое действие на клетки HeLa.
Наблюдали уменьшение количества клеток в монослое, вызванное откреплением клеток. Эффект зависел от соотношения клеток HeLa к бактериям. Так, при соотношении равном 1:10 и 1: 50 плотность клеток в монослое уменьшалась на 10 и 20% соответственно, а при соотношении 1:100 — более чем на 80% в сравнении с контролем (рис. 2Б). При этом жизнеспособность клеток в монослое HeLa в случае инкубирования с P. mirabilis и M. morganii составляла 91 и 94% соответственно.
Б
К
1
2
3
К
1
2
3
Рис. 2. Количество клеток HeLa в монослое через 2 ч инкубации культуры с бактериями M. morganii ZM (А) и P. mirabilis 5127-1 (Б) в различных соотношениях: 1 — 1:10; 2 — 1:50; 3 — 1:100.
К — количество клеток в культуре без бактерий
Рис. 3. Эффективность инвазии P. mirabilis 5127-1 (1) и M. morganii ZM (2) в клетки HeLa при разном соотношении клеток к бактериям (1:10, 1:100). Колонки показывают относительные значения входа бактерий, нормализованное к 100%
Гены & Клетки Том IX, № 3, 2014
Оригинальные исследования
197
Инвазию бактерий оценивали с помощью количественного гентамицинового метода. Клетки HeLa инкубировали в течение 2 ч с бактериальными культурами P. mirabilis и M. morganii при соотношении клеток 1:10 и 1:100. Как видно из рисунка 3, при соотношении клеток HeLa к бактериям равном 1:10 штамм P. mirabilis инвазировал немного эффективнее штамма M. morganii.
Процент от входа составлял 40 и 30% соответственно. Однако при увеличении инфицирующей дозы (соотношение клеток 1:100), эффективность инвазии повышалась только для культуры M. morganii. Количество внутриклеточных бактерий (КОЕ) было выше более чем в 4 раза в сравнении с P. mirabilis.
Обсуждение
Штаммы энтеробактерий, выделенные от урологических больных, были ранее идентифицированы как M. morganii ZM и P. mirabilis 5127-1 и охарактеризованы [18]. Штаммы различаются рядом свойств и в том числе способностью к секреции внеклеточной протеиназы и гемолитической активностью. Так, штамм P. mirabilis 5127-1 продуцирует в среду металопротеиназу, которая появляется уже на первых часах роста культуры. Бактериальный штамм M. morganii ZM не проявляет внеклеточной протеолитической активности [18]. Кроме того, штамм P. mirabilis 5127-1 проявляет значительно более высокие гемолитические свойства, чем штамм M. morganii ZM.
Способность к инвазии эукариотических клеток рассматривается как один из важнейших факторов вирулентности уропатогенных возбудителей, поскольку приводит к хронизации болезни и серьезно затрудняет терапию [19]. Согласно статистическим данным чаще всего виды P. mirabilis и M. morganii вызывают инфекции у пациентов при длительном использовании катетеров [20]. Причем, P. mirabilis значительно чаще встречается при таких инфекциях, чем M. morganii [21]. Это может быть связано с особенностями генетики и физиологии этих двух видов бактерий, а, в частности, с их различной инвазивной способностью.
Исследование способности к инвазии штаммов M. morganii ZM и P. mirabilis 5127-1 клеток HeLa-M показало, что оба штамма энтеробактерий обладают способностью эффективно инвазировать эукариотические клетки. При соотношении бактерий к эукариотическим клеткам равном 1:10 оба штамма проявляли сходную эффективность инвазии: 30 и 40%. Однако при повышении инфекционной дозы в 10 раз (соотношение клеток 1:100), эффективность инвазии M. morganii ZM повышалось до максимальной, а в случае штамма P. mirabilis 5127-1 количество внутриклеточных бактерий было значительно ниже и не превышало 35% от контроля (см. рис. 3). Такие результаты могут быть объяснены тем фактом, что в случае P. mirabilis наблюдали открепление клеток HeLa от пластикового носителя после инкубации культуры с бактериями в течение 2 ч. Интенсивность открепления клеток HeLa зависела от величины инфицирующей дозы бактерий P. mirabilis. При стократном избытке бактерий наблюдали открепление более чем 80% клеток монослоя. В случае M. morganii ZM, инкубация клеток HeLa с бактериями в соотношении 1:10 и 1:100 не приводила к заметному снижению количества клеток в монослое культуры. Такое различие в воздействии разных штаммов бактерий на эукариотические клетки
может быть связано с цитотоксическим эффектом, проявляющимся в нарушении адгезивных свойств эукариотических клеток. Ранее для бактерий P. mirabilis был показан цитотоксический эффект в отношении клеток Vera, который может быть связан с гемолитической активностью бактерий [10]. Также предполагается, что цитотоксический эффект P. mirabilis может быть связан с активностью аутотранспортера наружной мембраны [22].
Аналогичные исследования по инвазии
Pseudomonas aeruginosa показали, что бактерии способны инвазировать и персистировать в эпителиальных клетках среднего уха человека (HMEECs)
[23]. Эффективность инвазии зависела от величины инфицирующей дозы. При соотношении клеток к бактериям 1:50, минимальный повреждающий эффект клеток HMEECs наблюдали только через 8 ч инкубации, а через 24 ч происходило полное разрушение монослоя культуры. Увеличение количества бактерий до 1:100 ускоряло наступление цитотоксического эффекта. В исследованиях C.B.C. Lima с соавт. (2013) установлено, что эффективность инвазии Shigella flexneri в первичную культуру гепа-тоцитов крыс и цитотоксический эффект бактерий на клетки также зависит от инфицирующей дозы [24].
Открепление клеток HeLa от пластикового носителя в случае инкубации с P.mirabilis коррелирует с наличием у бактерий внеклеточной протеолитической активности. Можно предположить, что именно активность внеклеточной металлопротеиназы ZapA ответственна за цитотоксический эффект, отсутствующий в случае бактерий M. morganii. Известно, что бактериальные протеиназы могут вызывать круглоклеточную дегенерацию клеток различных культур [25, 26].
Использование только гентамицинового метода недостаточно для оценки эффективности инвазии различных штаммов, поскольку количество КОЕ внутриклеточных бактерий зависит от состояния монослоя культуры и может значительно снижаться в результате цитотоксического эффекта, проявляющегося в откреплении клеток культуры от пластикового носителя. Это приводит к заниженным результатам при подсчете общего количества внутриклеточных бактерий.
Таким образом, результаты наших исследований показали, что клинические изоляты уропатогенных энтеробактерий P. mirabilis 5127-1 и M. morganii ZM способны эффективно инвазировать в клетки HeLa-М. Однако бактерии P. mirabilis, в отличие от M. morganii, вызывают цитотоксический эффект, выражающийся в откреплении клеток HeLa от пластикового носителя, коррелирующий с более высокой гемолитической активностью и наличием внеклеточной протеиназы.
Благодарности
Работа выполнена в рамках государственной программы повышения конкурентоспособности Казанского (Приволжского) федерального университета среди ведущих мировых научно-образовательных центров, поддержана грантом РФФИ и Правительством РТ (проект №13-04-97130) и часть работы софинансирована за счет средств субсидии, выделенной Казанскому федеральному университету для выполнения государственного задания в сфере научной деятельности (проект 14-83, 0211/02.11.10083.001).
Гены & Клетки Том IX, № 3, 2014
198
Оригинальные исследования
ЛИТЕРАТУРА:
1. Okamura N., Nagai T., Nakaya R. et al. HeLa cell invasiveness and О antigen of Shigella flexneri as separate and prerequisite attributes of virulence to evoke keratoconjunctivitis in guinea pigs. Infect. Immun. 1983; 39: 505-13.
2. Mehlham I.J., Eide E.L., Sanders A.C. et al. Methodology for recognition of invasive potential of Escherichia coli. J. Assoc. Anal. Chem. 1977; 60: 546-62.
3. Kihlstrom E. Infections of HeLa cells with Salmonella typhimurium 395 MS and MR10 bacteria. Infect. Immun. 1977; 17: 290-5.
4. Peerbooms P.G.H., Verweij A.M.J.J., MacLaren D.M. Vero Cell Invasiveness of Proteus mirabilis. Infect. Immun. 1984; 43(3): 1068-71.
5. Gorrill R.H., DeNavasquez S.J. Experimental pyelonephritis in the mouse produced by Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa and Proteus mirabilis. J. Pathol. Bacteriol. 1964; 87: 79-87.
6. Endimiani A., Luzzaro F., Brigante G. et al. Proteus mirabilis bloodstream infections: risk factors and treatment outcome related to the expression of extended-spectrum beta-lactamases. Antimicrob. Agents Chemother. 2005; 49(7): 2598-605.
7. Jakobsen S.M., Stickler D.J., Mobley H.L.T. et al. Complicated catheter-associated urinary tract infections due to Escherichia coli and Proteus mirabilis. Clin. Microbiol. Rev. 2008; 21(1): 26-59.
8. Torzewska A., Budzynska A., Bialczak-Kokot M. et al. In vitro studies of epithelium-associated crystallization caused by uropathogens during urinary calculi development. Microb. Pathog. 2014; 71-2: 25-31.
9. Mathoera R.B., Kok D.J., Verduin C.M. et al. Pathological and therapeutic significance of cellular invasion by Proteus mirabilis in an enterocystoplasty infection stone model. Infect. Immun. 2002; 70(12): 7022-32.
10. Peerbooms P.G.H., Verweij A.M.J.J., MacLaren D.M. Vero Cell Invasiveness of Proteus mirabilis. Infect. Immun. 1984; 43(3): 1068-71.
11. Allison C., Coleman N., Jones P.L. et al. Ability of Proteus mirabilis to invade human urothelial cells is coupled to motility and swarming differentiation. Infect. Immun. 1992; 60(11): 4740-6.
12. Kihlstrom E. Infections of HeLa cells with Salmonella typhimurium 395 MS and MR10 bacteria. Infect. Immun. 1977; 17: 290-5.
13. Larsson P., Oiling S. О-antigen distribution and sensitivity to the bactericidal effect of normal human serum of Proteus strains from clinical specimens. Med. Microbiol. Immunol. 1977; 163: 77-82.
14. Schiemann D.A., Devenish J.A. Relationship of HeLa cell infectivity to biochemical, serological and virulence characteristics of Yersinia enterocolitica. Infect. Immun. 1982; 35: 497-506.
15. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd ed. NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 1989.
16. Bozhokina E.S., Tsaplina O.A., Efremova T.N. et al. Bacterial invasion of eukaryotic cells can be mediated by actin-hydrolysing metalloproteases grimelysin and protealysin. Cell Biol. Int. 2011; 35: 111-8.
17. Шамов О.В., Орлов Д.С., Пазина Т.Ю. и др. Изучение молекулярно-клеточных основ цитотоксического действия антимикробных пептидов на опухолевые клетки. Фундаментальные науки. Биологические исследования 2012; 5: 207-12.
18. Замалютдинова Н.М., Галиева И.Р., Арапова А.О. и др. Протеолитическая активность бактерий трибы Proteae. Вестник КГТУ 2013; 10: 191-4.
19. Pearson M.M., Sebaihia M., Churcher C. et al. Complete
genome sequence of uropathogenic Proteus mirabilis, a master of both adherence and motility. Bacteriology 2008; 190:
4027-37.
20. Wang R., Neoh K.G., Kang E.T. et al. Antifouling coating with controllable and sustained silver release for long-term inhibition of infection and encrustation in urinary catheters. J. Biomed. Mater. Res. B. Appl. Biomat. 2014; doi: 10.1002/jbm.b.33230.
21. Kochiashvili D., Khuskivadze A., Kochiashvili G. et al. Role of the bacterial vaccine solco-urovac in treatment and prevention of recurrent urinary tract infections of bacterial origin. Georg. Med. News. 2014; 231: 11-6.
22. Alamuri P., Mobley H.L.T. A novel autotransporter of uropathogenic Proteus mirabilis is both a cytotoxin and an agglutinin. Mol. Microbiol. 2008; 68(4): 997-1017.
23. Mittal R., Grati1 M., Gerring R. et al. In vitro interaction of Pseudomonas aeruginosa with human middle ear epithelial cells. Plos One 2014; 9(3): e91885.
24. Lima C.B.C., Santos S.A., Andrade D.R.Jr. Hypoxic stress, hepatocytes and CACO-2 viability and susceptibility to Shigella Flexneri invasion. Rev. Inst. Med. Trop. Sao Paulo. 2013; 55(5): 341-6.
25. Kothary M.H., McCardell B.A., Frazar C.D. et al. Characterization of the zinc-containing metalloprotease encoded by zpx and development of a species-specific detection method for Enterobacter sakazakii. Appl. Environ. Microbiol. 2007; 73(13): 4142-51.
26. Lockwood D.E., Kreger A.S., Richardson S.H. Detection of toxins produced by Vibrio fluvialis. Infect. Immun. 1982; 35(2): 702-8.
Поступила: 19.08.2014
Гены & Клетки Том IX, № 3, 2014
