CC BY
63
ИММУНОЛОГИЯ № 2, 2012
КЛЕТОЧНАЯ ИММУНОЛОГИЯ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012 УДК 612.017.1:611-018.83
О. Ю. Леплина1, M. A. Тихонова1, Т. В. Тыринова1, Е. А. Алямкина2, Е. В. Долгова2,
С. С. Богачев2, А. А. останин1, Е. Р. Черных1
сравнительная характеристика фенотипа и цитокинсекреторной активности дендритных клеток человека, генерированных in vitro в присутствии интЕРФЕРонА-а и интерлейкина-4
1НИИ клинической иммунологии СО PAMH (630099, г Новосибирск, ул. Ядринцевская, д. 14);
2Институт цитологии и генетики СО Ран (630090, г Новосибирск, пр. Ак. Леонтьева, д. 10)
В работе проведена сравнительная характеристика фенотипа и цитокинсекреторной активности дендритных клеток (ДК) у здоровых лиц (n = 31), генерированных in vitro в присутствии интерферона-а (IFN-ДК) и интерлейкина (IL)-4 (IL-4-ДК). Показано, что популяция IFN-ДК является частично зрелыми клетками и отличается от IL-4-ДК повышенным содержанием CD123+-ДК, а также клеток, экспрессирующих TRAIL и В7-Н1, что свидетельствует об их более высоком цитотоксическом потенциале. Кроме того, IFN-ДК отличаются повышенной продукцией Th1-провоспалительных (IFN-y, IL-2, IL-1P, фактор некроза опухоли а, IL-17) и Т1п2-противовоспалительных цитокинов (IL-10, IL-5), а также GCSF и МСР-1. Таким образом, судя по результатам анализа поверхностных маркеров и продуцируемых цитокинов, полагаем, что IFN-ДК обладают более выраженной потенциальной способностью активировать реакции клеточного и гуморального иммунитета, что позволяет более эффективно их использовать в качестве лечебных вакцин при опухолевых и хронических инфекционных заболеваниях.
Ключевые слова: дендритные клетки, IFN-a, IL-4, фенотип, цитокины
Leplina O.Yu., Tikhonova M.A., Tyrinova T.V., Alyamkina E.A., Dolgova E.B., Bogachev S.S., Ostanin A.A., Chernykh E.R.
COMPARATIVE CHARACTERISTIC OF THE PHENOTYPE AND CYTOKINE-SECRETING ACTIVITY OF HUMAN DENDRITIC CELLS GENERATED IN viTRo IN THE PRESENCE OF INTERFERON-ALPHA AND INTERLEUKIN-4
The present study was designed to obtain comparative characteristics of the phenotype and cytokine-secreting activity of human dendritic cells (DC) from the healthy subjects (n = 31), generated in vitro in the presence of interferon-alpha (IFN-DC) and interleukin-4 (IL-4) (IL-4-DC). It was shown that the IFN-DC population is constituted by partially mature cells and differs from the IL-4-DC population in an increased content of CD123+ dendritic cells expressing TRAIL and B7-HI which suggests their high cytotoxic potential. Moreover, the IFN-dendritic cells are characterized by the elevated production of Th1-proinflammtory cytokines (IFN-gamma, Il-2, IL-1-beta, tumour necrosis factor-alpha, IL-17) and Th2-proinflammatory cytokines (IL-10, IL-5) as well as G-CSF and MCP-1. Thus the results of the analysis of surface markers and cytokines being produced indicate that IFN-DC show a higher potential ability to activate reactions of cell-mediated and humoral immunity which provides an opportunity of using them as therapeutic vaccines for the management of neoplastic and chronic infectious diseases.
Key words: dendritic cells, interferon-alpha, interleukin-4, phenotype, cytokines
Дендритные клетки (ДК) являются наиболее эффективными антигенпрезентирующими клетками и играют важную роль в инициации и поддержании специфического иммунного ответа. По происхождению выделяют миелоидные ДК, характеризующиеся высокой способностью секретировать интерлейкин (IL)-12, и плазмоцитоидные ДК, продуцирующие интерферон (IFN)-a. Ведущую роль в запуске адаптивного иммунного ответа отводят миелоидным ДК, способным активировать наивные Т-лимфоциты [2, 25].
Опухолевый процесс и хронические инфекционные заболевания сопровождаются существенными количественными и функциональными изменениями ДК, что рассматривается одним из основных механизмов пер-систенции инфекции и ускользания опухоли от иммун-
Черных Елена Рэмовна - д-р мед. наук, проф., чл.-кор. РАМН.
ного надзора [15, 42-44]. При этом результаты исследований на животных [1] и клинических испытаний у человека [10, 27, 30, 40] показали, что вакцинация мие-лоидными ДК, которые презентируют вирусные или опухолевые антигены, позволяет восстановить специфический иммунный ответ. Следует отметить, что активной апробации лечебных дендритно-клеточных вакцин во многом способствовала разработка методов получения большого количества миелоидных ДК из моноцитов периферической крови.
Традиционно ДК генерируют путем культивирования моноцитов с гранулоцитарно-макрофагальным колониестимулирующим фактором (GMCSF) и IL-4 [41]. Однако данный тип ДК (IL-4-ДК) характеризуется относительно низкой миграционной активностью и в условиях дефицита ростовых факторов может трансформироваться в клетки с фенотипом моноцитов [14]. Существует другой способ генерации ДК при замене IL-4 на IFN-a [36, 38, 39], который представляется бо-
- 60 -
КЛЕТОЧНАЯ ИММУНОЛОГИЯ
Фенотипическая характеристика IL-4-ДК и IFN-ДК Таблица 1
Маркер IL-4-ДК (n = 14) IFN-ДК (n = 14)
M ± S.E. median LQ-UQ М ± S.E. median LQ-UQ
CD14 11,1 ± 2,4 8,0 3-19 22,2 ± 3,6* 23,0 10-27
CD83 52,8 ± 6,2 47,4 36-51 34,6 ± 3,7* 36,0 22-46
CD86 58,3 ± 3,6 50,0 49-62 65,2 ± 4,2 54,0 48-71
CD25 29,4 ± 2,6 27,8 14-38 25,1 ± 3,5 26,0 13-36
CD1a 48,8 ± 2,3 38,2 28-54 10,4 ± 2,0* 10,0 7,5-11
CD123 6,7 ± 1,8 6,1 2-12 40,1 ± 3,4* 36,5 25-49
HLA-DR 91,8 ± 7,4 89,4 80-97 86,4 ± 9,2 90,1 76 - 92
Примечание. Относительное содержание (в %) различных субпопуляций ДК представлено в виде средних (M± S.E.), медианных (median) и диапазона 25-75% квартальных значений (LQ-UQ). * - р < 0,01 (f-критерий Стьюдента для связанных выборок).
лее физиологичным, поскольку IFN-a является ранним медиатором врожденного иммунитета и продуцируется в больших количествах в ответ на стимуляцию инфекционными антигенами и провоспалительными цитокинами. Генерируемые в присутствии IFN-a ДК (IFN-ДК) отличаются от IL-4-ДК более высокой миграционной активностью, большей стабильностью в условиях дефицита ростовых факторов, способностью стимулировать как Th1-, так и ^2-ответ [5, 8, 33, 36, 37]. Поэтому IFN-ДК представляют большой интерес с точки зрения клинического применения в качестве лечебных вакцин. Так, результаты недавних исследований показали, что IFN-ДК являются более эффективными стимуляторами CD8+-эффекторных Т-клеток [6, 20, 30]. Учитывая также то, что IFN способны усиливать цитотоксический потенциал ДК [8, 26, 32] и IFN-ДК, по некоторым данным, отличаются более выраженной цитотоксической активностью [19], полагаем, что применение этого типа ДК при опухолевых и вирусных заболеваниях весьма перспективно.
В то же время, допуская более высокую экспрессию «проапоптогенных» молекул на IFN-ДК, считаем, что нельзя исключить того, что эти ДК при взаимодействии с Т-лимфоцитами могут усиливать апоптоз Т-клеток. Имеются также данные о том, что IFN-ДК продуцируют более высокий уровень IL-10 и индуцируют дифференцировку регуляторных Т-клеток 1-го типа [6, 17], что может обусловливать их толеро-генный потенциал. С учетом этого целью настоящей работы стало сравнительное исследование фенотипа и цитокинсекреторной активности ДК, генерированных in vitro в присутствии IFN-a и IL-4.
Материалы и методы. Мононуклеарные клетки (МНК) получали центрифугированием гепаринизированной венозной крови в градиенте плотности фиколла-верографина. Моноциты выделяли на чашках Петри 33 мм2 («Nunclon», Дания) путем прилипания к пластику МНК (2-5 • 106/мл) в присутствии 10% сыворотки крови AB(IV) группы. IFN-ДК генерировали путем культивирования прилипающей фракции МНК во флаконах для культивирования («BD Bioscienses Falcon», Великобритания) в среде RPMI-1640 («Sigma», США), дополненной 0,3 мг/мл L-глутамина, 5 мМ HEPES-буфера, 100 мкг/мл гентамицина и 5% сыворотки плодов коровы («БиолоТ», Санкт-Петербург), в присутствии GMCSF (40 нг/мл; «Sigma-Aldrich») и IFN-a (1000 Ед/мл; Роферон-А; «Roche», Швейцария) в течение 3 сут при 37oC в СО2-инкубаторе. Для генерации IL-4-ДК прилипающую фракцию МНК инкубировали в полной культуральной среде в присутствии GMCSF и IL-4 (40 нг/мл; «Sigma-Aldrich») в тече-
ние 5 сут. Конечное созревание ДК индуцировали путем дополнительного культивирования клеток в течение 24 ч (для IFN-ДК) или 48 ч (для IL-4-ДК) в присутствии липополисахарида (ЛПС) (10 мкг/мл; ЛПС Е. coli о1 14:В4; «Sigma-Aldrich»).
Фенотипический анализ ДК по экспрессии различных поверхностных маркеров (cD1a, CD14, CD25, cD86, HLA-DR, CD123, CD83, B7-H1, TRAIL, HLA-G) проводили методом одно- или двухцветной проточной цитофлюориметрии (FACS Calibur; «Becton Dickinson», США) с использованием программы Cell Quest («Becton Dickinson») и соответствующих FITC-, АРС- или РЕ-меченных моноклональных антител («PharMingen», США).
Продукцию цитокинов (фактор некроза опухоли a - TNF-a, IFN-y, IL-1P, IL-2, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12 (p70), IL-13, IL-17, GCSF, IL-8, MCP-1, MIP-ф) в супернатантах ЛПС-активированных ДК оценивали методом проточной флюо-риметрии на 2-лучевом лазерном автоматизированном анализаторе (Bio-Plex Protein Assay System; «Bio-Rad», США) с использованием коммерческих тест-систем в соответствии с инструкцией фирмы-производителя.
Математическую обработку полученных результатов проводили с использованием пакета программ Statistica 6.0.
Результаты и обсуждение. В исследование был включен 31 условно здоровый пациент, у каждого из которых из моноцитов крови одновременно генерировали оба типа ДК - IL-4-ДК и IFN-ДК. В результате 3-суточного культивирования в присутствии GMCSF/IFN-a моноциты теряли способность прилипать к пластику и приобретали типичные морфологические черты ДК, в то время как в присутствии GM-CSF/IL-4 моноциты приобретали подобные свойства на 5-е сутки культивирования. Жизнеспособность ДК во всех экспериментах была не менее 85-90%, при этом клеточный выход в обоих протоколах значительно не различался, составляя в среднем 0,1 ± 0,09 и 0,13 ± 0,1 ДК/106 МНК для IL-4-ДК и IFN-ДК соответственно.
Результаты фенотипического анализа ЛПС-активированных ДК показали (табл. 1), что IFN-ДК отличались от IL-4-ДК более высоким относительным содержанием клеток с маркером моноцитов CD14. Количество клеток, экспрессирующих CD83 (маркер зрелых ДК), в популяции IFN-ДК было, напротив, ниже, чем в культурах IL-4-ДК, что также говорило о менее зрелом фенотипе IFN-ДК. Тем не менее содержание CD25-mзитивных ДК (активационный маркер зрелых ДК), а также экспрессия костимуляторной молекулы CD86 и антигенов гистосовместимости II класса (HLA-DR) в обеих популяциях ДК значимо не различались,
- 61 -
ИММУНОЛОГИЯ № 2, 2012
Экспрессия молекул TRAIL, В7-Н1 и HLA-G на IL-4-ДК и IFN-ДК Таблица 2
Маркер IL-4-ДК INF-ДК
интактные ЛПС-активированные интактные ЛПС-активированные
TRAIL (n = 12) M ± S.E. 10,6 ± 1,1 8,8 ± 1,9 18,3 ± 2,0** 16,1 ± 1,6**
median 10,0 9,0 20,0 17,0
LQ-UQ 8-13 4-12,5 15-21 12,5-20
B7-H1 (n = 12) M ± S.E. 27,5 ± 4,7 36,0 ± 5,7* 37,3 ± 3,44** 27,5 ± 4,7*
median 22,0 41,0 39,7 22
LQ-UQ 14-34 25-46 25-46 15-41
HLA-G (n = 8) M ± S.E. 16,3 ± 4,9 7,1 ± 2,0* 8,5 ± 1,4** 10,0 ± 1,9
median 14,0 6,5 7,0 9,8
LQ-UQ 7-17 2-15 5,5-10,5 5,5-13
Примечание. Относительное содержание (в %) интактных и ЛПС-активированных ДК, экспрессирующих соответствующие маркеры, представлено в виде средних (М± S.E.), медианных (median) и диапазона 25-75% квартальных значений (LQ—UQ). pU < 0,05: * - при сравнении интактных и ЛПС-активированных ДК; здесь и в табл. 3: ** - при сравнении IFN-ДК и IL-4-ДК (U - непараметрический критерий Вилкоксона-Манна-Уитни). TRAIL (TNF-related apoptosis inducing ligand)
что может косвенно свидетельствовать о сравнимой антигенпрезентирующей активности исследуемых ДК. В то же время значительная часть клеток в популяции IFN-ДК (в среднем 40,1 ± 3,4%) экспрессировала рецептор к IL-3a (CD123), а среди IL-4-ДК относительное содержание CD123-позитивных клеток было достоверно ниже (в среднем 6,7 ± 1,8%;р < 0,01). Кроме того, ЛПС-активированные IFN-ДК отличались от IL-4-ДК более низким уровнем экспрессии молекулы CD1a.
С целью анализа маркеров, способных опосредовать цитотоксическую/супрессорную активность ДК, сравнили IFN-ДК и IL-4-ДК по экспрессии молекул TRAIL, B7-H1 и HLA-G (табл. 2). Фенотип оценивали как в популяции интактных ДК, так и после их конечного созревания в присутствии ЛПС (ЛПС-активированные ДК). Интактные IFN-ДК содержали в 2 раза большее количество TRAL-позитивных клеток, чем IL-4-ДК (медиана 20 и 10% соответственно; р < 0,05). Созревание IFN-ДК в присутствии ЛПС сопровождалось незначительным снижением экспрессии TRAL - в среднем до 16,1 ± 1,6%, но и в этом случае количество TRAL-позитивных клеток в популяции ЛПС-активированных IFN-ДК было выше, чем в культурах зрелых IL-4-ДК.
Около 40% интактных IFN-ДК экспрессировали молекулу В7-Н1, что было достоверно выше, чем в популяции незрелых IL-4-ДК (медиана 22%). После индукции созревания относительное количество В7-Н1+-клеток среди IL-4-ДК значимо увеличивалось до 41%, т. е. до уровня, сопоставимого с таковым интактных IFN-ДК. Иную картину наблюдали в культурах ЛПС-активированных IFN-ДК, где количество В7-Н1+-клеток достоверно снижалось, в среднем до 22%, т. е. до уровня незрелых IL-4-ДК.
При оценке экспрессии молекулы HLA-G наибольшее количество HLA-G-позитивных клеток выявили в культурах интактных IL-4-ДК (медиана 14%), конечное созревание которых сопровождалось более чем 2-кратным снижением уровня HLA-G+^К - 6,5% (pv < 0,05). Содержание HLA-G-позитивных клеток среди интактных IFN-ДК было достоверно ниже, чем в популяции IL-4-ДК, и значимо не менялась после индукции созревания под влиянием ЛПС. Соот-
ветственно ЛПС-активированные IL-4-ДК и IFN-ДК содержали примерно равное количество HLA-G-позитивных клеток, которое не превышало 10%.
На следующем этапе работы провели сравнительный анализ продукции цитокинов в культурах ЛПС-активированных IFN-ДК и IL-4-ДК (табл. 3). В результате установили, что IFN-ДК характеризовались более высоким уровнем секреции Th1-провоспалительных цитокинов (IFN-y, IL-2, IL-1P, TNF-a, IL-17). В то же время продукция ^-12р70 в культурах IFN-ДК была практически в 2 раза ниже, чем в культурах IL-4-ДК. Результаты анализа спектра ^2-противовоспалительных цитокинов показали, что секреция IL-6 регистрировалась на достаточно высоком уровне независимо от типа ДК, однако IFN отличались от IL-4 повышенной секрецией IL-10 и IL-5. Тем не менее соотношение концентрации TNF-a/IL-10 в супернатантах IFN-ДК значимо превышало аналогичный показатель в культурах IL-4-ДК (46,7 ± 8,4 против 23,2 ± 4,1 соответственно), что свидетельствовало о более высоком провоспалительном потенциале IFN-ДК.
В отличие от IL-4-ДК IFN-ДК характеризовались также сниженной продукцией IL-7, но более высоким уровнем секреции GCSF и МСР-1, тогда как интенсивность продукции других хемокинов (MIP-1P и IL-8) была практически идентичной.
Результаты проведенных нами исследований показали, что по своим фенотипическим характеристикам популяция IFN-ДК является частично зрелыми (semimature) клетками, поскольку в отличие от IL-4-ДК содержит большее количество клеток, экспрессирующих CD14, и меньшее количество клеток, несущих маркер зрелых ДК - CD83. Кроме того, IFN-ДК отличаются повышенным содержанием СD123+-ДК и сниженной экспрессией молекулы CD^.
Согласно данным литературы, интактные IFN-ДК, генерированные in vitro в отсутствие ЛПС-стимуляции, содержат большее количество CD83+-клеток, т. е. являются более дифференцированными по сравнению с незрелыми IL-4-ДК [14, 33]. При проведенном C. Carbonneil и соавт. сравнении зрелых IFN-ДК и IL-4-ДК (после дозревания в присутствии CD40L) не выявлено
- 62 -
КЛЕТОЧНАЯ ИММУНОЛОГИЯ
Цитокинсекреторная активность ДК, генерированных в присутствии IL-4 и IFN-a Таблица 3
Цитокины, пкг/мл IL-4-ДК (n = 17) IFN-ДК (n = 17)
M ± S.E. median M ± S.E. median
М-провоспалительные цитокины
IFN-y 3326 ± 1270 1406 4916± 1707** 2277 T
IL-2 828± 102 830 1177± 78** 1121 T
IL-1P 274 ± 55 197 503 ± 47** 456 T
TNFa 11 605 ± 3281 8504 19 980 ± 2684** 19 806 T
IL-12 (p70) 796± 196 504 435± 61* 300 4
IL-17 402 ± 48 433 489± 19** 480 T
П2-противовоспалительные цитокины
IL-5 13,1 ± 2,0 10 41,4 ± 14,2* 22 T
IL-6 28 082 ± 3249 34561 35 580 ± 1412 38 135
IL-10 496 ± 210 181 658 ± 138 ** 422 T
IL-13 178 ± 40 145 133 ± 16 109
Факторы иммуногемопоэза
IL-7 44,2 ± 2,3 48 38,4 ± 1,6** 38 4
G-CSF 3884±1500 1378 4291± 512** 4045 T
Хемокины
IL-8 26 514 ± 759 27962 27 606 ± 46 27697
MCP-1 11 254 ± 1760 11453 29 167 ± 1598* 28 948 T
MIP-1P 15 539 ± 519 16285 16 274 ± 8 16 285
Примечание. Представлены средние (М± S.E.) и медианные (median) значения концентрации (в пкг/мл) цитокинов в супернатантах цельных культур ДК. * - pv < 0,01 при сравнении IFN-ДК и IL-4-ДК.
достоверных различий в содержании CD83+-KreTOK, хотя авторы отметили тенденцию к более низкому количеству СD83+-клеток в популяции IFN-ДК [6]. В то же время результаты наших исследований показали, что в условиях индукции созревания ЛПС IFN-ДК имеют менее зрелый фенотип по сравнению с таковым ЛПС-активированных IL-4-ДК. Присутствие CD123-позитивных клеток в популяции интактных IFN-ДК, описанное другими авторами [34], может быть связано с различной способностью IL-4 и IFN-a к down-регуляции данного антигена по мере дифференциров-ки моноцитов в ДК и также отражать относительную незрелость ДК. Снижение экспрессии CD^ в популяции интактных IFN-ДК может косвенно указывать на особенности презентации небелковых антигенов IFN-ДК [4]. Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что указанные фенотипические особенности IFN-ДК не только характерны для интактных ДК, но и сохраняются после их дозревания в присутствии ЛПС. Кроме того, эти данные позволяют предполагать, что ЛПС-активированные IFN-ДК сохраняют ряд фенотипических особенностей, отражающих задержку терминальной дифференцировки ДК, однако обладают сходной с IL-4-ДК экспрессией молекул, участвующих в презентации антигенов (CD86, HLA-DR).
Наряду с традиционно исследуемыми маркерами мы, по сути, впервые провели сравнительную оценку IFN-ДК и IL-4-ДК по экспрессии молекул, способных опосредовать цитотоксическую/толерогенную активность Дк - TRAIL, В7-Н1 и HLA-G. Как известно, TRAIL является трансмембранным белком, который, связываясь с рецепторами TRAIL-R1 (DR4) и TRAIL-R2 (DR5), способен индуцировать апоптоз клеток-мишеней. Экспрессия TRAIL на ДК рассматривается в качестве одного из механизмов цитотоксической активности ДК против опухолевых клеток, несущих на
своей поверхности TRAIL-R1 и TRAIL-R2 [16, 18, 35]. Цитотоксическая активность, которая опосредуется через мембранно-связанную форму TRAIL, описана для IL-4-ДК [7]. Кроме того, продемонстрировано, что IFN I класса и IFN-y стимулируют экспрессию TRAIL на CD11c+ ДК периферической крови [16] и что незрелые IFN-ДК отличаются от IL-4-ДК более высоким уровнем внутриклеточной экспрессии TRAIL и цитотоксической активностью против TRAIL-чувствительных опухолевых линий in vitro [12, 19]. Полученные нами результаты о более высокой экспрессии мембранной формы TRAIL на IFN-ДК согласуются с этими данными и свидетельствуют о том, что более высокий проа-поптогенный потенциал, ассоциированный с экспрессией TRAIL, характерен не только для незрелых, но и для зрелых IFN-ДК.
Важно отметить, что цитотоксическая активность ДК может реализоваться не только через TRAIL, но и через другие молекулы, например В7-Н1. Молекула В7-Н1 (CD274), являющаяся лигандом к рецептору программированной клеточной смерти (PD-L1), представляет поверхностный гликопротеид, относящийся к семейству костимуляторных молекул B7, и экспрессируется на активированных лимфоцитах, моноцитах/макрофагах и ДК [9]. Результаты исследований на животных с нокаутом PD-L1 и блокированием В7-H1/PD-1 сигнального пути показали, что взаимодействие В7-Н1 с рецептором PD-1 на Т-клетках вызывает апоптоз и анергию Т-клеток [3, 11, 21, 29]. С повышенной экспрессией В7-Н1 на ДК связывают нарушение функций эффекторных Т-клеток при вирусных гепатитах и ВИЧ-инфекции [28, 44].
Поскольку IFN-a и IFN-y усиливают экспрессию В7-Н1 на миелоидных ДК, выделенных из периферической крови [9], генерированные в присутствии IFN-a ДК также могут отличаться повышенной экспрессией B7-H1. Действительно, полученные нами
- 63 -
ИММУНОЛОГИЯ № 2, 2012
результаты показали, что интактным IFN-ДК свойственна более высокая экспрессия В7-Н1. Однако ЛПС-индуцированное созревание IFN-ДК сопровождалось снижением экспрессии В7-Н1 и ЛПС-активированные IFN-ДК имели более низкий уровень экспрессии данной молекулы, чем зрелые IL-4-ДК.
Еще одной молекулой, с помощью которой ДК могут оказывать толерогенное/проапоптогенное действие, является неклассическая молекула гистосовместимости HLA-G. Генерируемые из моноцитов ДК содержат в цитоплазме большое количество транскриптов HLA-G и в определенных условиях могут экспрессировать мембранную форму и секретировать данную молекулу [23]. Взаимодействуя со специфическими рецепторами на NK- и Т-клетках, молекула HLA-G может индуцировать апоптоз и подавлять цитотоксическую активность этих клеток, а также ингибировать пролиферацию аллореактивных Т-лимфоцитов в смешанной культуре лимфоцитов [13, 24, 25]. Результаты проведенных нами исследований показали, что как IL-4-ДК, так и IFN-ДК содержали одинаково низкое количество HLA-G-позитивных клеток, которое не увеличивалось после созревания ДК в присутствии ЛПС, что указывает на отсутствие повышенного толерогенного потенциала IFN-ДК, связанного с экспрессией мембранной формы HLA-G.
Поскольку функциональная активность ДК во многом опосредуется через секрецию цитокинов, сравнительная оценка двух типов ДК включала также анализ их цитокинпродуцирующей активности. IFN-ДК, подобно «классическим» IL-4-ДК, продуцировали как Th1-, так и ^2-цитокины, обладая, таким образом, потенциальной способностью активировать реакции клеточного и гуморального иммунитета. При этом ЛПС-активированные IFN-ДК отличались более высоким уровнем секрецииТЫ-провоспалительных (IFN-y, IL-2, IL-17, IL-ip, TNF-a) и ^2-противовоспалительных (IL-10, IL-5) цитокинов, однако более низкой продукцией IL-12p70. Повышенный провоспалительный спектр IFN-ДК, несмотря на низкую продукцию IL-12, продемонстрирован ранее при анализе интактных IFN-ДК [14]. Однако сравнение уровня провоспалительных цитокинов в культурах ЛПС-активированных ДК не проводилось. Поэтому полученные нами данные впервые демонстрируют, что по уровню провоспалительных цитокинов ЛПС-активированные IFN-ДК превосходят зрелые IL-4-ДК. Относительно продукции ^2-противовоспалительных цитокинов в литературе имеются данные о том, что ДК, генерируемые в присутствии IFN-a, характеризуются более высокой продукцией IL-10 на начальных этапах генерации. В то же время после созревания в присутствии CD40L продукция данного цитокина IFN-ДК не отличается от таковой в культурах IL-4-ДК [6]. Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что при использовании в качестве дозревающего стимула ЛПС IFN-ДК продуцируют более высокий уровень IL-10 и IL-5. Однако и в этом случае индекс соотношения TNFa/IL-10 в супернатантах IFN-ДК превосходит таковой в культурах IL-4-ДК, что говорит о сохранении доминирующей провоспалительной активности зрелыми IFN-ДК. Кроме того, нами впервые показано, что ЛПС-активированные IFN-ДК отличаются более высоким уровнем продукции GCSF и МСР-1, что может свидетельствовать о повышенной потенциальной способности IFN-ДК рекрутиро-
вать и активировать клетки врожденного иммунитета (гранулоциты, моноциты/макрофаги). В работе также впервые показано, что IFN-ДК характеризуются более низкой продукцией IL-7, поддерживающего гомеостатическую пролиферацию лимфоцитов.
Таким образом, мы показали, что IFN-ДК в сравнении с IL-4-ДК имеют ряд принципиальных фенотипических и функциональных отличий. В частности, IFN-ДК генерируются in vitro быстрее по времени и характеризуются высокой способностью к захвату антигена (поскольку имеют фенотип частично зрелых клеток), сохраняя при этом антигенпрезентирующую активность (так как экспрессируют костимуляторные молекулы (CD86) и молекулы главного комплекса гистосовместимости (HLA-DR)). Кроме того, IFN-ДК обладают цитотоксическим потенциалом, поскольку экспрессируют молекулы В7-Н1 и TRAIL, и отличаются повышенным содержанием CD123-позитивных клеток. IFN-ДК сохраняют функциональную стабильность и способны эффективно индуцировать реакции клеточного и гуморального иммунитета, так как активно секретируют Thl-провоспалительные (IFN-y, IL-2, IL-17, IL-ip, TNF-a) и ^2-противовоспалительные цитокины (IL-10, IL-5), а также ростовые гемопоэтические факторы (GCSF) и хемокины (МСР-1).
Таким образом, полученные нами результаты научно обосновывают целесообразность использования IFN-ДК в качестве клеточной основы при создании индивидуальных лечебных вакцин, которые могут быть использованы в комплексной терапии больных с онкопатологией или хроническими вирусными заболеваниями для индукции/усиления противоопухолевого или противоинфекционного иммунного ответа.
Работа поддержана грантом ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России», госконтракт № 14.740.11.0007.
ЛИТЕРАТУРА
1. Akbar S. M., Furukawac S., Hasebe A. et al. Production and efficacy of a dendritic cell-based therapeutic vaccine for murine chronic hepatitis В virus carrier // Int. J. Mol. Med. - 2004. - Vol. 14. - P. 295-299.
2. Banchereau J., Steinman R. M. Dendritic cells and the control of immunity // Nature. - 1998. - Vol. 392. - P. 245-252.
3. Brown J. A., Dorfman D. M., Ma F. R. et al. Blockade of programmed death-1 ligands on dendritic cells enhances T cell activation and cytokine production // J. Immunol. - 2003. - Vol. 170.
- P. 1257-1266.
4. Cao X., Sugita M., van Der Wei N. et al. CD1 molecules efficiently present antigen in immature dendritic cells and traffic independently of MHC class II during dendritic cell maturation // J. Immunol. - 2002. - Vol. 169. - P. 4770-4777.
5. Carbonneil C., AoubaA., BurgardM. et al. Dendritic cells generated in the presence of GM-CSF and Interferon-alpha are potent inducers of HIV-specific CD8+ T cells // AIDS. - 2003. - Vol. 17.
- P. 1731-1740.
6. Carbonneil C., Saidi H., Donkova-Petrini V., Weiss L. Dendritic cells generated in the presence of interferon-a stimulate allogeneic CD4+ T-cell proliferation: modulation by autocrine IL-10, enhanced T-cell apoptosis and T regulatory type 1 cells // Int. Immunol. - 2004. - Vol. 16. - P. 1037-1052.
7. Chaperot L., Blum A., Manches O. et al. Virus or TLR agonists induce TRAIL-mediated cytotoxic activity of plasmacytoid dendritic cells // J. Immunol. - 2006. - Vol. 176. - P. 248-255.
8. Chauvin C., Josien R. Dendritic cells as killers: mechanistic aspects
- 64 -
КЛЕТОЧНАЯ ИММУНОЛОГИЯ
and potential roles // J. Immunol. - 2008. - Vol. 181. - P. 11-16.
9. Chen L. Co-inhibitory molecules of the B7-CD28 family in the control of T-cell immunity // Nature Rev. Immunol. - 2004. -Vol. 4. - P. 336-347.
10. Chen L., Li Y. G., Zhang Z. et al. Therapeutic effect of autologous dendritic cell vaccine on patients with chronic hepatitis B: a clinical study // Wld J. Gastroenterol. - 2005. - Vol. 11. - P. 1806-1808.
11. Chen L., Zhang Z., Chen W. et al. B7-H1 up-regulation on myeloid dendritic cells significantly suppresses T cell immune function in patients with chronic hepatitis B // J. Immunol. - 2007. - Vol. 178. - P. 6634-6641.
12. Cho Y. S., Challa S., Clancy L., Chan F. K. Lipopolysaccharide-induced expression of TRAIL promotes dendritic cell differentiation // Immunology. - 2010. - Vol. 130. - P. 504-515.
13. Contini P., GhioM., Poggi A. et al. Soluble HLA-A, -B, -C and -G molecules induce apoptosis in T and NK CD8+ cells and inhibit cytotoxic T cell activity through CD8 ligation // Eur. J. Immunol. - 2003. - Vol. 33. - P. 125-134.
14. Della Bella S., Nicola S., Riva A. et al. Functional repertoire of dendritic cells generated in granulocyte macrophage-colony stimulating factor and interferon-a // J. Leukoc. Biol. - 2004. -Vol. 75. - P. 106-116.
15. Delia Bella S., Nicola S., Brambilla L. et al. Quantitative and functional defects of dendritic cells in classic Kaposi’s sarcoma // Clin. Immunol. - 2006. - Vol. 119. - P. 317-329.
16. Fanger N. A., Maliszewski C. R., Schooley K., Griffith T. S. Human dendritic cells mediate cellular apoptosis via tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand (TRAIL) // J. Exp. Med.
- 1999. - Vol. 190. - P. 1155-1164.
17. Ito Т., AmakawaR., JnabaM. et al. Differential regulation of human blood dendritic cell subsets by IFNs // J. Immunol. - 2001.
- Vol. 166. - P. 2961-2972.
18. Janjic B. M., Pimenov A., Whiteside T. L. et al. Innate direct anticancer effector function of human immature dendritic cells. I. Involvement of an apoptosis-inducing pathway // J. Immunol. -2002. - Vol. 168. - P. 1832-1840.
19. Korthals M., Safaian N., Kronenwett R. et al. Monocyte derived dendritic cells generated by IFN-alpha acquire mature dendritic and natural killer cell properties as shown by gene expression analysis // J. Transl. Med. - 2007. - Vol. 25. - P. 46-48.
20. Lapenta C., Santini S., Spada M. et al. IFN-a-conditioned dendritic cells are highly efficient in inducing cross-priming CD8+ T cells against exogenous viral antigens // Eur. J. Immunol. - 2006.
- Vol. 36. - P. 2046-2060.
21. Latchman Y. E., Liang S. C., Chernova Y. et al. PD-L1-deficient mice show that PD-L1 on T cells, antigen-presenting cells, and host tissues negatively regulates T cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2004. - Vol. 101. - P. 10 691-10 696.
22. Le Friec G., Laupeze B., Fardel O. et al. Soluble HLA-G inhibits human dendritic cell-triggered allogeneic T-cell proliferation without altering dendritic differentiation and maturation processes // Hum. Immunol. - 2003. - Vol. 64. - P. 752-761.
23. Le Friec G., Gros F., Sebti Y. et al. Capacity of myeloid and plas-macytoid dendritic cells especially at mature stage to express and secrete HLA-G molecules // J. Leukoc. Biol. - 2004. - Vol. 76.
- P. 1125-1133.
24. Le Maoult G., Krawice-Radanne I., Dausset J., Carosella E. D. HLA-G1-expressing antigen-presenting cells induce immunosuppressive CD4+ T cells // Proc. Natl Acad. Sci. USA. - 2004.
- Vol. 101. - P. 7064-7069.
25. Liu Y. J. Dendritic cell subsets and lineages, and their functions in innate and adaptive immunity // Cell. - 2001. - Vol. 106. - P. 259-262.
26. Lu G., Janjic B. M., Janjic J. et al. Innate direct anticancer effector function of human immature dendritic cells. II. Role of TNF, lymphotoxin, Fas-ligand, and TNF-related apoptosis-inducing ligand // J. Immunol. - 2002. - Vol. 168. - P. 1831-1839.
27. Lu W. L., Arraes C., Ferreira W. T., Andrieu J. M. Therapeutic
dendritic-cell vaccine for chronic HIV-1 infection // Nature Med.
- 2004. - Vol. 10. - P. 1359-1365.
28. Lukens J. R., CruiseM. W., LassenM. G., Hahn Y. S. Blockade of PD-1/B7-H1 interaction restores effector CD8+ T cell responses in a hepatitis С virus core murine model // J. Immunol. - 2008. -Vol. 180. - P. 4875-4884.
29. Maier H., Isogawa M., Freeman G. J., Chisari F. V. PD-1:PD-L1 interactions contribute to the functional suppression of virus-specific CD8+ T lymphocytes in the liver // J. Immunol. - 2007.
- Vol. 178. - P. 2714-2720.
30. Mashino K., Sadanaga N., Tanaka F. et al. Effective strategy of dendritic cell-based immunotherapy for advanced tumor-bearing hosts: the critical role of Th1-dominant immunity // Mol. Cancer Ther. - 2002. - Vol. 1. - P. 785-794.
31. Padovan E., Spagnoli G., Ferrantini M., Heberer M. IFN-alpha 2a induces IP-10/CXCL10 and MIG/CXCL9 production in monocyte-derived dendritic cells and enhances their capacity to attract and stimulate CD8+ effector T cells // J. Leukoc. Biol. -2002. - Vol. 71. - P. 669-678.
32. Papewalis C., Jacobs В., Wuttke M. et al. IFN-a skews monocytes into CD56+-expressing dendritic cells with potent functional activities in vitro and in vivo // J. Immunol. - 2008. - Vol. 180. - P. 1462-1470.
33. Paquette R., Hsu N., Kiertscher S. et al. Interferon-alpha and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor differentiate peripheral blood monocytes into potent antigen-presenting cells // J. Leukoc. Biol. - 1998. - Vol. 64. - P. 358-367.
34. Parlato S., Santini S., Lapenta C. et al. Expression of CCR-7, MIP-3b, and Th1 chemokines in type I IFN-induced monocyte-derived dendritic cells - importance for the rapid acquisition of potent migratory and functional activities // Blood. - 2001. - Vol. 98. - P. 3022-3029.
35. Pitti R. M., Marsters S. A., Ruppert S. et al. Induction of apoptosis by Apo-2 ligand, a new member of the tumor necrosis factor cytokine family // J. Biol. Chem. - 1996. - Vol. 271. - P. 12 687-12 690.
36. Santini S., Lapenta C., Logozzi M. et al. Type I Interferon as a powerful adjuvant for monocyte-derived dendritic cells development and activity in vitro and in HU-PBL-SCID mice // J. Exp. Med. - 2000. - Vol. 191. - P. 1777-1788.
37. Santini S., Pucchini Т., Lapenta С. et al. A new type 1 IFN-mediated pathway for the rapid differentiation of monocytes into highly active dendritic cells // Stem cells. - 2003. - Vol. 21. - P. 357-362.
38. Santini S., Lapenta C., Belardelli F. Type I interferons as regulators of the differentiation/activation of human dendritic cells: methods for the evaluation of IFN-induced effects // Meth. Mol. Med. - 2005. - Vol. 116. - P. 167-181.
39. Santini S., Lapenta C., Santodonato L. et al. IFN-alpha in the generation of dendritic cells for cancer immunotherapy // Handb. Exp. Pharmacol. - 2009. - Vol. 188. - P. 295-317.
40. Steinman R. M., Dodhapkar M. Active immunization against cancer with dendritic cells: the near future // Int. J. Cancer. -2001. - Vol. 94. - P. 459-473.
41. Thurner В., Roder C., Dieckmann D. et al. Generation of large numbers of fully mature and stable dendritic cells from leuka-pheresis products for clinical applications // J. Immunol. Meth.
- 1999. - Vol. 223. - P. 1-15.
42. Ulsenheimer A., Gerlach J. T., Jung M. C. et al. Plasmacytoid dendritic cells in acute and chronic hepatitis С virus infection // Hepatology. - 2005. - Vol. 41. - P. 643-651.
43. Van der Molen R. G., Sprengers D., Binda R. S. et al. Functional impairment of myeloid and plasmacytoid dendritic cells of patients with chronic hepatitis В // Hepatology. - 2004. - Vol. 40.
- P. 738-746.
44. Zhang Z. J., Fu Q., Zhao Y. et al. Differential restoration of myeloid and plasmacytoid dendritic cells in HIV-1-infected children after treatment with highly active antiretroviral therapy // J. Immunol. - 2006. - Vol. 176. - P. 5644-5651.
Поступила 29.03.11
- 65 -
