CC BY
26МИКРОБИОЛОГИЯ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013
Л.А.Ряпис1, В.И.Илюхин2, Т.В.Сенина2, Е.В.Шубникова2, А.А.Будченко2, А.С.Куликова2
СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА БУРХОЛЬДЕРИЙ ГРУППЫ PSEUDOMALLEI
1Первый московский государственный медицинский университет им. И.М.Сеченова;
2Научно-исследовательский противочумный институт, Волгоград
Цель. Сравнительная характеристика диагностической ценности основных куль-турально-биологических характеристик буркхольдерий группы pseudomallei. Материалы и методы. В работе использовали 59 штаммов B. pseudomallei, 14 — B. mallei и 5 — B. thailandensis. Биохимические характеристики изучали общепринятыми методами, антигенные свойства оценивали в реакциях агглютинации и иммуноэлектрофореза, вирулентность определяли по Dlm для лабораторных животных, антибиотикочувствитель-ность проверяли диско-диффузионным методом. Результаты. При пассаже B. pseudomallei и B. mallei на мышах наблюдается повышение вирулентности, сохранение исходной чувствительности к антибиотикам, сужение спектра преципитиногенов. При лечении экспериментального мелиоидоза морских свинок формируется устойчивость к химиопрепаратам разных групп. Установлена различная степень вирулентности и чувствительности к антибиотикам разных штаммов B. thailandensis. Зависимость чувствительности от культивирования in vitro не выявлена. Заключение. Установлена стабильность используемых диагностически значимых тестов для идентификации буркхольдерий группы pseudomallei. Обоснована актуальность расширения набора признаков, способствующих их дифференциации.
Журн. микробиол., 2013, № 1, С. 3—8
Ключевые слова: буркхольдерии, сап, мелиоидоз, антибиотики, фенотип, диагностика
L.A.Ryapis1, V.I.Ilyukhin2, T.V.Senina2, E.V.Shubnikova2, A.A.Budchenko2, A.S.Kulikova2
COMPARATIVE CHARACTERISTIC OF BURKHOLDERIAE PSEUDOMALLEI GROUP
1Sechenov First Moscow State Medical University, 2Research Institute of Plague Control, Volgograd, Russia
Aim. Comparative characteristic of diagnostic value of main cultural-biological characteristics of Burkholderiae pseudomallei group. Materials and methods. 59 strains of B. pseudomallei, 14 — B. mallei and 5 — B. thailandensis were used in the study. Biochemical characteristics were studied by generally accepted methods, antigenic properties were evaluated in agglutination reaction and immunoelectrophoresis, virulence was determined by Dlm for laboratory animals, antibiotic sensitivity was verified by disc-diffusion method. Results. Passaging of B. pseudomal-lei and B. mallei in mice results in increase of virulence, preservation of initial sensitivity to antibiotics, contraction of precipitogen specter. During therapy of experimental melioidosis in guinea pigs resistance to chemopreparations of various groups is formed. Varying degree of virulence and sensitivity to antibiotics of various B. thailandensis strains was established. Dependence of sensitivity on in vitro cultivation was not detected. Conclusion. Stability of diagnostically significant tests used for identification of Burkholderiae pseudomallei group was established. Relevance of attribute set expansion that facilitates their differentiation is justified.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2013, No. 1, P. 3—8
Key words: Burkholderiae, glanders, melioidosis, antibiotics, phenotype, diagnostics
ВВЕДЕНИЕ
Происходящая глобализация во всех сферах деятельности человека, развитие туризма, особенно в зоны с тропическим климатом, создает высокий риск заноса экзотических для нашего государства инфекций ключая сап и мелиоидоз, которые постановлением Правительства РФ № 715 от 2004 г. под кодом А24 включены в перечень социально-значимых заболеваний, представляющих опасность для окружающих. Особую проблему представляет мелиоидоз. В Таиланде, государстве, эндемичном по этой патологии, 80% детей старше 4 лет являются серопози-тивными, а мелиоидоз занимает 1 место по летальности среди больных инфекционной патологией. В связи с этим, поставлен вопрос о необходимости разработки вакцины для профилактики местного населения и туристов [10]. Вместе с тем, лабораторная диагностика мелиои-доза осложнена в основном из-за вариабельности культурально-биологических свойств Burkholderia pseudomallei и трудностью дифференциации от Burkholderia mallei, особенно от Burkholderia thailan-densis [2, 3, 6]. Целью работы являлось сравнительная характеристика диагностической ценности основных куль-турально-биологических свойств бурк-хольдерий группы pseudomallei.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Использовали 59 штаммов B. pseudomallei, 14 — B. mallei и 5 штаммов B. thai-landensis, полученных из коллекционных центров и выделенных авторами в полевых условиях. Источниками выделения B. pseudomallei были люди, B. mallei — лошади, а B. thailandensis — почва. Первичную идентификацию культур проводили по общепринятым схемам [3], затем их лиофилизировали и хранили при 4°C. Для выращивания бактерий использовали триптиказо-соевый агар (ТСА). Чувствительность к антибиотикам определяли согласно [5] на агаре Мюллер-Хинтона (МХА); все среды и препараты — фирмы HiMedia (India).
Пассаж микроорганизмов проводили на мышах, исходная доза заражения составляла 5х108 м.к. Первых 5 грызунов
заражали B. pseudomallei и B. mallei на фоне введения гидрокортизона (5 мг/ мышь), последующие пассажи проводили на интактных животных. Погибших вскрывали, селезенку и печень дезинтегрировали в 0,9% NaCl, затем полученную суспензию в объеме 0,5 мл вводили п/к следующим биопробам. Всего проведено от 10 до 30 пассажей каждого штамма. Для определения вирулентности B. thailandensis использовали золотистых хомячков. У культур, выделенных от животных последнего пассажа, определяли Dlm, затем их лиофилизировали. Последовательные 20 — 30 пересевов проводили на ТСА, используя 2-сут культуры. Для выявления изменчивости B. pseudo-mallei при лечении антибиотиками морских свинок заражали, затем им per os в течение двух нед вводили доксициклин в дозе 40 мг/кг/сут. От павших животных через 14 — 40 сут выделяли культуры, свойства которых сравнивали с заражающим штаммом. Культуральные свойства исходных и пассированных культур определяли общепринятыми методами [3, 4] и в API 20 NE, результаты учитывали через 24 ч после инокуляции. Гемолитическую активность определяли на эритроцитах человека. Агглютинабель-ность оценивали в РА с группоспецифи-ческой сывороткой. Антигенный состав изучали в иммуноэлектрофорезе в 1,2% геле агарозы; в качестве антигена служил ультразвуковой дезинтеграт высушенных ацетоном бактерий, выращенных на ТСА при 37°C в течение суток. Идентификацию и маркировку преципитатов проводили по ранее описанной схеме [2].
РЕЗУЛ ЬТАТЫ
Основные тесты, используемые для идентификации буркхольдерий группы pseudomallei, показали, что в среде Хью-Лейфсона (аэробные условия) все штаммы окисляли глюкозу, фруктозу, но не образовывали кислоту из рамнозы, обладали аргининдигидролазой, не декар-боксилировали лизин. Характеристики, которые могут быть полезны для дифференциации исследованных видов бурк-хольдерий, приведены в табл. 1.
В большинстве случаев культуры B.
Таблица 1. Характеристики, полезные для дифференциации буркхольдерий группы pseudomallei
Характеристика B.pseudomallei B.mallei B.thailandensis
Ксилоза (кислота) + V +
Целлобиоза (кислота) V — +
Гидролиз эскулина V V V
(кислота)
Уреаза V V +
Денитрификация V — +
Желатиназа + — +
Усвоение L-арабинозы — — +
Гемолиз + — +
Устойчивость + + +
к полимиксину В
Устойчивость + — +
к гентамицину
Примечание. + Положительная реакция у 100% штаммов; — отрицательная реакция у 100% штаммов; V — вариабельная положительная реакция у 7 — 91% штаммов.
pseudomallei проявляли вариабельную метаболическую активность, B. mallei — низкую, а у B. thailandensis она была макси -мальной, что согласуется с экологией этих видов. Действительно, B. pseudo-mallei является возбудителем сапронозов, для которого человек и теплокровные животные являются случайной средой обитания, а B. mallei — возбудителем зоо-ноза, утратившим ряд функций при паразитизме на животных. С другой стороны, B. thailandensis является почвенным микроорганизмом, медицинское (ветеринарное) значение которого пока четко не определено. Единственным тестом, позволяющим дифференцировать патогенные виды (B. pseudomallei и B. mallei) от B. thailandensis, является утилизация арабинозы в качестве единственного источника углерода. Этот тест рекомендован для быстрой дифференциации B. pseudomallei и B. thailandensis. Другими критериями, позволяющими идентифицировать B. thailandensis и B. mallei, являются окисление целлобиозы, дени-трификация, гидролиз желатины, гемолитическая активность, а также чувствительность к гентамицину [4, 6]. Последние два показателя являются дифференцирующими для B. pseudomallei и B. mallei.
Все штаммы группы pseudomallei агглютинировались групповой сывороткой в титрах 1:400 — 1:6400. В иммуноэлек-
трофорезе выявлен широкий спектр пре-ципитиногенов (19 у штаммов B. pseudomallei и до 12 у B. mallei и B. thailandensis). Наиболее стабильно у всех видов выявлялись нейтральный термостабильный антиген 6 и термолабильный антиген d.
Пассаж на животных практически не отразился на агглютинабельности бурк-хольдерий. Титры в РА пассированных штаммов не отличались от исходных титров более чем на 1 разведение. При им-муноэлектрофорезе цельноклеточных антигенов культур, пассированных на животных, выявлено сужение спектра преципитиногенов, преимущественно в нейтральной и анодной зонах, антигены 5 и 8 вообще не выявлялись, хотя присутствовали в дезинтеграте клеток исходных штаммов.
У пересеваемых на ТСА штаммов B. pseudomallei к концу эксперимента наблюдалась диссоциация колоний с преобладанием S- и I-морфоваров, М-ко-лонии встречались редко. Колонии B. mallei и B. thailandensis росли только в S-форме. В конце пассажа на животных наблюдали рост B. pseudomallei только в R-форме. Биохимическая активность пассированных на животных и пересеваемых культур B. pseudomallei была одинаковой. Исключение составляла дени-трификация. В этом тесте один штамм B. pseudomallei изменил реакцию на положительную, а другой, положительный — стал отрицательным.
Dlm B. pseudomallei и B. mallei для золотистых хомячков не превышала 101 КОЕ, а Dlm B. thailandensis находилась в пределах 106 — 108 КОЕ. Dlm двух штаммов B. pseudomallei для мышей существенно отличалась, составляя 104 и 108 КОЕ. Исходные штаммы B. mallei вызывали гибель отдельных мышей при введении >108 КОЕ. Пассаж B. pseudomallei на мышах привел к снижению Dlm на 103 и 106 lg (штаммы С141 и 56770 соответственно) и к селекции колоний только в R-форме. Резкое снижение Dlm наблюдалось и при пассаже B. mallei через организм мышей (на >105 — 104 lg в зависимости от штамма). С другой стороны, Dlm B. pseudomallei для мышей одного из штаммов, пересеваемого на ТСА, увели-
Таблица 2. Dlm исходных, пассированных через мышей и пересеваемых на ТСА бурк-хольдерий
Штамм Исходный Мыши ТСА
B.pseudomallei С 141 104 101 107
B.pseudomallei 56770 108 101 107
B.mallei 10230 >108 103 108
B.mallei В 120 >108 104 >108
B.mallei Ц 5 >108 103 >108
B.thailandensis 264 106 — 108
B.thailandensis 251 106 — 108
B.thailandensis 265 108 — 107
B.thailandensis 295 107 — 108
B.thailandensis 299 106 — >109
Примечание. Dlm B.pseudomallei и B.mallei для мышей, B.thailandensis — для золотистых хомячков; — Dlm не определяли.
чилась, у другого снизилась относительно незначительно, а в случае с B. mallei этот показатель не изменился. Культуры B. thailandensis, пересеваемые на ТСА, за одним исключением (штамм 265), снизили вирулентность (табл. 2).
Два штамма B. pseudomallei (С 141 и 56770) и три штамма B. mallei (10230, 120 и Ц 5) были резистентны к цефтазидиму, но чувствительны к ломефлоксацину, имипенему, доксициклину и ко-три-моксазолу. Чувствительность к ним исходных, культивируемых in vivo и in vitro штаммов B. pseudomallei и B. mallei, не изменилась. В то же время, хотя два штамма B. thailandensis (264 и 265) не изменили чувствительность к химиопрепа-ратам, остальные стали чувствительны к
отдельным антибиотикам (штамм 251, имипенем), повысили или утратили устойчивость (табл. 3).
При лечении доксициклином морских свинок, инфицированных B. pseudomallei 100 в дозе 100 ЛД50, к окончанию курса терапии летальность составила 10%. Из 18 выживших 4 животных пали в течение срока наблюдения (40 сут). Оставшиеся были хлороформированы; при вскрытии у 5 из них выделены культуры. Изолированные от выживших животных 5 культур по биохимическим и антигенным свойствам не отличались от заражающего штамма. Если ЛД50 исходного штамма составляла 3х102, то ЛД50 культур от выживших грызунов находилась в пределах 6х102 — 1х104 КОЕ. Чувствительность к антибиотикам в Е-тесте выделенных культур, как правило, снизилась: МПК доксициклина у 4 культур повысилась с 2 мкг/мл до 5 мкг/мл, у одной до 7 мкг/мл (промежуточный уровень устойчивости); МПК ко-тримок-сазола в одном случае возросла с 2,5 мкг/ мл до 6 мкг/мл; у остальных культур она осталась в тех же пределах (2 — 3 мкг/мл). МПК цефтазидима и рифампицина повысились с 4 и 8 мкг/мл у исходных штаммов до 5 — 6 и 9 — 12 мкг/мл у пассированных.
ОБСУЖДЕН И Е
Род Burkholderia был признан как самостоятельная таксономическая единица в 1992 г. В нем выделен филогенети-
Таблица 3. Чувствительность к химиопрепаратам исходных и пересеваемых на ТСА штаммов B.thailandensis
Штаммы Ca 30 Lo 10 R 30 I 10 Do 10 Co 25
B.thailandensis 264 исх. B.thailandensis 264 п.с. B.thailandensis 251 исх. B.thailandensis 251 п.с. B.thailandensis 265 исх. B.thailandensis 265 п.с. B.thailandensis 295 исх. B.thailandensis 295 п.с. B.thailandensis 299 исх. B.thailandensis 299 п.с.
Р Р Р Ч П П П Ч Р П
Ч Ч Ч Ч Ч Ч Ч Р Р Р
Ч Ч Ч Ч Ч Ч Ч Ч Ч П
Ч Ч Ч Ч Ч Ч Ч Ч Ч Ч
Ч Ч Ч Ч Ч Ч Ч Ч Ч П
Ч Ч П П Ч Ч Ч Р П Р
Примечание. Са — цефтазидим, ^ — ломефлоксацин, R — рифампицин, I — имипенем, Do — доксициклин, Со — ко-тримоксазол; цифры — содержание препарата в мкг; исх. — исходная культура; п.с. — культуры, пересеваемые на питательных средах; Р — резистентность; Ч — чувствительность; П — промежуточная устойчивость.
ческий кластер из трех видов (B. mallei, B. pseudomallei и B. thailandensis) под названием «группа pseudomallei» [4, 8]. Виды этой группы фенотипически трудно различимы, что затрудняет их идентификацию. Сложность их дифференциации, в частности, связана с тем, что культуры B. pseudomallei, выделяемые в разных географических регионах из объектов внешней среды, от животных и людей, отличаются по культурально-биологическим характеристикам и генетически [14]. Более того, оказалось, что штаммы B. pseudomallei, изолированные даже из одной пробы почвы, могут содержать множество генотипов [7], и фактически каждый штамм B. pseudomallei по геноти-пическому критерию является уникальным. Эта гетерогенность определяется островками, кодирующими факторы вирулентности и ферменты метаболизма, а также профаго-подобными островками и профагами, которые обеспечивают бактериям селективное преимущество во внешней среде и/или в организме хозяина [11]. Штаммы B. pseudomallei от больных людей преимущественно содержат генетические островки других микроорганизмов, которые играют важную роль в развитии инфекции у человека [12], а горизонтальный перенос мобильных генетических элементов лежит в основе генетической гетерогенности природных популяций возбудителя мелиоидоза [15]. Наконец, выявлено изменение вирулентности и устойчивости B. pseudomallei и B. mallei к антибиотикам в инфекционном процессе [13].
Помимо генетической гетерогенности и динамической изменчивости феноти-пических характеристик B. pseudomallei, затрудняющих его лабораторную диагностику, существует проблема дифференциации этого вида с B. thailandensis. Этот вид перекрестно агглютинируется с B. pseudomallei и B. mallei, а единственным тестом, отличающим B. thailandensis от патогенных видов буркхольдерий, является способность использовать арабино-зу в качестве единственного источника углерода.
Первоначало полагали, что B. thailan-densis является авирулентным биоваром
B. pseudomallei, хотя в отдельных случаях его выделяли в Таиланде из клинического материала. В последующем установлено, что выделенные на разных территориях штаммы B. thailandensis отличаются по вирулентности для лабораторных животных [9]. Основным механизмом, ответственным за изменение вирулентности и культуральных свойств B. pseudo-mallei и B. thailandensis, является их природная компетентность. Выявлен штамм B. thailandensis, который приобрел кластер генов, близкородственный B. pseudo-mallei, необходимый для развития инфекции у млекопитающих. У этого генетически измененного варианта B. thailan-densis выявлены функциональные и молекулярные особенности, отличающие его от ранее описанных штаммов. Полагают, что сформировался новый вирулентный вариант B. thailandensis и подобные процессы могут лежать в основе формирования новых видов патогенов [12].
Существуют затруднения при дифференциации B. pseudomallei и от других почвенных буркхольдерий. В конце прошлого столетия в Америке, не эндемичной по мелиоидозу, в двух случаях была диагностирована эта патология местного происхождения. Впоследствии оказалось, что в действительности этиологическим агентом инфекции был новый вид бурк-хольдерий (Burkholderia oklahomensis), фенотипически не отличимый от B. pseudomallei [9].
В настоящее время для идентификации буркхольдерий группы pseudomallei используют два подхода: микробиологический и молекулярно-биоло-гический [1, 3]. Нами в опытах iv vivo и in vitro, в определенной степени моделирующих инфекционный (эпизоотический) процесс, установлено, что, судя по неселективным маркерам, феноти-пические характеристики буркхоль-дерий не претерпели существенных флюктуаций. Из изученных видов наиболее лабильным является B. pseudo-mallei, пластичность генома которого, как и B. thailandensis, предполагает высокую вероятность появления вариантов, уклоняющихся от существующих
схем идентификации буркхольдерий группы pseudomallei.
В заключение отметим, что на примере буркхольдерий группы pseudomallei можно проследить эволюцию становления патогенности от почвенного микроорганизма (B. thailandensis) к случайному паразиту теплокровных (B. pseudomallei), а затем — к строгому зоонозу (B. mallei). Этот процесс может сопровождаться постепенной утратой генов метаболизма, отдельные из которых, в частности, гены, кодирующие способность к использованию арабинозы в качестве единственного источника углерода, считают генами ави-рулентности. Исходя из наличия в геноме B. pseudomallei генов чужеродных видов микроорганизмов, которые определяют полиморфизм клинического течения мелиоидоза, получившего название «болезнь с обезьяньим лицом», представляется актуальным поиск новых (дополнительных) маркеров, дифференцирующих B. pseudomallei от других видов буркхольдерий, имеющих реальное и потенциальное медицинское значение. Можно полагать, что это будет способствовать более надежной фенотипической (молекулярно-биологической) дифференциации бурк-хольдерий группы pseudomallei, в которую, скорее всего, следует ввести и B. oklahomensis.
ЛИТЕРАТУРА
1. Антонов В.А., Илюхин В.И. Молеку-лярно-биологические подходы к диагностике и внутривидовому типирова-нию возбудителей сапа и мелиоидоза. Мол. генет. микробиол. вирусол. 2005, 2: 3-9.
2. Беляков В.Д., Ряпис Л.А., Илюхин В.И. Псевдомонады и псевдомонозы. М., Медицина, 1990.
3. Илюхин В.И., Алексеев В.В., Королев Ю.С. Буркхольдерии — возбудители сапа и мелиоидоза. А.С.Лабинская и др. (ред.). М., 2010.
4. Илюхин В.И., Сенина Т.В., Плеханова Н.Г. и др. Burkholderia thailandensis: биологические свойства, идентификация и таксономическая позиция. Мол. генет. микробиол. вирусол. 2002, 1: 7-11.
5. Определение чувствительности возбудителей опасных бактериальных инфекций (чума, сибирская язва, холера, туля-
ремия, бруцеллез, сап, мелиоидоз) к антибактериальным препаратам. МУК 4.2.2495-09. М., 2010, 59.
6. Brett P.F., Dezhazer D., Woods D.E. Burkholderia thailandensis sp. nov. a Burkholderia pseudomallei — like species. Intern. Bacteriol. 1998, 48: 317-320.
7. Chantratita N., Wuthiekanun V., Lim-mathurotsakul D. et al. Genetic diversity and microevolution of Burkholderia pseudomallei in the environment. PLoS Negl. Trop. Dis. 2008, 2: E182.
8. Coenye T., Vandamme P. Diversity and significance of Burkholderia species occupying diverse ecological niches. Environmen. Microbiol. 2003, 5 (9): 719-729.
9. Deshazer D. Virulence of clinical and environmental isolates of Burkholderia oklaho-mensis and Burkholderia thailandensis in hamsters and mice. FEMS Microbiol. Lett. 2007, 277 (1): 64-69.
10. Peacock S.J., Limmathurotsakul D., Lubell Y et al. Melioidosis vaccines: a systematic review and appraisal of the potential to exploit biodefense vaccines for public health purposes. PLoS Negl. Trop. Dis. 2012, 6 (1): E1488.
11. Ronning C. M, Losada L. Brinkac L. et al. Genetic and phenotypic diversity in Burkholderia: contributions by prophage and phage-like elements. Bio. Med. Centr. Microbiol. 2010, 10: 202.
12. Sim S. H., Yu Y, Lin C. H. et al. The core and accessory genomes of Burkholderia pseudomallei: implications for human melioidosis. PLoS Pathog. 2008, 4 (10): E178.
13. Tandhavanant S., Thanwisai A., Limma-thurotsakul D. Effect of colony morfology variation of Burkholderia pseudomallei on intracellular survival and resistance to antimicrobial environments in human macrophages in vitro. BMC Microbiol. 2010, 10: 303-315.
14. Tuanyok A., Auerbach R. K., Brettin T. S. et al. A horizontal gene transfer event defines two distinct groups within Burkholderia pseudomallei that have dissimilar geographic distributions. J. Bacteriol. 2007, 189 (24): 9044-9049.
15. Tumapa S., Holden M. T.G., Vesaratchavest M. et al. Burkholderia pseudomallei genome plasticity associated with genomic island variation. BMC Genomics. 2008, 9: 190.
Поступила 19.06.12
Контактная информация: Ряпис Леонид Абрамович, д.м.н., проф., 119991, Москва, ул. Трубецкая, 8, стр. 2, р.т. (499)248-18-33
