Сравнительная характеристика биологических свойств микроорганизмов, выделенных из морских акваторий с разной антропогенной нагрузкой

Ким Александра Вячеславовна; Бузолева Любовь Степановна; Богатыренко Елена Александровна

Materials of the Scientific and Practical Conference «Fundamental Far Eastern science for medicine»

ЛИТЕРАТУРА

1. Bou-m'handi N., Jacquet C., Marrakchi E.A., Martin P. Phenotypic and molecular characterization of Listeria monocytogenes strains isolated from a marine environment in Morocco. Foodborne Pathog Dis. 2007; 4(4): 409-417.

2. Терехова В.Е., Соснин В.А., Бузолёва Л.С., Ша-киров Р.Б. Распространение бактерий Listeria monocytogenes в западной части Охотского моря // Океанология. 2010; 50(2): 230-235.

3. Онищенко Г.Г. Влияние состояния окружающей среды на здоровье населения. Нерешенные проблемы и задачи // Гигиена и санитария, 2003; 31: 3-7.

4. Зуев В.С. Сапрофитизм патогенных бактерий // Ветеринарная патология. 2004; 4: 11-16.

5. Zhu Q., Gooneratne R., Hussain M.A. Listeria monocytogenes in Fresh Produce: Outbreaks, Prevalence and Contamination Levels. Foods. 2017; 6: 21.

6. Takahashi H., Miya S., Igarashi K., Suda T., Kura-moto S, Kimura B. Biofilm formation ability of Listeria monocytogenes isolates from raw ready-to-eat seafood.. J Food Prot. 2009; 72(7): 1476-1480.

7. Пономарева А.Л. Исследование интенсивности образования биопленок Listeria monocytogenes при различных температурах // Здоровье. Медицинская экология. Наука. 2016; 2 (65): 38-39.

Сведения об авторах

Еськова Алёна Игоревна - ФГБНУ «НИИ ЭМ имени Г.П. Сомова», младший научный сотрудник экологии патогенных бактерий; 690087, Владивосток, ул. Сельская, 1; e-mail: alenkaesya@gmail.com;

Бузолева Любовь Степановна - д.б.н., ФГБНУ «НИИ ЭМ имени Г.П. Сомова», профессор кафедры биоразнообразия и морских биоресурсов ДВФУ; e-mail: buzoleva@mail.ru.

Удк 579.68

А.В. Ким1, Л.С. Бузолева12, Е.А. Богатыренко1

сравнительная характеристика биологических свойств микроорганизмов, выделенных из морских акваторий с разной антропогенной нагрузкой

1 Дальневосточный федеральный университет, Владивосток

2 НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Г.П.Сомова, Владивосток

В данной работе представлены материалы исследования морских бактерий (кроме бактерий сем. Enterobacteriaceae), выделенных из вод районов с разной антропогенной нагрузкой. Была проведена работа по выявлению у изолятов гидролитической активности в отношении органических субстратов, антибиотикорезистентности, а также таких факторов патогенности, как адгезия, цитотоксичность, гемолитическая активность, активность ферментов плазмокоагулазы и гиалорунидазы. Сравнительные исследования проявления гидролитической активности у микроорганизмов, выделенных из морских акваторий с разной антропогенной нагрузкой, не выявили различий по этим показателям. Однако штаммы, выделенные из акваторий, испытывающих мощное влияние промышленных, бытовых и речных стоков, обладали высокой антибиотикоустойчивостью, высокоадгезивными свойствами и цитотоксичностью по сравнению со штаммами, выделенными из чистых морских вод. Можно предположить, что загрязнение морской среды приводит к проявлению агрессивных свойств у микроорганизмов как ответной реакции на воздействие стрессового фактора, что имеет как общебиологическое, так и важное эколого-эпидемиологическое значение.

Ключевые слова: морские микроорганизмы, факторы патогенности, антропогенное загрязнение, ферментативные свойства.

A.V. Kim1, L.S. Buzoleva1'2, E.A. Bogatyrenko1

comparative characteristic of the biological properties of microorganisms divided from marine aquatories with different anthropogenic load

1 Far Eastern Federal University, Vladivostok

2 Somov Institute of Epidemiology and Microbiology, Vladivostok

In this work we investigated marine bacteria (except Enterobacteriaceae) bacteria isolated from water in areas with different anthropogenic load, both coastal zones with high levels of different pollutants and pure zones with no human impact and their biological activity, including pathogenicity factors. Then we worked with the rest of the isolates for

• Материалы Научно-практической конференции «Фундаментальная дальневосточная наука - медицине»

detection of their hydrolytic activity toward organic substrates, antibiotic resistance and such pathogenicity factors as: adhesive, cytotoxicity, hemolytic activity, plasma coagulase and hyaluronidase activities. Comparative studies of the manifestation of hydrolytic activity in microorganisms isolated from marine areas with different anthropogenic loads, were not found the differences in this indicator. However, strains isolated from the water area, experiencing powerful means of production, household and restoration effluents, had high antibiotic resistance, highly adhesive properties and cytotoxicity compared to strains isolated from pure sea waters. It can be assumed that the pollution of the marine environment leads to the emergence of aggressive properties in microorganisms as responses to the stress factor, which has a general biological, an important ecological and epidemiological significance.

Keywords: marine microorganisms, pathogenicity factors, anthropogenic pollution, enzymatic properties.

Воздействие загрязняющих веществ в условиях современного состояния Мирового океана превратилось в мощный эволюционный фактор. Под действием антропогенного загрязнения микроорганизмы вырабатывают различные приспособительные механизмы к новым условиям среды [1]. Таким образом, антропогенное загрязнение может выступать в роли стрессора и влиять на изменение биохимических свойств у морских микроорганизмов на фенотипическом или на генетическом уровне, особенно если действуют сильные загрязнители как тяжелые металлы и антибиотики. Вместе с тем экологические и эпидемиологические последствия этих изменений еще не определены, но можно предположить, что подобные приспособления могут сопровождаться приобретением микроорганизмами признаков, представляющих опасность для гидробионтов, наземных организмов и человека [2]. Исходя из сказанного выше, возникает вопрос о возможности сапрофитных бактерий проявлять патогенные свойства под воздействием антропогенного фактора, выступающего в роли стресса.

Цель работы - дать сравнительную характеристику биологических свойств, в том числе факторов патогенности, морских бактерий, выделенных из акваторий с разной антропогенной нагрузкой.

Материалы и методы. Объектом исследования явились микроорганизмы, выделенные из прибрежных акваторий в Японском море: б. Золотой Рог, б. Киевка, б. Круглая. В июне - августе 2014 г. отбирали пробы воды с глубины 10-15 см от поверхности. Исследуемые районы расположены как в зоне активной береговой деятельности, для которых характерно комплексное загрязнение одновременно всеми видами поллютантов, что вызывает значительное экологическое напряжение и стрессы (б. Золотой Рог), так и в чистых (свободных от антропогенного воздействия) районах (б. Киевка, б. Круглая).

Для выделения чистой культуры морских бактерий использовали известные микробиологические методы [3] и среду для морских гетеротрофных микроорганизмов [4]. Для выделения бактерий сем. ЕШеюЬа^епасеае использовали среду Эндо. Определение липолитической, протеолитической и ами-лолитической активности проводили в соответствии

с известными методами, описанными в литературе [3], высевая суточную культуру на соответствующие среды: с агаровой средой, содержащей 3% ли-пидного гомогенизата; 25% снятого молока; 0,2% крахмала. Активность ферментов определяли по проявлению реакции на этих средах. Определение активности плазмокоагулазы и гиалорунидазы проводили согласно известным методам [3].

Для определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам использовали метод диффузии антибиотика в питательный агар на основе гидролизата рыбной муки (ГРМ-агар) с применением бумажных дисков, пропитанных антибиотиком. Взятые в работу антибиотики (карбеницилин, тетрациклин, ампицилин, цефотаксим, ципрофлокса-цин, цефтозидим, цефоперазон) обладают широким спектром действия [5]. После инкубирования при комнатной температуре измеряли диаметры зон задержки роста вокруг дисков (в мм) и по специальным таблицам определяли степень устойчивости к тому или иному антибиотику [6].

К факторам патогенности относят проявление у микроорганизмов гемолитической, цитопатической активности и адгезивных свойств. Для исследования гемолитической активности использовали 5% кровяной агар [3]. Для постановки опыта с целью изучения адгезивных свойств исследуемых штаммов была использована методика В. И. Брилис [7]. Адгезию изучали под световым микроскопом на микроскопе Micros mc 20.

При оценке адгезивных свойств микроба использовали следующие показатели: средний показатель адгезии, коэффициент участия клеток в адгезивном процессе и индекс адгезивности микроорганизма (ИАМ). Подсчет вели на 100 клетках, просматривая все предметное стекло. Микроорганизмы считали неадгезивными при ИАМ меньше 1,75, низкоадгезивными - от 1,76 до 2,5, среднеадгезивными - от 2,51 до 4,0 и высокоадгезивными при ИАМ выше 4,0. Для исследования цитопатических свойств микроорганизмов использовали культуру клеток Vero E6.

Для инокуляции клеточных культур готовили суспензию бактериальных клеток, выращенных на питательной среде для морских гетеротроф-

Materials of the Scientific and Practical Conference «Fundamental Far Eastern science for medicine» •

ных организмов [8]. В эксперимент были взяты разведения культуры по стандарту мутности от 10-9 до 10-1 клеток/мл. Инокуляцию проводили суспензией 22-часовой культуры. Через определенные интервалы времени (24, 48 часов) оценивали цитотоксические и инвазионные свойства по инфицированию культуры клеток бактериями, по изменению морфологии отдельных клеток и деструкции монослоя при микроскопическом исследовании. Цитопатические свойства микроорганизмов считали выраженными при наблюдении в поле зрения микроскопа дегенеративных изменений монослоя Vero E6 (гибель более 50% клеток в трех полях зрения).

Результаты и обсуждения. На первом этапе исследования были выделены из морской воды 75 морфотипов бактерий, из них 25 изолятов из б. Золотой Рог, 27 - из б. Круглая, 23 - из б. Ки-евка, при этом в коллекцию не были включены штаммы сем. Enterobacteriaceae (с целью исключения из эксперимента патогенных и условно -патогенных бактерий).

У полученных изолятов исследовали наличие активности гидролитических ферментов (липаза, амилаза, протеиназа) как ответную реакцию на изменение факторов среды. При этом сравнительные исследования случаев проявления гидролитической активности у микроорганизмов, выделенных из морских акваторий с разной антропогенной нагрузкой, не выявили различий по этим показателям.

В результате проверки теста на чувствительность к антибиотикам в большинстве случаев у штаммов из б. Золотой Рог отмечена высокая устойчивость к антибиотикам, используемым в эксперименте, по сравнению с изолятами, выделенными из чистых акваторий.

Были исследованы свойства морских бактерий, которые характеризовали бы их потенциал с точки зрения патогенности - способность клеток бактерий к адгезии и инвазии. Исследования показали, что доля штаммов, обладающих сильноадгезивными свойствами, была выше в б. Золотой Рог, по сравнению с чистыми акваториями. Неадгезивными свойствами (ИАМ меньше 1,75) в большинстве своем (75%) обладали штаммы из б. Киевка.

Гемолитическая активность была обнаружена только у двух изолятов, выделенных из б. Золотой Рог. При сравнении случаев проявления плазмо-коагулазной активности было установлено, что у микроорганизмов из б. Золотой Рог число встречаемости штаммов, обладающих этим ферментом, составило 68%, из б. Круглая - 44,4% и из б. Киевка -47,8%. Доля штаммов, обладающих гиалурони-дазной активностью, также была выше у изолятов б. Золотой Рог (60%), по сравнению с числом штаммов из б. Круглая (40,7%) и б. Киевка (47,8%).

При изучении цитотоксических свойств исследуемых штаммов из б. Киевка и б. Круглая слабо разрушали клетки монослоя при десятикратном разведении культуры, и практически не наблюдали цитопатического действия при последующих разведениях культуры этих бактерий. Высокий цитопатический эффект (50% и более гибели монослоя клеток при контакте с микроорганизмами) наблюдали у штаммов, выделенных из б. Золотой Рог даже при разведении культуры бактерий до 105 кл/мл.

Вывод. Можно предположить, что загрязнение морской среды приводит к проявлению агрессивных свойств у морских микроорганизмов, как ответной реакции на воздействие стрессового фактора, что имеет как общебиологическое, так и важное эколо-го-эпидемиологическое значение.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Финансирование. Исследование выполнено без привлечения спонсорских средств. Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (Соглашение № 14-50-00034).

ЛИТЕРАТУРА

1. Сомов Г.П., Бузолева Л.С. Адаптация патогенных бактерий к абиотическим факторам окружающей среды. - Владивосток: ОАО «Примполиграф-комбинат», 2004. - 167 с.

2. Secades P., Alvarez B., Guijarro J.A. Purification and characterization of a psychrophilic, calcium-induced, growth-phase-dependent metalloprotease from the fish pathogen Flavobacterium psychrophilum. Appl. Enviro. Microbial. 2001; 67(6): 2436-2444.

3. Частная медицинская микробиология с техникой микробиологических исследований: Учебное пособие / Под ред. Лабинской А.С., Блинковой Л.П., Ещиной А.С. - М.: Медицина, 2005. - 600 с.

4. Tran V., Jacoby M. Mechanism of plasmid-me-diated quiolone resistance. Prot. Natl. Acad. Sci. USA. 2002; 16(8): 5638-5642.

5. Shefet D., Robenshtok E., Paul M., Leibovici L. Empirical atypical coverage for inpatients with com-munityacquired pneumonia: systematic review of randomized controlled trials. Arch Intern Med. 2005; 165: 1992-2000.

6. МУК 4.2.1890-04. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам. - М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 2004.- 91 с.

7. Брилис В.И. Методика изучения адгезивного процесса // Лабораторное дело. 1986; 4: 210-212.

8. Youchimizu M., Kimura T. Study on intestinal microflora of Salmonids. Fish. Pathol. 1976; 10(2): 243259.

• Материалы Научно-практической конференции «Фундаментальная дальневосточная наука - медицине» Сведения об авторах

Ким Александра Вячеславовна - Дальневосточный федеральный университет, вед. инженер кафедры биоразнообразия и морских биоресурсов; 690920, Владивосток, о. Русский, пос. Аякс, лабораторный корпус; e-mail: kim-sandra@mail.ru;

Бузолева Любовь Степановна - д.б.н., ФГБНУ «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова», главный научный сотрудник экологии патогенных бактерий, доктор биологических наук; ДВФУ, профессор кафедры биоразнообразия и морских биоресурсов 690087, Владивосток, ул. Сельская, 1, тел. (423)244-18-88, e-mail: buzoleva@mail.ru;

Богатыренко Елена Александровна - ДВФУ, м.н.с. кафедры биоразнообразия и морских биоресурсов 690920, Владивосток, о. Русский, пос. Аякс, лабораторный корпус; e-mail: bogatyrenko.ea@dvfu.ru.

УДК 579.24+ 579.26

А.Л. Пономарева1, Л.С. Бузолева12

влияние факторов внешней среды на биопленокообразование бактерий рода salmonella

1 НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Г. П. Сомова, г. Владивосток

2 Дальневосточный Федеральный Университет, г. Владивосток

Основной формой существование сообществ микроорганизмов как в теплокровном организме, так и в объектах окружающей среды, являются биопленки. На примере Salmonella enterica выявлено, что оптимум интенсивности сочетания исследуемых факторов не совпадает с их отдельными оптимумами. Если один из факторов находиться в наиболее благоприятном для тестируемого микроорганизма диапазоне, то он способен компенсировать неблагоприятное воздействия других факторов.

Ключевые слова: биопленки, многофакторный анализ, регрессионный анализ, температура, соленость, питание, Salmonella enterica.

A.L. Ponomareva1, L.S. Buzoleva12

influence of the factors of the external environment

on the biological factoration of bacteria of the genus salmonella

1 Research Institute of Epidemiology and Microbiology named after GP Somov, Vladivostok, Russia

2 Far Eastern Federal University, Vladivostok, Russia

Biofilms is the basic form of the existence communities of microorganisms in both the warm-blooded body and in the objects of the environment. Par example Salmonella enterica it was revealed that the optimum of intensity of the combination factors does not match with their individual optima. If one of the factors is in the most favorable range for the testing microorganism, then it is able to compensate for the adverse effects of other factors.

Keywords: biofilms, multifactor analysis, regression analysis, temperature, salinity, nutrition, Salmonella enterica.

Известно, что биопленки микроорганизмов обладают повышенной устойчивостью к стрессовым факторам. Среди абиотических экологических факторов, влияющих на биопленкообразование бактерий, наиболее исследованными являются температура и соленость [1, 2, 3, 4, 5, 6].

Исходя из этого, целью данного сообщения стала оценка многофакторного воздействия на формирование биопленок Salmonella enterica. В качестве условий внешней среды были взяты наиболее исследованные: питание, соленость среды и температура. Материалы и методы исследования В качестве объектов исследования были взяты 4 штамма Salmonella enterica (S24581, S24585, S1893, S118) из коллекции НИИ эпидемиологии и микробио-

логии им. Г.П. Сомова. Изучение влияния температуры проводили при 8, 20 и 37°С, солености - 0, 17 и 34%о (соленость морской воды). В качестве источника питания использовали глюкозу в концентрации 0,1, 0,5 и 1 %. Наблюдения проводили в течение 3 суток.

Для образования биопленок тестируемых микроорганизмов культивирование проводили в стандартных 96 луночных планшетах. Интенсивность формирования биопленок фиксировали с помощью метода G.D. Christensen в модификации с использованием красителя генциан виолет, измеряя оптическую плотность при ^=540 нм [8].

Для обработки результатов опытов применяли традиционные методы математической статистики: корреляционный, регрессионный и дисперсионный

COMPARATIVE CHARACTERISTIC OF THE BIOLOGICAL PROPERTIES OF MICROORGANISMS DIVIDED FROM marine AQUATORIES WITH DIFFERENT ANTHROPOGENIC LOAD