CC BY
75
УДК 661.163;547.785.5
Г. Е. Чикишева(к.т.н., доц., в.н.с.), Ю. А. Медведев (д.м.н., проф., с.н.с.), Ю. Е. Сапожников (к.ф-м.н., зав. лаб.), А. М. Колбин (к.х.н., с.н.с., зав.лаб., дир.)
Сравнительная антифунгальная активность некоторых
производных метилового эфира 2-бензимидазолил-карбаминовой кислоты в отношении фитопатогенных и антропо-зоопатогенных грибов
Научно-исследовательский технологический институт гербицидов и регуляторов роста растений с опытно-экспериментальным производством РАН 450029, ул. Ульяновых, 65, г. Уфа; тел. тел. (347) 2428352, e-mail: [email protected]
G. E. Chikisheva, Yu. A. Medvedev, Yu. E. Sapozhnikov, A. M. Kolbin
Comparative antifungal activity of some derivatives of a methyl ether 2-benzimidazolylcarbamine acid concerning phytopathogenic and antropozoopathogenic mushrooms
Scientific-Research Technological Institute of Herbicides and Plant Growth Regulators with the CES Academy of Sciences of Republic Bashkortostan 65, Ulyanovyih Str, 450029, Ufa, Russia; ph. (347)2428352, e-mail: [email protected]
Синтезированы дигидрат гидрохлорида метилового эфира 2-бензимидазолилкарбаминовой кислоты (ГХБМК) и комплекс БМК с сульфатом меди (СМБМК). Метиловый эфир 2-бензи-мидазолилкарбаминовой кислоты (БМК, кар-бендазим) и его производные способны оказывать антифунгальное действие как на фитопатоген-ные, так и антропо- и зоопатогенные грибы — плесневых и дрожжеподобных возбудителей «оппортунистических» микозов и возбудителей дерматофитий. При этом антифунгальная активность ГБМК и СМБМК при действии на тест-культуры разных грибов превосходит таковую исходного БМК в 1.5—5 раз.
Ключевые слова: антропо- и зоопатогенные микроскопические грибы; метиловый эфир 2-бензимидазолилкарбаминовой кислоты и его производные; фунгицидное действие.
Поиск и исследование веществ и соединений, обладающих способностью уничтожать или подавлять рост и размножение микроскопических грибов (антифунгальное действие), продолжает сохранять свою актуальность. Проблема борьбы с микроскопическими грибами касается их патогенных представителей, поражающих растительные и животные организмы 1,2. Антифунгальные препараты и средства могут быть предназначены или для защиты растений в сельском хозяйстве и промышленности, или для лечения и профилактики микотических заболеваний людей и животных в медицине и ветеринарии 3-5. При этом поиск
Дата поступления 17.08.13
Dihydrate of hydrochloride of methyl ether 2-benzimidazolylcarbamine acid (HClBMC) and complex BMC with copper sulphate (CSBMC) are synthesised. A methyl ether 2-benzimi-dazolylcarbamine acid (BMC, carbendazim) and it derivatives are capable to render antifungal action as on phytopathogenic, anthropo- and zoopatho-genic mushrooms — activators of «opportunistic» mycoses and dermatophytosis. Thus antifungal activity of the HClBMC and the CSBMC at action on test cultures of different mushrooms surpasses that the initial BMC in 1.5-5 times.
Key words: anthropo- and zoopathogenic microscopic mushrooms; methyl ether 2-benzimi-dazolylcarbamine acid; derivatives; antifungal action.
тех и других препаратов является, как правило, предметом самостоятельных, не взаимосвязанных разработок. Ввиду этого степень универсальности антифунгального действия в отношении грибов, патогенных в отношении растений или животных и людей, до настоящего времени мало прояснена.
Метиловый эфир 2-бензимидазолилкарба-миновой кислоты (БМК) получил широкое практическое применение в сельском хозяйстве в качестве системного фунгицида 6. БМК легко образует соли и комплексы с металлами переменной валентности 7-9. Значительной фунгицидной активностью обладает не только карбендазим, но и его различные производные. Вероятно, механизм антифунгальной ак-
тивности, как и других проявлений биологической активности для производных бензими-дазола, не сводится к какому-либо единому универсальному биологическому действию, так как в каждом конкретном случае имеется целая их совокупность с преобладанием того или иного эффекта 5. Ввиду вышеприведенных положений, нами проведено сравнительное исследование фунгицидной активности БМК и его производных — гидрохлорида БМК (ГХБМК) и комплекса БМК с сульфатом меди — 2БМК-Си804 (СМБМК) в отношении представителей как фитопатогенных, так и антропо- и зооантропопатогенных грибов.
Материалы и методы исследования
В исследовании использованы препараты БМК и его производных - ГХБМК и СМБМК.
Синтез дигидрата гидрохлорида БМК.
Суспензию БМК 15 г (0.0785 молей) в 80 мл H2O при перемешивании нагревали до 60 оС, в течение 15 мин дозировали 13.13 мл 11.96 Н водного раствора HCl (0.157 молей), выдерживали при этой же температуре 15 мин. Реакционную массу охлаждали при комнатной температуре в течение 3-х ч. Образовавшийся осадок отфильтровывали и сушили под ИК - лампой. Вес полученного осадка — 18.451 г. Выход в расчете на гидрохлорид карбендазима дигидрата — 89.17%. Исходя из меркурометрического анализа на содержание Cl-ионов, доля ГХБМК в полученном препарате составляет 86.88%, анализ осадка по данным УФ-спектроскопии — 86%, что свидетельствует об образовании ГХБМК • 2H2O.
Синтез 2БМКСиБ04 К БМК 3.82 г (0.02 моля) добавляли 2.5 г (0.01 моль) CuSO4 • 5H2O, приливали 6 мл воды и 2 мл ацетона, суспензию перемешивали в течение 2-х ч при 50 оС. Происходит изменение цвета реакционной массы от голубого к серо-фиолетовому. Затем повышали температуру до 90 оС и продолжали синтез еще час. Растворитель отгоняли. При отгонке ацетона происходит изменение цвета суспензии от серо-фиолетового к светло-зеленому. Осадок досушивали под инфракрасной лампой. Содержание меди в комплексе определяли комплексо-
нометрически, титрованием трилоном Б после
10
предварительного разложения комплекса 10 . Для анализа часть осадка отмывали водой от не-прореагировавшего сульфата меди. В отмытом осадке содержание Cu2+ составляет 9.6%, расчетное содержание меди — 11.72% (содержание комплекса в осадке — 82%).
Фунгицидная активность проверялась путем учета полной задержки роста — минималь-
ной подавляющей концентрации (МПК) в отношении тест-культур грибов на плотной питательной среде Сабуро (2% агар-агара, 1% глюкозы, 5% пептона, остальное — вода), содержащей исследуемые препараты. При проведении исследования порошкообразные препараты предварительно предрастворялись в диметил-сульфоксиде (ДМСО) и вносились в расплавленную селективную среду Сабуро. 1 Мл раствора БМК или его производных в ДМСО вносили в 100 мл среды (до конечных концентраций веществ 0.1—10.0 мг/мл), разливали по 20 мл в чашки Петри и равномерно перемешивали вплоть до полимеризации среды. После полимеризации («застывания») на среды с препаратами и контрольные среды (среды без добавления веществ, среды с предрастворителем — 1% ДМСО) высевали тест-культуры грибов и инкубировали при 28 оС в течение 40 дней. Результаты регистрировали ежедневно визуально по наличию роста типичных колоний грибов 11,12,
Для определения фунгицидной активности соединения в отношении фитопатогенных почвообитающих грибов, вызывающих заболевания растений, использованы тест-культуры фитопатогенных грибов Fusarium graminea-rum и Alternaria alternata.
В качестве тест-объектов для оценки анти-фунгального действия в отношении антропо- и зоопатогенных грибов использовали культуры клинических (выделенных из патологического материала больных и лабораторно идентифицированных) штаммов грибов: возбудителей «оппортунистических инфекций» — условно-патогенных плесневых грибов Penicillium notatum и Äspergiüus ninger, дрожжеподоб-ных грибов Candida albicans, и «первично-патогенных» грибов — возбудителей дерматофи-тий: дерматофитов антропофильных — возбудителей микозов стоп и кистей Trichophyton mentagrophytes var. interdigitale и Trichophyton rubrum, возбудителей зооантропонозных трихофитии и микроспории— Trichophyton mentagrophytes var.gypseum (seu granulosum) и Microsporum canis.
Определение МПК изученных соединений в отношении всех тест-культур грибов проводилось не менее чем троекратно.
Результаты и их обсуждение
При изучении антифунгельной активности БМК и его производных было установлено, что исследованные соединения проявляют ан-тифунгальные свойства как при воздействии на фитопатогенные грибы, так и в отношении
возбудителей микозов, поражающих людей и/ или животных (табл.1).
Как видно из материалов таблицы, как фи-топатогенные, так и условно-патогенные плесневые возбудители «оппортунистических» микозов человека и животных и фитопатогенные грибы характеризуются примерно сходной резистентностью к действию БМК и исследованных его производных. МПК для БМК в отношении исследованных и фито-, и зоопатогенных грибов составляла сходные значения (2—5 мг/мл). Полученные данные о фунгицидной активности БМК соответствуют ранее известным данным по подавлению роста БМК и его производных (в концентрациях 3—5 мг/мл) фитопатогенных грибов других видов Fusarium culmorum и Helmintho-sporium sativum 5. По нашим материалам биологическая активность гидрохлорида БМК и комплекса БМК с сульфатом меди в отношении использованных фитопатогенных и условно-патогенных плесневых грибов превосходила таковую собственно БМК в 1.5—2 раза.
Дрожжеподобные грибы, в частности, один из ведущих возбудителей «оппортунистических» микозов человека, возбудитель кандидо-за (Candida albicans) проявлял значительно меньшую резистентность (до 10 раз) в сравнении с плесневыми фито- и зооантропопатоген-ными грибами к действию как БМК, так и его производных. Однако при этом изученные производные БМК превосходили по антифунгаль-ной активности в отношении Candida albicans исходный препарат БМК в 1.5—1.8 раза.
Возбудители дерматофитий в отношении БМК и его изученных производных в сравнении с мицелиальными грибами проявляли значительно меньшую резистентность. МПК для БМК при действии на все дерматофиты была сходна для таковой в отношении дрожжеподоб-ных грибов и значительно ниже (в 10 и более раз), чем для фитопатогенных и плесневых условно-патогенных возбудителей «оппортунисти-
Таблица 1
Биологическая активность метилового эфира 2-бензимидазолилкарбаминовой кислоты и его производных - гидрохлорида БМК и комплекса БМК с сульфатом меди в отношении фитопатогенных (ФП) и антропо-зоопатогенных грибов-возбудителей «оппортунистических» микозов (ОМ) и дерматофитий - антропонозных (ДА) и зооантропонозных (ДЗ)
ческих» микозов людей и животных. МПК исследованных нами производных БМК была ниже в 3—5 раз, чем МПК исходного прапарата.
Таким образом, БМК и исследованные нами его производные способны проявлять ан-тифунгальные свойства в отношении зооантро-попатогенных грибов — возбудителей микозов. Как известно, «оппортунистические» микозы вызываются разнообразными видами грибов, предпосылкой к возникновению которых является наличие предрасполагающих факторов со стороны организма хозяина (разнообразные нарушения тех или иных механизмов его защиты от грибов-возбудителей). Возбудителями таких «плесневых» микозов (аспергиллез, пеницилли-оз и др.) являются в основном свободно живущие обитатели объектов внешней среды (почва, воздух, вода, растения и др.). При этом возбудителями «оппортунистических» микозов могут выступать и некоторые фитопатогенные грибы. В целом сходство биологических свойств свобод-ноживущих почвообитающих, фитопатогенных грибов и возбудителей «оппортунистических» плесневых микозов, по-видимому, и определяет их сходную чувствительность к антифунгально-му действию разработанного в качестве системного фунгицида БМК и его производных.
Дрожжеподобным грибам, вызывающим «оппортунистические» микозы, особенно основным возбудителям кандидоза, свойственна иная экология. Грибы рода Candida, в том числе наиболее частый возбудитель кандидоза Candida albicans, являются естественными обитателями покровных тканей (кожа, слизистые оболочки) людей и животных. Ввиду этого по своим физиологическим свойствам эти грибы значительно ближе к зоопаразитарным грибам. Чувствительность этих грибов к антифун-гальному действию БМК и его производных значительно выше, а МПК для них сходны с таковыми для дерматофитов.
Виды тест-культур штаммов грибов Минимально подавляющая концентрация, (мг/мл)
БМК БМЮНСЬ2Н20 2БМК•CuS04
ФП Alternaria alternata 4-5 2-3 2-3
Fusarium graminearum 2-3 1-2 1-2
Candida a1bicans 0.4-0.5 0.2-0.3 0.2-0.3
Aspergillus niger 4-5 2-3 4-5
Penicillium notatum 2-3 0.5-1 0.3-0.4
ДА Trichophyton mentagrophytes var. interdigitale 0.2-0.3 0.1 0.1
Trichophyton rubrum 0.2 0.1 0.1
ДЗ Microsporum canis 0.3-0.5 0.1 0.1
Trichophyton mentagrophytes var. granulosum 0.3-0.5 0.1 0.1
Дерматофиты — мицелиальные грибы родов Trichophyton, Microsporum и Epidermophyton. Дерматофиты вызывают дерматофи-тии — контагиозные инфекции с поражением кожи разной глубины (эпидермис, дерма) и ее придатков (волосы, ногти). В зависимости от вида возбудителя заболевания — микозы стоп и кистей, антропонозная и зооантропонозная трихофития и микроспория; фавус («парша»), эпидермофития — могут протекать остро и/или хронически, с разной степенью выраженности воспалительных явлений, и передаваться или только от человека к человеку, или от животных к человеку. Возбудители дерматофитий являются несовершенными формами почвообитающих кератинофильных грибов родов Arthroderma и Nannizzia, патогенность которых дискутабель-на. Считается, что в ходе паразитарной адаптации дерматофиты утратили способность к сапро-фитическому существованию. Ввиду вышеприведенного, антифунгальная активность БМК и его производных в отношении дерматофитов, как и других антропопатогенных грибов, может представлять интерес в плане перспектив их возможного применения для терапии микозов. В
Литература
1
этом плане следует отметить, что концентрации БМК и особенно его изученных производных, оказывающие угнетатющее действие на антропо-патогенные грибы (0.1—5 мг/мл), несколько больше, но сопоставимы по фунгицидной активности с лечебными дозами препаратов, применяемых для наружного лечения людей, например, мирамистина (бензилдиметил [3-(миристоил-амино)пропил]аммоний хлорида моногидрат) — (0.015-0.5 мг/мл)13.
Таким образом, метиловый эфир 2-бензи-мидазолилкарбаминовой кислоты (БМК) и его производные — гидрохлорид БМК (ГХБМК) и комплекс БМК с сульфатом меди (СМБМК) способны оказывать фунгицидное действие как на фитопатогенные грибы, так и на грибы, вызывающие «оппортунистические» микозы и дерматофитии у людей и животных. Антифун-гальная активность ГБМК и СКБМК в отношении фитопатогенных и антропозоопатоген-ных грибов существенно превосходит таковую исходного БМК, поэтому вопрос возможностей использования производных БМК в качестве средств лечения микозов человека и животных нуждается в дальнейшем изучении.
Дурынина Е. П., Великанов Л. Л. Почвенные 1. фитопатогенные грибы.— М.,1984.— 107 с.
2. Гарибова Л. В., Лекомцева С. Н. Основы мико- 2. логии: Морфология и систематика грибов и гри-боподобных организмов.— М.: Т-во научных изданий КМК, 2005.— 220 с.
3. Степанова Ж. В. Грибковые заболевания.— М.: 3. Миклом.- 2005.- 124 с.
4. Медведев Ю. А., Арефьева Н. А.. Фархутдино- 4. ва Л. Р., Ярмухамедова А. Г., Машко П. Н. Ми-котическая инфекция и антифунгальный иммунитет при оториноларингологической патологии. — Уфа, 1996.- 72 с.
5. Пилюгин В. С. Азотсодержащие гетероцикли- 5. ческие соединения. Синтез и биологическая активность производных 2-аминобензимидазола и 1,3,5-сим-триазина.— Уфа: Гилем, 2008.— 372 с.
6. Мельников Н. Н. Пестициды. Химия, технология и применение.— М.: Химия, 1987.— С.559. 6.
7. Machata S. G., Sanghvi T. and Yalkowsky S. H. // AAPS Pharm.Sci.Tech.— 2005.— 6(1).— Article 18.— E 115-119. 7.
8. Пат. США 3595870 // Р.Ж.Хим.— 1972.— 9Н571П.
9. Пат. Яп. 49-48433//Р.Ж.Хим.—1975.—200350П.
10. ГОСТ 10398-76.— С.13. 8.
9.
11. Сбойчаков В. Б. Медицинская микология.— М.: Гоэтар-медиа, 2008.— 208 с. 10.
12. Кашкин П. Н., Лисин В. В. Практическое руко- 11 водство по медицинской микологии.— Л.: Медицина, 1983.— 190 с. 12.
13. Молочков В. А., Кириченко И. М., Арзума-нян В. Г., Кривошеин Ю. С. //Усп. мед. микологии.— 2004.— T.IV.— Гл.9.— С.302. 13.
References
Durynina E. P., Velikanov L. L. Pochvennye fitopatogennye griby.— M.,1984.— 107 p. Garibova L. V., Lekomceva S. N. Osnovy mikologii: Morfologiya i sistematika gribov i gribopodobnykh organizmov.— M.: T-vo nauch-nykh izdanii KMK, 2005.— 220 p.
Stepanova Zh. V. Gribkovye zabolevaniya.— M.: Miklom.— 2005.- 124 p.
Medvedev Yu. A., Aref'eva N. A.. Farkhutdinova L. R., Yarmukhamedova A. G., Mashko P. N. Mikoticheskaya infekciya i antifungal'nyi immunitet pri otorinolaringologicheskoi patologii.- Ufa, 1996.- 72 p. Pilyugin V. S. Azotsoderzhashhie geterotsiklicheskie soedineniya. Sintez i biologicheskaya aktivnost' proizvodnykh 2-aminobenzimidazola i 1,3,5-sim-triazina.- Ufa: Gilem, 2008.- 372 p.
Mel'nikov N. N. Pestitsidy. Khimiya, tehnologiya i primenenie.- M.: Khimiya, 1987.-P.559.
Machata S. G., Sanghvi T. and Yalkowsky S. H. AAPS Pharm.Sci.Tech.- 2005.- 6(1).- Article 18.- E 115-119.
Pat. SShA 3595870 R.Zh.Him.- 1972.- 9N571P. Pat. Jap. 49-48433 R.Zh.Him.-1975.-200350P. GOST 10398-76.- P.13.
Sboichakov V. B. Meditsinskaya mikologiya.-M.: Goetar-media, 2008.- 208 p. Kashkin P. N., Lisin V. V. Prakticheskoe rukovodstvo po medicinskoi mikologii.- L.: Meditsina, 1983.- 190 p.
Molochkov V. A., Kirichenko I. M., Arzumanyan V. G., Krivoshein Ju. S. Usp. med. mikologii.-2004.- T.IV.- Gl.9.- P.302. 13. Том 20. № 3 111
