CC BY
104
ИММУНОЛОГИЯ № 1, 2012
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ИММУНОЛОГИЯ И ИММУНОГЕНЕТИКА
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012
УДК 616.379-008.64-055.5/.7-092:612.6.02.017.1
Д. Д. Абрамов3, И. И. Дедов2, P M. Хаитов1, М. Н. Болдырева1, Л. П. Алексеев1 СРАВНЕНИЕ ВКЛАДА СИСТЕМЫ HLA И ДРУГИХ ГЕНОВ ИММУННОГО
ответа в формирование генетической предрасположенности к развитию сахарного диабета 1-го типа
1ФГБУ ГНЦ - Институт иммунологии ФМБА России (117478, Москва, Каширское ш., д. 24, к. 2); 2ФГУ Эндокринологический научный центр Минздравсоцразвития РФ (Москва, ул. Дмитрия Ульянова, д. 11), 3ЗАО НПФ ДНК-Технология (Москва, Каширское ш., 23, корп. 5)
Проведена работа по изучению распределения аллелей HLA класса II и распространения полиморфизма +49 A/G гена CTLA4 (rs231775) в русской популяции у детей, больных сахарным диабетом 1-го (CD-1) типа, и у здоровых лиц. У 40 (80%) из 50 пациентов с СД-1 выявлен хотя бы один из классических маркерных гаплотипов HLA (DRB1*04-DQA1*301-DQB1*302 и DRB1*17-DQA1*501-DQB1*201). У 7 из 10 больных СД-1, не несущих ни одного из классических маркерных гаплотипов HLA, ген CTLA4 был представлен генотипом 49GG, ассоциированный, по данным литературы, с развитием СД-1. Различия в частоте аллелей HLA и генотипов CTLA4 среди пациентов с СД-1 и лиц контрольной группы статистически достоверны. С одной стороны, полученные данные позволяют сделать предположение о независимой от системы HLA роли CTLA4 в патогенезе СД-1, с другой - подтверждают ведущую роль системы HLA в формировании генетической предрасположенности к развитию СД-1.
Ключевые слова: HLA класса II, CTLA4 49A/G, rs231 775, СД-1, русская популяция (Москва)
Abramov D.D. 3, Dedov I.I. 2, Khaitov R.M., 1 Boldyreva M.N., 1 Alekseev L.P. 1
COMPARISON OF THE CONTRIBUTION OF THE HLA SYSTEM AND OTHER IMMUNE RESPONSE GENES TO THE DEVELOPMENT OF GENETIC PREDISPOSITION TO TYPE 1 DIABETES MELLITUS
The objective of the present study was to estimate the frequency of class II HLA alleles as well as +49A/G gene CTLA4 (rs231775) polymorphism in the Russian populations of the children presenting with type 1 diabetes mellitus (n = 50) and the healthy donors. Forty (80%) of the diabetic children bore at least one “classical” marker HLA haplotypes, such as DRB1*04-DQA11*301-DQB1*302 or DRB1*17-DQA1*501-DQB1*201. Seven of the remaining 10 patients were found to be free of “classical” marker HLA haplotypes. The CTLA4 gene was presented by the 49GG genotype associated with the development of type 1 diabetes mellitus according to the available literature data. The differences in the frequency of HLA alleles and CTLA4 genotypes between the diabetic children and the healthy controls are statistically significant. The results of the study on the one hand suggest that CTLA4 contribution to the development of type 1 diabetes mellitus is not mediated through the HLA genes while on the other hand confirm that the HLA system plays a leading role in the formation of the genetic predisposition to type 1 diabetes mellitus.
Key words: Class II HLA, CTLA4 49A/G, rs231775, CD1, Russian population
Введение. Сахарный диабет 1-го типа (СД-1) рассматривается как многофакторное заболевание, существенная роль в развитии которого принадлежит наследственной предрасположенности. Как показали результаты широкомасштабных международных исследований последних лет, направленных на поиск областей генов, которые ассоциированы с предрасположенностью к СД-1, в формировании данной предрасположенности участвуют более 20 областей генов, локализованных на различных хромосомах [8, 12].
Как правило, генетический полиморфизм таких областей обусловлен наличием замен одиночных нуклеотидов (Single Nucleotide Polymorphisms - SNP) в генах,
Хаитов Рахим Мусаевич - д-р мед. наук, проф., акад РАН, акад. РАМН, директор ГНЦ - Институт иммунологии, тел. 8(499) 617-78-44
белковые продукты которых регулируют различные этапы иммунного ответа и участвуют в различных этапах метаболизма. Биологическим эффектом таких SNP могут быть изменение экспрессии гена (если полиморфизм затрагивает регуляторные участки гена) или изменение аминокислотного состава продукта. Так, одним из наиболее изученных SNP, ассоциация которого с развитием СД-1 показана в многочисленных публикациях для различных популяционных групп, является однонуклеотидная замена +49 A/G (rs231775) в гене CTLA4 (cytotoxic T-lymphocyte associated antigen-4, поверхностный антиген цитотоксических Т-лимфоцитов) [9-11, 13]. Данная замена нуклеотида в свою очередь приводит к замене аминокислоты в 17-й позиции белкового продукта гена CTLA4, участвующего в регуляции активации Т-лимфоцитов, и, соответственно, к изменению его физиологического действия. Изменение
- 4 -
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ИММУНОЛОГИЯ И ИММУНОГЕНЕТИКА
свойств белкового продукта гена CTLA4 может вызывать нарушение регуляции деятельности Т-лимфоцитов и развитие аутоиммунного процесса.
Однако наиболее значительный вклад в формирование генетической предрасположенности к СД-1 вносят гены главного комплекса гистосовместимости человека (HLA класса II), расположенные на коротком плече 6-й хромосомы. Высокий уровень ассоциации генов HLA с предрасположенностью к заболеванию СД-1 также объясняется тем, что продукты этих генов не только являются генетическими маркерами предрасположенности к СД-1, но и, презентируя диабетогенные пептиды, выполняют функцию запуска аутоиммунного процесса, лежащего в основе заболевания [7].
Результаты совместных исследований, проведенных сотрудниками ФГУ Эндокринологический научный центр Минздравсоцразвития России и ФГБУ ГНЦ - Институт иммунологии ФМБА России, свидетельствуют о том, что генотипы, включающие HLA DRB1*04 и HLA DRB1*03, обусловливают высокий уровень ассоциации с СД-1 у представителей русской популяции [1, 7]. Данные литературы говорят также о том, что в различных мировых популяциях HLA «маркеры» DRB1*03 и DRB1*04 ассоциированы с высокой вероятностью развития СД-1 [14].
По различным оценкам, от 40 до 70% вклада в генетическую основу СД-1 определяют именно гены HLA [4, 7], в то время как вклады генов INS (кодирует синтез инсулина) и CTLA4 составляют приблизительно по 10%. Кроме того, на локусы IDDM4-IDDM10 также суммарно приходится до 40% вклада в формирование генетической предрасположенности к СД-1 [2, 6, 15].
Следует отметить, что точное определение вклада конкретной области генов, локуса или замены одиночного нуклеотида в развитие предрасположенности к СД-1 представляет значительные трудности по причине «маскирующего» эффекта других «маркеров», в том числе тех, которые относятся к системе HLA, который может быть обусловлен как более значительным их вкладом в генетическую основу предрасположенности к СД-1, так и наличием протективных генотипов.
Цель настоящего исследования - анализ распределения генотипов HLA класса II и распространения полиморфизма 49A/G гена CTLA4 в русской популяции у больных СД-1 и у здоровых лиц с последующим сравнением вклада системы HLA и гена CTLA4 в формирование предрасположенности к СД-1.
Материалы и методы. В качестве материала для исследований использовали коллекции периферической крови детей в возрасте 5-12 лет с диагнозом СД-1 (50 образцов, москвичи) и здоровых лиц из числа доноров крови (71 образец, москвичи).
Выделение ДНК проводили по методу Higuchi (Higuchi R., Erlich H., 1989) с некоторыми модификациями из 0,5 мл периферической крови. Концентрация ДНК составила в среднем 50-100 мкг/мл.
Для HLA-генотипирования по локусам HLA-DRB1, HLA-DQA1, HLA-DQB1 применяли наборы реагентов производства ЗАО НПФ ДНК-Технология (Москва).
Однонуклеотидную замену 49 A/G (rs231775) в первом экзоне гена CTLA4 определяли модифицированным методом «примыкающих проб», используя оригинальные олигонуклеотиды [5].
Частоту аллелей и генотипов для исследуемых групп сравнивали с помощью точного критерия Фишера с применением поправки Бонферрони.
Таблица 1
Частота вариантов гена CTLA4 в русской популяции (Москва) у больных сД-1 и у здоровых лиц
Вариант Здоровые лица (п = 71) Больные СД-1 (п = 50)
абс. % абс. %
CTLA449А 85 60 43 43
CTLA449G 57 40 57 57
Таблица 2
Частота генотипов гена CTLA4 в русской популяции (Москва) у больных сД-1 и у здоровых лиц
Генотип Здоровые лица (п = 71) Больные СД-1 (п = 50)
абс. % абс. %
CTLA4 49AA 25 35 13 26
CTLA4 49AG 36 51 17 34
CTLA4 49GG 10 14 20 40
Таблица 3
распределение генотипов HLA класса II в русской популяции (Москва) у больных сД-1 и у здоровых лиц
Генотип Здоровые лица (п = 71) Больные СД-1 (п = 50)
абс. % абс. %
NN* 52 73 10 20
NM** 17 24 22 44
ММ*** 2 3 18 36
Примечание. * - генотип, не содержащий ни одного из классических маркерных гаплотипов HLA (DRB1*04-DQA1*301-DQB1*302 и DRB1*17-DQA1*501-DQB1*201); ** - генотип, содержащий один из классических маркерных гаплотипов HLA; *** - генотип, содержащий оба классических маркерных гаплотипов HLA.
Результаты и обсуждение. При изучении распространения полиморфизма 49A/G гена CTLA4 (rs231775) были получены следующие данные (табл. 1, 2). Частота варианта А для здоровых лиц составила 60%, для больных СД-1 - 43%. Частота варианта G для здоровых лиц составила 40%, для пациентов с СД-1 - 57%. Полученные различия являются статистически достоверными (р < 0,01). Частота генотипа GG для здоровых лиц составила 14%, для больных СД-1 - 40% (различия статистически достоверны).
Хотя бы один из классических маркерных гаплотипов HLA (DRB1*04-DQA1*301-DQB1*302 и DRB1*17-DQA1*501-DQB1*201) был обнаружен у 80% пациентов с СД-1, в то время как лишь 27% здоровых лиц были носителями таких гаплотипов (различия статистически достоверны) (табл. 3).
Необходимо отметить следующее: ген CTLA4 был представлен генотипом 49GG у 7 из 10 больных СД-1, не несущих ни одного из классических маркерных га-плотипов HLA. В то же время генотип CTLA4 49GG выявлен лишь у 6 из 52 здоровых лиц, не несущих ни одного из таких гаплотипов. Полученные данные позволяют сделать предположение о независимой от системы HLA роли полиморфизма +49A/G гена CTLA4 в патогенезе СД-1. Генотип CTLA4 49GG был также обнаружен у 13 пациентов с СД-1, несущих маркерные гаплотипы HLA, т. е. в этих случаях мог наблю-
- 5 -
ИММУНОЛОГИЯ № 1, 2012
даться совместный диабетогенный эффект, впрочем, диабетогенный эффект CTLA4 мог маскироваться эффектом системы HLA.
По мнению авторов, необходимо проведение более масштабного исследования, предполагающего изучение большего количества генетических полиморфизмов, а также использование подхода, при котором установление индивидуального риска развития СД-1 рассматривается в зависимости от наличия «функционального» генотипа HLA-DRB1 [3].
Выводы. Хотя бы один из классических маркерных гаплотипов HLA (DRB1*04-DQA1*301-DQB1*302 и DRB1*17-DQA1*501-DQB1*201) был обнаружен у 40 (80%) из 50 больных СД-1 (московская популяция, дети). У 7 из оставшихся 10 пациентов с СД-1 выявлен генотип CTLA4 49GG, ассоциированный, по литературным данным, с развитием аутоиммунных заболеваний, в том числе с СД-1. С одной стороны, полученные данные позволяют сделать предположение о независимой от системы HLA роли CTLA4 в патогенезе СД-1, с другой - подтверждают ведущую роль системы HLA в формировании генетической предрасположенности к развитию СД-1.
ЛИТЕРАТУРА
1. Алексеев Л. П., Дедов И. И., Болдырева М. Н. и др. HLA-гены - маркеры инсулинзависимого сахарного диабета, этнические аспекты // Иммунология. - 2003. - № 5. - С. 308-311.
2. Балаболкин М. И., Дедов И. И. Генетические аспекты сахарного диабета // Сахар. диабет. - 2000. - № 1. - С. 2-5.
3. Болдырева М. Н., Хаитов P. M., Дедов И. И. и др. Новый взгляд на механизм HLA-ассоциированной предрасположенности к сахарному диабету 1 типа. Теоретические и практические аспекты // Иммунология. - 2005. - № 6. - С. 324-329.
4. Дедов И. И., Шестакова М. В. Сахарный диабет. - М., 2003.
5. Сергеев И. В., Хаитов М. Р., Трофимов Д. Ю. и др. Разра-
ботка методов для проведения широкомасштабных исследований полиморфизма генов, регулирующих различные компоненты иммунного ответа // Физиол. и патол. иммун. сист.
- 2009. - Т 13, № 4. - С. 21-25.
6. Хаитов P. M., Алексеев Л. П., Дедов И. И. и др. Использование достижений в области молекулярной иммуногенетики человека в клинике сахарного диабета 1-го типа // Вестн. РАМН. - 2008. - № 10. - С. 45-51.
7. Чистяков Д. А., Дедов И. И. Локусы генетической предрасположенности к диабету 1 типа IDDM3, IDDM4, IDDM5 // Сахар. диабет. - 2000. - № 1. - C. 52-53.
8. Chistiakov D. A., Savost’anov K. V., Nosikov V. V. CTLA4 gene polymorphisms are associated with, and linked to, insulin-dependent diabetes mellitus in a Russian population // BMC Genet. -2001. - Vol. 2, N 6. - P.
9. Davies J. L., Kawaguchi Y., Bennett S. T. et al. A genome-wide search for human type 1 diabetes susceptibility genes // Nature. -1994. - Vol. 371. - P. 130-136.
10. Guja C., Marshall S., Welsh K. et al. The study of CTLA-4 and vitamin D receptor polymorphisms in the Romanian type 1 diabetes population // J. Cell. Mol. Med. - 2002. - Vol. 6, N 1. -P. 75-81.
11. Kavvoura F. K., Ioannidis J. P. CTLA-4 gene polymorphisms and susceptibility to type 1 diabetes mellitus: a HuGE review and meta-analysis // Am. J. Epidemiol. - 2005. - Vol. 16, N 1. -P. 3-16.
12. Kristiansen O. P. NON-MHC genes in type 1 diabetes. Family-based associatin studies and functional studies of disease-associated polymirphism // Dan. med. Bull. - 2005. - Vol. 52.
- P. 186-233.
13. Krokowski M., Bodalski J., Bratek A. et al. CTLA-4 gene polymorphism is associated with predisposition to IDDM in a population from central Poland // Diabet. Metab. - 1998. - Vol. 24, N 3. - P. 241-243.
14. Nerup J., PlatzP., Svejgaard A. HLA antigens in diabetes mellitus // Lancet. - 1974. - Vol. 2. - P. 864-866.
15. Vafiadis P., Bennett S. T., Todd J. A. Insulin expression in human thymus is modulated by INS VNTR alleles at the IDDM2 locus // Nature Genet. - 1997. - Vol. 15. - P. 289-292.
Поступила 30.09.11
КЛЕТОЧНАЯ ИММУНОЛОГИЯ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012 УДК 612.112:94.063:612.481].08
В. Г. Артюхов, О. В. Путинцева, С. М. Дубова, С. М. Костенко
ИЗМЕНЕНИЕ УРОВНЯ ЭКСПРЕССИИ CD2-PE^nTOPOB Т-ЛИМФОЦИТАМИ
крови человека под действием уф-света
Кафедра биофизики и биотехнологии ГОУ ВПО Воронежский государственный университет (394006, г. Воронеж, Университетская пл., 1)
С помощью методов проточной цитофлюориметрии, твердофазного иммуноферментного анализа и люминесцентной микроскопии установлено, что после суточной инкубации УФ-облученных (151-906 Дж/м2) Т-лимфоцитов значения показателей экспрессии и интенсивность кэппинга СD2-рецепторов Т-клеток соответствуют величинам контрольных образцов. Показано, что УФ-излучение в дозе 1359 Дж/м2 индуцирует уменьшение уровня экспрессии CD2-маркеров Т-лимфоцитами на фоне усиления кэппинга данных молекул. Выявленные модификации экспрессии рецепторов не сопровождаются изменениями процентного содержания УФ-облученных (151-1359 Дж/м2) CD3+СD2+-лимфоцитов после их суточной инкубации.
Ключевые слова: СD2-рецеnтор, Т-лимфоциты, уровень экспрессии, УФ-излучение, кэппинг
- 6 -
