CC BY
34
Иммунология. 2018; 39(5-6)
DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0206-4952-2018-39-5-6-262-269 ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
ЦИТОКИНЫ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2018
Ригер НА.1, Евстратова В.С.1, Тимонин А.Н.1, Апрятин С.А.1, Гайнетдинов Р.Р.2, Гмошинский И.В.1
СРАВНЕНИЕ ЦИТОКИНОВОГО И АДИПОКИНОВОГО ПРОФИЛЯ КРЫС ЛИНИЙ DAT-KO(DAT-/-), WISTAR И ZUCKER (FA+/FA+) ПРИ ПОТРЕБЛЕНИИ РАЦИОНА С ВЫСОКИМ СОДЕРЖАНИЕМ ЖИРА И ФРУКТОЗЫ
1 ФГБУН «Федеральный исследовательский центр питания, биотехнологии и безопасности пищи», 109240, Москва, Россия;
2 Санкт-Петербургский государственный университет, 199034, Санкт-Петербург, Россия.
Ожирение ассоциируется с вялотекущим воспалением. Поскольку связь между обменными нарушениями и иммунитетом отражает взаимодействие лептина (Lep) и грелина (Ghr), а также участие Lep в дофаминэргической системе, проведено сравнение цитокинового и адипокинового профилей у крыс с нокаутом гена переносчика дофамина (DAT-KO), с мутацией fa в гене Lepr (ZF) и линии Wistar (W) при ожирении. 2 группы самцов каждой линии получали AIN93M или рацион с избытком фруктозы и жиров (ВУВЖР). Через месяц у W прижизненно забирали кровь. На 65-й день определяли массу тела, органов и жировой ткани, отделяли плазму. Для оценки продукции цитокинов клетки селезенки и жировой ткани (1х106/мл) культивировали 72 часа. Уровни цитокинов и адипокинов определяли на анализаторе Luminex. Показано, что у DAT-KO снижены уровни цитокинов, содержание Lep и соотношение L/Ghr. У ZF наблюдается достоверно повышенное содержание MCP-1, GRO/KC, Lep и высокое соотношение L/Ghr при меньшей концентрации IL-10 и IL-5 по сравнению с W. ВУВЖР вызывает достоверное повышение уровня Lep и соотношения L/Ghr у DAT-KO и ZF и способствует увеличению содержания MCP-1 и IL-10 в плазме ZF. У W отмечено лишь транзиторное возрастание MCP-1, IL-17, IL-10 и IL-5. Клетки селезенки и жировой ткани W и ZF обладают различной способностью к продукции IFN-g, IL-10 и IL-17A. ВУВЖР супрессирует продукцию цитокинов in vitro. Обнаружены достоверные корреляции между накоплением жира, соотношением L/Ghr, массой селезенки и уровнями MCP-1, GRO/ KC (положительная) и IL-5, IL-17A (отрицательная). Проведенные исследования демонстрируют взаимосвязь до-фаминэргической системы и лептин-сигнального пути в регуляции обмена, а также подтверждают биомаркерную значимость соотношения L/Ghr в формировании метаболических и иммунорегуляторных нарушений при ожирении.
Ключевые слова: ожирение; цитокины; лептин; грелин; дофамин.
Для цитирования: РигерН.А., Евстратова В.С., Тимонин А.Н., Апрятин С.А., ГайнетдиновР.Р., Гмошинский И.В. Сравнение цитокинового и адипокинового профиля крыс линий DAT-KO(DAT-/-), WISTAR и ZUCKER (fa+/fa+) при потреблении рациона с высоким содержанием жира и фруктозы. Иммунология. 2018; 39(5-6): 262-269. DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0206-4952-2018-39-5-6-262-269
Riger N.A.1, Evstratova V.S.1, Timonin A.N.1, Apryatin S.A.1, Gainetdinov R.R.2, Gmoshinski I.V.1
COMPARISON OF CITOKINE AND ADIPOKINE PROFILES IN DAT-KO (DAT - / -), WISTAR AND ZUCKER (FA + / FA +) RATS FED BY A RATION WITH HIGH FAT AND FRUCTOSE CONTAINMENT
1 Federal Research Center of Nutrition and Biotechnology, 109240, Moscow, Russia;
2 St Petersburg State University, 199034, St. Petersburg, Russia
Obesity is associated with a sluggish inflammation. Since the close relationship between immunity and metabolic disturbances reflects the interaction of leptin (Lep) and ghrelin (Ghr), and involvement of Lep in dopaminergic system, the aim of this study were to compare the cytokine profile in DAT-KO rats with a knockout of the dopamine transporter gene (DAT), in Zucker (ZF) rats with mutation fa in the Lep receptor gene Lepr and the outbred rats of Wistar (W) line in obesity. Two groups of male rats of each line received a diet according to AIN93M, or a diet with an excess of fats and fructose (HFCR). On the 30th day, W rats were bled from the tail vein. On the 65th day, the weights of body, organs and adipose tissue of the animals were determined, and the blood plasma was collected. Cells from spleen and adipose tissue were cultured for 72 hours 1106 cells/ml for cytokine production in vitro. Cytokine and adipokine levels were determined on a Luminex 200 analyzer using Bio-Plex kits. Cytokine levels, Lep content and L/Ghr ratio were lowered in DAT-KO rats. In ZF MCP-1, GRO/RC, Lep and L/Ghr ratio were significantly elevated, which was accompanied by lower concentrations of IL-10 and IL-5 in comparison to W. HFCR produced significant increase of Lep and L/Ghr ratio in DAT-KO and ZF and promoted rise in MCP-1 and IL-10 in ZF. Only transitory elevation of MCP-1, IL-17, IL-10 and IL-5 was noticed in W. Spleen and fatty tissue cells W and ZF have different ability for production of IFN-a, IL-10 and IL-17A. HFCR had a suppressor effect on the production of cytokines in vitro. Reliable correlations were found between the mass of fat, the L/Ghr ratio, the spleen mass and the levels of MCP-1, GRO / KC (positive) and IL-5, IL-17A (negative). Hereby the interrelation was demonstrate of the dopaminergic system and the signaling pathway of leptin/leptin receptor in the regulation of metabolism, and the biomarker significance was confirmed of the L/Ghr ratio in the formation of metabolic and immunoregulatory disorders in obesity.
Keywords: obesity; cytokines; leptin; ghrelin; dopamine.
Для корреспонденции: Ригер Николай Александрович, д-р мед. наук, старший научный сотрудник лаборатории иммунологии ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии», E-mail: rieger_63@mail.ru
ORIGINAL ARTICLE
For citation: Riger N.A., Evstratova V.S., Timonin A.N., Apryatin S.A., Gainetdinov R.R., Gmoshinski I. V. Comparison of citokine
and adipokine profiles in DAT-KO (DAT - / -), Wistar and Zucker (fa + /fa +) rats fed by a ration with high fat and
fructose containment. Immunologiya. 2018; 39(5-6): 262-269. DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0206-4952-2018-39-5-6-262-269
For correspondence: NikolayA. Rieger, Dr. Sci. Med., senior researcher of the department of immunology Federal Research Center of Nutrition and Biotechnology, E-mail: rieger_63@mail.ru Information about authors:
Riger N.A., http://orcid.org/0000-0001-7149-2485 Evstratova V.S., http://orcid.org/0000-0003-3732-8547 Timonin A.N., http://orcid.org/0000-0001-6087-6918 Apryatin S.A., http://orcid.org/0000-0002-6543-7495 Gainetdinov R.R., http://orcid.org/0000-0003-2951-6038 Gmoshinski I.V., http://orcid.org/0000-0002-3671-6508
conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Acknowledgments. The work was supported by the grant of the Russian science Foundation № 17-16-01043 "search for effector links of metabolism, regulated by alimentary factors in obesity, for the development of innovative specialized foods".
Received 02.07.18 Accepted 16.08.18
Ожирение рассматривается в настоящее время как комплексный патологический процесс, сопровождающийся дис-липидемией, инсулинрезистентность и гипергликемией [1]. Осложнения ожирения, кроме метаболических расстройств, включают повышенную восприимчивость к инфекциям и аутоиммунные заболевания. Хронический воспалительный процесс является важнейшим патогенетическим фактором развития инсулинорезистентности, а формирующийся при этом иммунодефицит рассматривается, как одна из ведущих причин осложнений центрального ожирения [2, 3]. Результатом этого становится избыточная миграция и накопление макрофагов в жировой ткани, увеличение количества Th1- и CD8+-клеток, уменьшение №2-клеток и Treg-лимфоцитов. Нарушения при прогрессирующем ожирении клеточного иммунитета приводят к количественным и качественным изменениям в продукции цитокинов и адипокинов [3, 4] и способствуют дальнейшему прогрессированию метаболического синдрома [5-6].
В настоящее время обнаружено большое количество клеточных и молекулярных факторов, отражающих взаимную связь между метаболизмом, иммунитетом и обменными нарушениями при ожирении [2, 4]. Важная роль в регуляции насыщения и энергетического баланса принадлежит нейронам дугообразных ядер гипоталамуса, экспрессирующим нейропептид Y (NPY). Грелин (Ghr) активирует экспрессию NPY в гипоталамусе и стимулирует аппетит. Лептин (Lep) супрессирует индуцированную Ghr экспрессию NPY и вызывает чувство насыщения [7]. При этом Lep, в зависимости от выраженности экспрессии специфических рецепторов (Ob-Rb) в различных регионах головного мозга, включая ядра гипоталамуса, среднего мозга и ствола мозга, оказывает также влияние на мезолимбическую дофаминовую систему. Воздействуя на активность мембранного транспортера дофамина (DAT), осуществляющего выведение этого мессенджера из синапсов нейронов [8-9], Lep может участвовать не только в энергетическом балансе за счёт регуляции орексии, но и в локомоторной активности. И наоборот, дофаминэргические механизмы за счёт взаимодействия с лептиновой системой могут быть вовлечены в регуляцию аппетита [10].
Механизмы взаимодействия Lep и Ghr в регуляции чувства голода, расхода энергии и развития иммунодефицита при ожирении остаются малоизученными. Было отмечено, что увеличение соотношения Lep к Ghr (L/Ghr) является предвестником потери эффективности программ по снижению общего веса у мужчин и женщин с ожирением и свидетельствует о тенденции к последующему росту массы тела [11]. Поскольку одним из основных регионов антагонизма Lep и
Ghr являются отделы мезолимбической системы, представляет интерес сравнение последствий этих взаимодействий у животных с нарушениями в дофаминэргической системе с моделями, характеризующимися нарушениями в лептин/ лептин-рецептор сигнальном пути.
Крысы линии DAT-KO с нокаутом гена, кодирующего мембранный транспортер дофамина (DAT), развиваются нормально, но плохо прибавляют в массе по сравнению с диким типом и проявляют спонтанную повышенную двигательную активность [8-9,12]. В качестве модели генетически детерминированного ожирения часто используется линия крыс Zucker (ZF), гомозиготных по рецессивной мутации fa в гене Lepr, кодирующем рецептор Lep [13]. Поскольку одним из основных регионов антагонизма Lep и Ghr являются структуры мезолимбического отдела, а также возможное участие Lep в дофаминэргической системе, целью настоящей работы были сравнение цитокинового профиля у крыс линий DAT-KO, ZF и аутбредной линии Wistar (W) и поиск корреляционной зависимости между концентрациями Lep и грелина в плазме с изменениями общей массы, а также с цитокиновым профилем в плазме при спонтанном и индуцированном высокожировым и высокоуглеводным рационом ожирении.
Материал и методы
Исследования проводили на 7 самцах гомозиготных крыс DAT-KO, полученных из вивария Института трансляционной биомедицины СпбГУ (г Санкт-Петербург), 12 самцах крыс W, полученных из питомника Филиала «Столбовая» ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий ФМБА России» и 12 самцах крыс ZF, полученных из питомника «Charles River» (Италия). Возраст всех крыс в начале эксперимента составлял 8-10 недель. Работу с животными выполняли в соответствии с Приказом Министерства здравоохранения Российской Федерации № 199 н от 01.04.2016 г «Об утверждении правил надлежащей лабораторной практики». Дизайн эксперимента был одобрен Комитетом по этике ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» (протокол № 4 от 20.04.17 г.). В начале исследования крысы были разделены на 6 групп. В течение 65 дней животные 1-й (DAT-KO -/-, n = 3), 3-й (W, n = 6) и 5-й (ZF, n = 6) групп получали контрольный сбалансированный рацион по AIN93M, а 2-й (DAT-KO -/-, n = 4), 4-й (W, n = 6) и 6-й (ZF, n = 6) групп - высокожировой рацион, содержащий 30% жиров по сухой массе, и 20% раствор фруктозы вместо питьевой воды (ВУВЖР). Рацион и питьевую жидкость представляли животным в режиме неограниченного свободного доступа.
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
0,001
0,0001
У животных 3-й и 4-й групп на 30-й день эксперимента выполнен прижизненный забор крови из вены хвоста в объеме 100 мкл в пластиковые микропробирки, предварительно обработанные К3-ЭДТА. Кровь центрифугировали при 3000 об/мин в течение 30 минут. Плазму крови хранили до анализа при -24 оС.
Выведение животных из эксперимента осуществляли на 65-е сутки путём декапитации под эфирной анестезией. Массу органов, забрюшинной и бурой жировой ткани определяли на лабораторных весах с точностью ± 0,01 г Кровь собирали в пробирки с антикоагулянтом 1,0 % раствором гепарина в 0,15 М NaCl (1:10 по объёму), плазму отделяли центрифугированием.
Для оценки спонтанной и индуцированной кон-канавалином А (ConA) продукции цитокинов in vitro клетки из селезенки животных выделяли по методике [14]. Клеточную взвесь культивировали 72 ч в атмосфере, содержащей 5 % СО2, при 37 оС и 96 % влажности из расчета Ы06 клеток/мл в стерильных 96-луночных планшетах (SPL Life Sciences Co., Корея) в полной среде RPMI 1640 (ПанЭко, Россия), содержащей 10 % эмбриональной телячьей сыворотки (Biosera, Франция), в присутствии 50 мкг/мл стрептомицина и 50 Ед/мл пенициллина (ПанЭко, Россия). Для оценки стимулированной продукции цитокинов добавляли Con A (ПанЭко, Россия) в концентрации 5мкг/мл. Клетки из белой жировой клетчатки выделяли согласно [15]. После удаления зрелых адипоци-тов полученную клеточную взвесь культивировали 72 ч в условиях, идентичных применявшимся для клеток селезенки. Супернатанты собирали в стерильные пластиковые пробирки и хранили при -24 оС.
Для определения уровня цитокинов (MCP-1, GM-CSF, GRO/KC, IL-10, IL-17A, IL-5, IFN-g) и адипо-кинов (Lep и Ghr) использовали коммерческий набор Bio-Plex Reagent Kit, 1 x 96-well, дополняемый реагентами: Pro-Rat 33-Plex Standarts, Rat Diabetes Ghre-lin SET, Rat Diabetes Leptin SET, Bio-Plex Pro™ Rat Cytokine MCP-1 Set, Bio-Plex Pro™ Rat Cytokine GM-CSF Set, Bio-Plex Pro™ Rat Cytokine GRO/KC Set, Bio-Plex Pro™ Rat Cytokine IL-10 Set, Bio-Plex Pro™ Rat Cytokine IL-17A Set, Bio-Plex Pro™ Rat Cytokine IL-5 Set, Bio-Plex Pro™ Rat Cytokine IFN-g Set - все производства фирмы Bio-Rad Laboratories, Inc. (США). Исследования проводили на мультиплексном анализаторе Luminex 200 (Luminex Corporation, США) по технологии xMAP с использованием программного обеспечения Luminex xPONENT Version 3.1.
Статистическую обработку полученных данных (определение среднего, стандартного отклонения, медианы, интервалов изменения величин) и корреляционный анализ по Спирмену выполняли с помощью пакета программ SPSS 20.0. Достоверность различия эмпирической функции распределения в группах животных оценивали с помощью непараметрического рангового критерия Манна-Уитни. Пороговое значение вероятности отклонения нуль-гипотезы было принято равным p < 0,05. Доверительный интервал для полученных коэффициентов корреляции (r) принимался для а < 0,05.
результаты исследования
Содержание цитокинов и адипокинов в контрольных группах
Как следует из данных, представленных на рис. 1, при сравнении уровней MCP-1, GM-CSF, GRO/KC, IL-10, IL-17A, IL-5 и Ghr в плазме крыс контрольных групп не было выявлено достоверных различий между линиями DAT-KO и W; медианы MCP-1, GM-CSF, IL-17A, IL-5, Lep (достоверно p < 0,05), Ghr и соотношения L/Ghr (достоверно, p < 0,05) были выше у W
Рис. 1. Уровень цитокинов, лептина, грелина и соотношения L/Ghr в плазме контрольных групп крыс.
По оси Y - уровень цитокинов и адипокинов pg/ml, медиана±интервалы изменения (логарифмический масштаб);
Группа 1 - крысы нокаутной линии DAT-KO, самцы, п/с рацион 10 % жира вода; группа 3 - крысы аутбредные Wistar, самцы, п/с рацион 10 % жира вода; группа 5 - крысы Zucker, самцы, п/с рацион 10 % жира вода. # - p < 0,05 - между группами 1 и 3; * - p < 0,05 - между группами 3 и 5.
Здесь и на рис. 2 - 6: MCP-1 - моноцитарный хемотоксический фактор 1; GM-CSF - гранулоцитарно-моноцитарный колониестимулирующий фактор; GRO/KC - CXCL-1 хемокин; IL-10 - интерлейкин 10; IL-17A - интерлейкин 17A; IL-5 - ин-терлейкин 5; IFN-g- - интерферон гамма; Leptin - лептин; Ghrelin - грелин; L/G -отношение Leptin/Ghrelin (безразмерное).
в сравнении с DAT-KO. Уровни MCP-1, GRO/KC, IL-10, IL-5, Lep и соотношение Lep к Ghr (L/Ghr) достоверно (p<0,05) различались у крыс W в сравнении с ZF, при этом содержание MCP-1 и GRO/KC было больше у ZF, а IL-10 и IL-5 - у W.
Влияние экспериментальных рационов на содержание цитокинов и адипокинов
Через 1 мес кормления экспериментальным рационом было исследовано содержание цитокинов и адипокинов в плазме крови крыс W. При этом обнаружены различия содержания MCP-1, GM-CSF, GRO/KC, IL-10, IL-17A, IL-5, Lep и Ghr в крови животных, потреблявших ВУВЖР, по сравнению с контролем (рис. 2, а). Уровни MCP-1, IL-10, IL-17A и IL-5 достоверно увеличивались на фоне ВУВЖР. Кроме того, прослеживалась тенденция к возрастанию Lep и Ghr, а также соотношения L/Ghr.
По окончанию эксперимента в плазме крыс линий DAT-KO и W между контролем и опытными группами, получавшими ВУВЖР, статистически достоверных изменений уровней MCP-1, GM-CSF, GRO/KC, IL-10, IL-17A, IL-5, Ghr выявлено не было (рис. 2, б, в). При этом в опытной группе у крыс линии DAT-KO наблюдались достоверно более высокий уровень Lep и отношение L/Ghr, а также тенденция к увеличению GM-CSF, IL-17A, IL-5 и Lep. У W опытной группы прирост содержания Lep был статистически недостоверным. У крыс линии ZF в сравнении с контрольной группой на фоне ВУВЖР (рис. 2, г) увеличилось содержание в плазме MCP-1, IL-10 и Lep, а также значимо возросло соотношение L/Ghr.
Корреляционная зависимость между соотношением леп-тин/грелин и уровнями цитокинов
Как следует из данных рис. 3-5, выявлены достоверные корреляционные связи между соотношением L/Ghr, массой селезенки животных и концентрациями ряда цитокинов в
ORIGINAL ARTICLE
1000 100 10 1 0,1 0,01 0,001 0,0001
Группа 3 ■ Группа 4
У"'1-'"'1'
4VV«* 4VV1N* vé* Ф
0,01
Группа 3 ■ Группа 4
^ «A* 4VV1N* ^ çgp MO
Группа 1 ■ Группа 2
0,001
0,0001
^e^&S^ frV« »» ^ ^ Vltf
1000 100 10
0,1 0,01 0,001 0,0001
Группа 3 ■ Группа 4
tft* && cepnst 4VV1N ^ Qgt» VlG*
Рис. 2. Влияние ВУВЖД на содержание цитокинов и адипокинов.
По оси Y - уровень цитокинов и адипокинов р§/т1; а - содержание цитокинов и адипокинов у W через 1 месяц (прижизненно); б - содержание цитокинов и адипокинов у Wistar по окончанию эксперимента; в - содержание цитокинов и адипокинов у DAT-KO по окончанию эксперимента; г - содержание цитокинов и адипокинов у ZF по окончанию эксперимента; Группа 1 - крысы нокаутной линии БАТ-КО, п/с рацион 10 % жира вода; группа 2 - крысы нокаутной линии DAT-KO, эффект ВУВЖД; группа 3 - крысы аутбредные W, п/с рацион 10 % жира вода; группа 4 - крысы аутбредные W, эффект ВУВЖД; группа 5 - крысы ZF, п/с рацион 10% жира вода; группа 6 - крысы ZF, эффект ВУВЖД. * - p < 0,05 - между контрольными и опытными группами. - отношение Leptin/Ghre1in в относительных единицах.
10
10
плазме. Коэффициенты корреляции с отрицательным значениями между уровнями Lep в плазме и соотношением L/Ghr с массой селезенки составили 0,39 и 0,36 соответственно (a < 0,05). Кроме того, изменения уровня Lep, соотношения L/Ghr и динамика накопления белой жировой ткани на фоне ВЖВУР положительно коррелировали с MCP-1, GM-CSF и GRO/KC (рис. 3-4). Напротив, была выявлена отрицательная взаимосвязь между изменениями массы селезенки и динамикой в плазме MCP-1, GRO/KC (рис. 5, а, б) и положительная -с IL-17A и IL-5 (рис. 5, в, г).
Исследование уровней цитокинов в культурах клеток из селезенки и белой жировой ткани.
Способность к спонтанной продукции IFN-g, IL-10 и IL-17A клеток из селезенки и жировой ткани у крыс W контрольной группы была больше по сравнению с ZF (рис. 6, a). При этом у W уровень IFN-g был достоверно выше в культурах клеток селезенки, а IL-10 и IL-17A - в жировой ткани. Использование ВУВЖР оказывало отрицательное влияние на спонтанную продукцию цитокинов in vitro (рис. 6, a). У крыс W достоверно уменьшилась продукция IL-10 и IL-17A в культурах клеток жировой ткани, а у крыс ZF снизился уровень IFN-g и достоверно уменьшилось содержание IL-17A в супернатантах клеток селезенки.
Исследования продукции цитокинов в условиях митоген-ной стимуляции (ConA) показали способность клеток селезенки от животных обеих линий увеличивать синтез IFN-g
и ГЬ-10. При этом, повышение продукции было досто-
верно большим в культурах, полученных от ¿Г по сравнению с М, а способность к продукции ГЬ-10 возрастала в обеих группах приблизительно в равной степени. Стимулирующее влияние СопА на продукцию ГЬ-17А наблюдалось только на клетках селезенки от крыс М, тогда как у ¿Г стимуляция практически отсутствовала, p<0,05 (рис. 6, б).
Обсуждение результатов
Ожирение ассоциируется с хроническим, вялотекущим воспалением, первичные причины которого остаются до настоящего времени недостаточно понятными. Локальное воспаление в белой жировой ткани и системные воспалительные реакции во многом зависят от степени выраженности висцерального ожирения, дислипидемии и инсулинорезистентности, а также от физической активности [4, 16, 17]. Проведённая в нашей работе оценка цитокинового и адипокинового профиля в контрольных группах трёх линий крыс (см. рис. 1) выявила увеличение уровня провоспалительных цитокинов в плазме у ¿Г, набравших на стандартном рационе наибольшую массу и демонстрирующих при этом значимо более высокие уровни МСР-1, GRO/KC и Ьер, а также соотношения ЬЮЬ по сравнению с М и БАТ-КО. Напротив, уровни ГЬ-10 и ГЬ-5, отрицательно регулирующие процессы воспаления в жировой ткани, были выше в контрольных группах крыс БАТ-КО и М набравших меньшую массу во время эксперимента и демонстрирующих достаточно низкие
Рис. 3. Регрессионная зависимость между соотношеним L/G и цитокинами.
По оси Y - соотношение L/G в относительных единицах; по оси X: a — уровень MCP-1 (pg/ml); б — уровень GRO/KC (pg/ml).
R[= О J4J7
I -1-г-1-1
И HI 2D 3D JO
Рис. 4. Регрессионная зависимость между накоплением жировой массы и цитокинами.
По оси Y - забрюшинная жировая масса (г); по оси X: а - уровень MCP-1 (pg/ml); б - уровень GRO/KC (pg/ml).
показатели Lep и соотношения L/Gh по сравнению с ZF. При этом наблюдаемые достоверные корреляции уровня Lep, соотношения L/Gh и массы забрюшинной жировой ткани с MCP-1, GM-CSF и GRO/KC, а также отрицательные - с размерами селезенки, IL-5 и IL-17A (см. рис. 3-5) могут свидетельствовать об активной миграции и накоплении макрофагов в жировой ткани, увеличении количества Th1- и CD8+-клеток и повышенной экспрессии провоспалительных цитокинов при спонтанном и индуцированном ВЖВУР ожирении [3, 17]. Описанные изменения характерны, в первую очередь, для ZF.
У крыс ZF Lep, синтезируемый в избыточном количестве, особенно на фоне ВУВЖР (рис^), не оказывает супрессорно-го влияния на экспрессию NPY нейронами дугообразных ядер гипоталамуса, вследствие чего такие животные отличаются повышенным аппетитом, низкой физической активностью и накоплением избыточной жировой массы даже при нормальном рационе. Использование ВЖВУР вызывает у ZF ещё большее увеличение уровня провоспалительных факторов, способствующих миграции моноцитарно-макрофагальных клеток в очаги воспаления. При этом, увеличение количества жировых отложений у крыс линий ZF и ZDF (крысы Zucker, склонные к спонтанному развитию диабета) ведет к нарастанию общего количества CDl lb-макрофагов в жировой ткани и генерализа-
ции воспаления [17], что вызывает ещё большее повышение уровня провоспалительных цитокинов и хемокинов.
Соотношение L/Gh и общее количество забрюшинной белой жировой ткани при выведении из эксперимента положительно коррелировали с уровнями МСР-1, GM-CSF и GRO/ KC (см. рис. 4). Эти хемокины вовлечены в регуляцию созревания и функциональной активности адипоцитов, воспаления в жировой ткани с исходом в фиброз. Формирование фиброзных изменений происходит на фоне повышенного отложения коллагеновых волокон I и III типов и вовлечением в этот процесс IL-10 and MMP2 [18]. Наблюдаемые разнонаправленные корреляции содержания Lep с белой жировой массой, весом селезенки и уровнями цитокинов (см. рис. 4-5) обусловлены иммунотропным влиянием этого адипокина. Известно, что макромолекула Lep содержит две пары альфа-спиралей, расположенных под углом друг к другу. Эти домены обладают большим сходством с участками альфа-спиралей длинных цепей цитокинов и хемокинов различных групп [19-20].
Функционально активная форма рецептора Lep (Ob-Rb), член класса I суперсемейства цитокиновых рецепторов, экс-прессируется не только в нейронах ядер гипоталамуса, но и на клетках иммунной системы и гемопоэтический ткани. Взаимодействие Lep с Ob-Rb приводит к активации JAK2-STAT3,
Рис. 5. Регрессионная зависимость между весом селезенки и цитокинами.
По оси Y - вес селезенки (г); по оси X: а - уровень MCP-1 (pg/ml); б - уровень GRO/KC (pg/ml); в - уровень IL-5 (pg/ml); г - уровень IL-17 (pg/ml).
MAPK, and PI3K-AKT внутриклеточных сигнальных путей. Поэтому, наравне с участием в энергетическом обмене, Lep вовлечён в дифференцировку, пролиферацию, активацию и регуляцию функций клеток иммунной системы [21-24].
Крысы DAT-KO с нокаутом гена, кодирующего мембранный транспортер дофамина DAT, проявляют индуцированную дофамином повышенную двигательную активность [8] что вероятно, является одной из основных причин низких прибавок массы тела по сравнению с W и ZF. Это сочетается с низкими (особенно в сравнении с ZF) уровнем Lep и соотношением L/Gh (см. рис. 1). Lep при физиологическом состоянии ограничивает аппетит и объём принимаемой пищи, которые контролируются, в том числе, дофаминовой мезолимбической системой, которая, в свою очередь, находится под влиянием лептиновых Ob-Rb рецепторов, в зависимости от выраженности их экспрессии в различных регионах головного мозга, включая ядра гипоталамуса, среднего мозга и ствола мозга [8-9, 12].
У крыс W и ZF при накоплении жировой ткани на фоне
увеличения уровня хемокинов может прослеживаться рост экспрессии IL-10 (см. рис. 2), регулирующего процесс ограничения фиброзных изменений в органах при ожирении. Напротив, у DAT-KO динамики уровней IL-10 под действием применяемого рациона не наблюдалось. Возможно, эти же механизмы вовлечены в синтез цитокинов in vitro, а различия между W и ZF (см. рис. 6) обусловлены, в первую очередь, нарушениями взаимодействия Lep и Ob-Rb у последних. Было неоднократно отмечено, что при ожирении снижается уровень IL-10, и это способствует поддержанию воспаления и формирования фиброза в жировой ткани и печени. Регуля-торное влияние IL-10 ограничивает механизмы развития фиброза, особенно в печени. Ожирение и избыток Lep негативно регулируют активность Treg лимфоцитов и способствуют понижению экспрессии IL-10 в селезенке [23].
Рост уровня IL-10 и тенденции к снижению IL-5 и IL-17A у Zucker на фоне значительного возрастания продукции Lep также вызваны регуляторными нарушениями лептиновых
Иммунология. 2018; 39(5-6)
DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0206-4952-2018-39-5-6-262-269 ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
Рис. 6. Спонтанный и митогениндуцированный синтез 1КЫ-у, ГЬ-10 и 1Ь-17А в культурах клеток из селезенки и белой жировой ткани.
а - спонтанный синтез; по оси Y - уровень цитокинов pg/m1; * - p < 0,05 в контроле между Wistar и ¿Г; **- p < 0,05 между контрольными и опытными; б - митоген-индуцированный синтез; по оси Y - отношение индуцированный/спонтанный синтез (и/с) в относительных единицах, 1 -спонтанный синтез; * -p < 0,05 различия в отношении и/с между Wistar и ¿Г; Группа 3 -крысы аутбредные М, п/с рацион 10 % жира вода; группа 4 - крысы аутбредные М, эффект ВУВЖД; группа 5 - крысы ¿Г, п/с рацион 10 % жира вода; группа 6 - крысы ¿Г, эффект ВУВЖД. группами.
сигнальных путей. Lep положительно регулирует экспрессию IL-17. Важная роль в регуляции синтеза IL-17 отводится Src/ PI3K/Akt сигнальному пути, активация которого в клетках происходит в результате взаимодействия Lep с Ob-Rb [24]. Отсутствие у ZF взаимодействия Lep с Ob-Rb приводит к нарушениям в активации JAK2-STAT3, MAPK, и PI3K-AKT путей и дизрегуляции экспрессии исследованных цитокинов [25]. Lep способствует миграции, в первую очередь моноцитов/макрофагов, увеличению и активации в жировой ткани Th1- и CD8+-клеток. Однако его влияние на пролиферацию, выжи-
ваемость и цитокиновую продукцию Th2-клеток и Treg-лимфоцитов при ожирении оказалось неоднозначным [26]. На фоне ожирения Lep может, как редуцировать продукцию ТЬ2-цигокинов за счёт активации Thl-иммунного ответа, так и потенцировать гиперчувствительность, активируя вышеперечисленные сигнальные пути. У грызунов с дефектом гена Lep (ob-/ob-) ослаблены аллергические проявления за счет снижения пролиферации и цитокино-вой экспрессии ТЬ2-клеток [27-29].
В противоположность ZF, при меньшей жировой массе у DAT-KO наблюдается тенденция к снижению уровня хемокинов, IL-10 и - увеличение в плазме цитокинов иного спектра: GM-CSF, IL-5, IL-17 (см. рис. 1-2), регулирующих миграцию клеток крови и воспалительные изменения в мышечной ткани на фоне избыточной локомоторной активности [30-31]. Нарастание на фоне ВЖВУД уровня Lep и L/Gh может быть также обусловлено нарушениями взаимодействия лептиновой и допаминэр-гической систем [10].
In vitro на фоне ВЖВУД отмечена разная степень снижения экспрессии IFN-y, IL-10 и IL-17 (см. рис. 6). Однако супрес-сорный эффект избытка Lep при ожирении на продукцию цитокинов может быть отменен неспецифической стимуляцией Treg- и Вreg- резидентных клеток в жировой ткани и селезенке, что проявляется увеличением продукции IFN-y, IL-10 и IL-17 в присутствии ConA. Соответственно, у ZF при нарушениях в активации Ob-Rb может быть ограниченной активация разных внутриклеточных сигнальных путей и не отмечается роста IL-17A. Причём ConA не оказывает значимого стимулирующего эффекта на продукцию IL-17A клетками селезенки крыс линии ZF по сравнению с W [13, 20, 24].
К иммунотропным эффектам Lep на фоне ожирения также можно отнести и рост уровней IL-5, IL-10, IL-17A и МСР-1 при прижизненном исследовании у крыс W через 1 мес после начала эксперимента на фоне ВУВЖР (см. рис. 2, б). Эти изменения сопровождались тенденцией к повышению концентраций Lep и Ghr и резким увеличением соотношения L/Gh. Однако при нормальном генотипе и отсутствии нарушений в лептин/лептин-рецептор сигнальном пути может происходить ограничение воспалительных и фиброзных изменений на фоне роста экспрессии IL-10 и переключения Th1- на №2-цитокиновую _ продукцию. Это является одним из механизмов обострения аллергических реакции при алиментарном ожирении [29].
Выводы
Нарушение транспорта дофамина у крыс линии DAT-KO сочетается со сниженными уровнями цитокинов и достоверно низким содержанием Lep и соотношением L/Gh. Напротив, у линии ZF наблюдается достоверно повышенное содержание в крови MCP-1, GRO/KC, Lep и соотношение L/ Gh при меньшей концентрации IL-10 и IL-5 по сравнению с диким типом (W).
а
Потребление ВУВЖР не оказывает значимого влияния на цитокиновый профиль у DAT-KO и W, вызывает достоверное повышение уровня Lep и соотношения L/Gh у DAT-KO и ZF и способствует увеличению содержания MCP-1 и IL-10 в плазме ZF. У W было отмечено лишь транзиторное возрастание уровней MCP-1, IL-17A, IL-10 и IL-5 по сравнению с контрольной группой.
Клетки селезенки и жировой ткани W и ZF in vitro обладают различной способностью к спонтанной и митогениндуци-рованной продукции IFN-g, IL-10 и IL-17A. ВУВЖР супрес-сирует продукцию цитокинов у животных обеих линий.
Выявленные между линиями различия подтверждаются достоверными корреляциями между массой жировых отложений у животных, соотношением L/Gh и уровнями MCP-1, GRO/KC, IL-5, IL-17A.
Проведённые исследования демонстрируют взаимосвязь дофаминэргической системы и лептин/лептин-рецептор сигнального пути, а также биомаркерную значимость соотношения L/Gh в формировании метаболических и иммуно-регуляторных нарушений у самцов крыс на моделях индуцированного и генетически обусловленного ожирения.
Финансирование. Работа выполнена при поддержке гранта Российского Научного фонда № 17-16-01043 «Поиск эффекторных звеньев метаболизма, регулируемых алиментарными факторами при ожирении, для разработки инновационных специализированных пищевых продуктов».
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
ЛИТЕРАТУРА (REFERENCES)
1. Srikanthan K., Feyh A., Visweshwar H., Shapiro J.I., Sodhi K. Systematic Review of Metabolic Syndrome Biomarkers: A Panel for Early Detection, Management, and Risk Stratification in the West Virginian Population. Int. J. Med. Sci.2016; 13(1): 25-38. doi: 10.7150/ijms.13800.
2. Ouchi N., Parker J.L., Lugus J.J., Walsh K. Adipokines in inflammation and metabolic disease, Nature reviews. Immunology. 2011; 11(2): 85-97. PubMed: 21252989.
3. Lumeng C.N., Saltiel A.R. Inflammatory links between obesity and metabolic disease. J. Clin. Invest. 2011; 121(6): 2111-7.
4. Lee B.C., Lee J. Cellular and molecular players in adipose tissue inflammation in the development of obesity-induced insulin resistance. BiochimBiophysActa. 2014; 1842(3): 446-62. doi: 10.1016/j. bbadis.2013.05.017.
5. Ryo M., Nakamura T., Kihara S., Kumada M., Shibazaki S., Taka-hashi M., et al. Adiponectin as a biomarker of the metabolic syndrome. Circulation journal: official journal of the Japanese Circulation Society. 2004; 68(11): 975-81.
6. Deng Y., Scherer P.E. Adipokines as novel biomarkers and regulators of the metabolic syndrome. Ann. N. Y. Acad. Sci. 2010; 1212: E1-E19. doi: 10.1111/j.1749-6632.2010.05875.x.
7. Kohno D., Nakata M., Maekawa F., Fujiwara K., Maejima Y., Kuramochi M., et al. Leptin Suppresses Ghrelin-Induced Activation of Neuropeptide Y Neurons in the Arcuate Nucleus via Phosphati-dylinositol 3-Kinase- and Phosphodiesterase 3-Mediated Pathway. Endocrinology. 2007; 148(5): 2251-63. https://academic.oup.com/ endo/article-lookup/doi/10.1210/en.2006-1240.
8. Efimova E.V., Gainetdinov R.R., Budygin E.A., Sotnikova T.D. Dop-amine transporter mutant animals: a translational perspective. J. Neurogenet. 2016; 30(1): 5-15. doi: 10.3109/01677063.2016.1144751.
9. Cinque S., Zoratto F., Poleggi A., Leo D., CernigliaL., Cimino S., et al. Behavioral phenotyping of dopamine transporter knockout rats: compulsive traits, motor stereotypies, and anhedonia. Front. Psychiatry. 2018; 9(43): 1-13. doi: 10.3389/fpsyt.2018.00043. eCollection 2018.
10. Perry M.L., Leinninger G.M., Chen R., Luderman K.D., Yang H., Gn-egy M.E., et al. Leptin promotes dopamine transporter and tyrosine hydroxylase activity in the nucleus accumbens of Sprague-Dawley rats. J. Neurochem. 2010; 114(3):666-74. doi: 10.1111/j.1471-4159 .2010.06757.x.
11. Williams R.L., Wood L.G., Collins C.E., Morgan P. J., Callister R. Energy homeostasis and appetite regulating hormones as predictors of weight loss in men and women. Appetite. 2016; 101: 1-7. doi: 10.1016/j.appet.2016.02.153.
ORIGINAL ARTICLE
12. Leo D., Sukhanov I., Zoratto F., Illiano P., Caffino L., Sanna F., et al. Pronounced Hyperactivity, Cognitive Dysfunctions, and BDNF Dys-regulation in Dopamine Transporter Knock-out Rats. J. Neurosci. 2018; 38(8): 1959-72. doi: 10.1523/JNEUROSCI.1931-17.2018.
13. Wang B., Chandrasekera P.C., Pippin J.J. Leptin- and Leptin Receptor-Deficient Rodent Models: Relevance for Human Type 2 Diabetes. Curr Diabetes Rev. 2014; 10(2): 131-45. PMCID: PMC4082168.
14. Klaus G. G. B., ed. Lymphocytes: A Practical Approach. Oxford University Press; 1987.
15. Orr J.S., Kennedy A.J., Hasty A.H. Isolation of Adipose Tissue Immune Cells. J. Vis Exp. 2013; (75): e50707. doi: 10.3791/50707 PM-CID: PMC3718226.
16. Bonyadi M., Badalzadeh R., Mohammadi M., Poozesh S., Salehi I. The effect of regular training on plasma cytokines response in healthy and diabetic rats. Saudi Med. J. 2009; 30(11): 1390-4. PMID: 19882048.
17. Miranville A., Herling A.W., Biemer-Daub G., Voss M.D. Differential adipose tissue inflammatory state in obese nondiabetic Zucker fatty rats compared to obese diabetic zucker diabetic fatty rats. Horm. Me-tab. Res. 2012; 44(4): 273-8. doi: 10.1055/s-0032-1304581.
18. Cranford T.L., Enos R.T., Velázquez K.T., McClellan J.L., Davis J.M., Singh U.P., et al. Role of MCP-1 on inflammatory processes and metabolic dysfunction following high-fat feedings in the FVB/N strain. Int. J. Obes. (Lond.). 2016; 40(5): 844-51. doi: 10.1038/ ijo.2015.244.
19. López-Jaramillo P., Gómez-Arbeláez D., López-López J., López-Ló-pez C., Martínez-Ortega J., Gómez-Rodríguez A., Triana-Cubillos S. Leptin/adiponectin ratio in metabolic syndrome and diabetes. Horm. Mol. Biol. Clin. Invest. 2014; 18(1): 37-45. doi 10.1515/hmbci-2013-0053.
20. Pérez-Pérez A., Vilariño-García T., Fernández-Riejos P., Martín-González J., Segura-Egea J.J., Sánchez-Margalet V. Role of lep-tin as a link between metabolism and the immune system. Cytokine Growth Factor Rev. 2017; 35: 71-84. doi: 10.1016/j. cytogfr.2017.03.001.
21. Claycombe K., King L.E., Fraker P.J. A role for leptin in sustaining lymphopoiesis and myelopoiesis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2008; 105(6): 2017-21. doi: 10.1073/ pnas.0712053105. Epub 2008 Feb 4.
22. Trottier M.D., Naaz A., Li Y., Fraker P.J. Enhancement of hematopoi-esis and lymphopoiesis in diet-induced obese mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2012; 109(20): 7622-9. doi: 10.1073/pnas.1205129109.
23. Pucino V., De Rosa V., Procaccini C., Matarese G. Regulatory T cells, leptin and angiogenesis. Chem. Immunol. Allergy. 2014; 99: 155-69. doi: 10.1159/000353557.
24. Huang X. F., Chen J. Obesity, the PI3K/Akt signal pathway and colon cancer. Obes. Rev. 2009; 10(6): 610-6. doi: 10.1111/j.1467-789X.2009.00607.x.
25. Cho M.L., Ju J. H., Kim K. W., Moon Y. M., Lee S. Y., Min S. Y., et al. Cyclosporine A inhibits IL-15-induced IL-17 production in CD4Tcells via down-regulation of PI3K/Akt and NF-B. Immunol Lett. 2007; 108(1): 88-96. Epub 2006 Nov 27. doi: 10.1016/j. imlet.2006.11.001
26. Youssef D. M., Elbehidy R. M., Shokry D. M., and Elbehidy E. M. The influence of leptin on Th1/Th2 balance in obese children with asthma. J. Bras. Pneumol. 2013; 39(5): 562-68 doi: 10.1590/S1806-37132013000500006.
27. Matarese G., Moschos, S., and Mantzoros C. S. Leptin in immunology. J. Immunol. 2005; 174(6): 3137-42. PMID: 15749839
28. Fantuzzi G., Faggioni R. Leptin in the regulation of immunity, inflammation, and hematopoiesis. J. Leukoc. Biol. 2000; 68(4): 43746. http://www.jleukbio.org/content/68/4/437. long
29. Zheng H., Zhang X., Castillo E.F., Luo Y., Liu M., Yang X.O. Leptin Enhances TH2 and ILC2 Responses in Allergic Airway Disease. J. Biol. Chem. 2016; 291(42): 22043-52. PMCID: PMC5063987 doi: 10.1074/jbc.M116.743187.
30. Alvarez P., Bogen O., Green P.G., Levine J.D. Nociceptor interleukin
10 receptor 1 is critical for muscle analgesia induced by repeated bouts of eccentric exercise in the rat. Pain. 2017; 158(8): 1481-8. doi: 10.1097/j.pain.0000000000000936.
31. Duzova H., Karakoc Y., Emre M.H., Dogan Z.Y., Kilinc E. Effects of Acute Moderate and Strenuous Exercise Bouts on IL-17 Production and Inflammatory Response in Trained Rats. J. Sports Sci. Med. 2009; 8(2): 219-24. PMID: 24149529 PMCID: PMC3761488.
Поступила 02.07.18 Принята в печать 16.08.18
