CC BY
18
DOI 10.2441/2074-5036-2020-10034 УДК 614.91:616.993.192.1:616-097
Ключевые слова: Toxoplasma gondii, Mustela lutreola, европейская норка, РЛА, ИФА, сравнительный анализ
Key words: Toxoplasma gondii, Mustela lutreola, european mink, LAT, ELISA, comparative analysis
Шамаев Н. Д.
СРАВНЕНИЕ СЕРОЛОГИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ОЦЕНКИ СЕРОПРЕВАЛЕНТНОСТИ T. GONDII В ПОПУЛЯЦИЯХ ЕВРОПЕЙСКОЙ НОРКИ
COMPARISON OF SEROLOGICAL METHODS FOR ASSESSING T. GONDII SEROPREVALENCE IN POPULATIONS OF THE EUROPEAN MINK
ФГАОУ ВО «Казанский (Приволжский) федеральный университет» Адрес: 420008, Россия, Республика Татарстан, г. Казань, ул. Кремлёвская, 18
Kazan Federal University, Address: 420008, Russia, Republic of Tatarstan, Kazan, Kremlyovskaya st., 18
Шамаев Н. Д., аспирант, ФГАОУ ВО «Казанский (Приволжский) федеральный университет».
E-mail: nikolai.shamaev94@mail.ru
Shamaev N. D., Post-Graduate Student, Kazan Federal University. E-mail: nikolai.shamaev94@mail.ru
Аннотация. В статье представлены данные по сравнению серологических методов оценки серопревалент-ности токсоплазмоза в популяции европейской норки (Mustela lutreola) отдельной зверофермы Республики Татарстан. Произведена оценка методов иммуноферментного анализа (ИФА) и реакции латекс-агглютинации (РЛА) с использованием образцов сыворотки крови норок. Общая серопревалентность T. gondii среди норок в ходе использования двух методов составила 15,5 % (в диапазоне 7,37-21,56 % для 95 % CI). Высокий показатель линейной зависимости между техниками РЛА и ИФА (R2=0,826, P=0,001) показал достоверное сходство полученных результатов. РЛА и ИФА одинаково позволяют выявлять антитела к T. gondii у норок. Summary. The article presents data on the comparison of serological methods for assessing the seroprevalence of toxoplasmosis in the population of European mink (Mustela lutreola) of a separate fur farm in the Republic of Tatarstan. The methods of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and latex agglutination (LAT) were evaluated using blood serum samples from minks. The overall seroprevalence of T. gondii among minks using the two methods was 15.5 % (range 7.37-21.56 % for 95 % CI). A high indicator of the linear relationship between the techniques ofRLA and ELISA (R2 = 0.826, P = 0.001) showed a significant similarity of the results. RLA and ELISA are equally capable of detecting antibodies to T. gondii in minks.
Введение
Toxoplasma gondii это паразитарный организм, проникающий и поражающий клетки хозяина. Вид относится к типу Споровики, классу Кокцидиеобразных, отряду Кокци-дий [1]. Паразит вызывает инвазию, называемую токсоплазмозом. Это заболевание протекает бессимптомно у взрослых людей с развитым иммунитетом, но представляет серьезную опасность для беременных женщин, детей и лиц с иммунодепрессией.
Паразит имеет сложный биологический цикл, в котором задействовано более 350 видов позвоночных животных, являющихся промежуточными хозяевами, одними из них являются норки [6]. Эти животные представляет большой научный интерес в ис-
следованиях, касающихся распространения T. gondii [5, 7]. Норок выращивают в неволе, то есть доступа к основным объектам окружающей среды, через которое происходит заражение, у животных нет [2]. Мониторинг специфических патогенов поможет оценить загрязнение окружающей среды и уровень риска у популяции норок к распространению паразитической протисты.
На сегодняшний день исследования способов распространения заболевания, вызываемого паразитом T. gondii, актуальны в связи с тем, что происходит возрастание удельного веса этой патологии во многих регионах и странах. Среди методов для скрининга заболевания в условиях лаборатории чаще всего используют такой серологический ме-
тод исследования, как иммуноферментный анализ (ИФА) [4]. Как наиболее быстрый и чувствительный метод выявления антител к микроорганизмам при проведении массовых обследований выделяют реакцию латекс-агглютинации (РЛА), используемую для определения титра антител у животных [3]. Но насколько эффективны оба метода для серологического анализа на T. gondii, остается невыясненным. Целью данной работы была сравнительная оценка серологических методов оценки серопревалентности РЛА и ИФА в популяции европейской норки (Mustela lutreola) отдельной зверофермы Республики Татарстан.
Материалы и методы
Исследованию подверглась популяция норок зверосовхоза Республики Татарстан, основным видом деятельности которого является производство мехов. В хозяйстве также содержатся соболи и песцы. Поголовье норок составляет примерно 8000 голов. Для отбора проб использовали метод случайной выборки. Осенью 2018 было исследовано 100 проб методами ИФА и РЛА. Отбор крови у норок проводили путем сердечной пункции с использованием пробирок Improvacuter с активатором свертывания крови ("Guangzhou Improve Medical Instruments CO., LTD", Китай) с последующим отделением сыворотки, которую хранили при -20°C до исследования.
Для определения титра специфических антител в сыворотке крови норок использовали серологический метод латекс-агглютинации. В работе использовали набор для постановки реакции латекс-агглютинации (РЛА) Toxotest-MT (Eiken, Япония) с антигеном Toxoplasma gondii, иммобилизированным на полистироловых латексных бусинах. Постановку реакции осуществляли согласно инструкции производителя. Оценку результатов проводили визуально с использованием цифрового USB-микроскопа DigiMicro Prof. (DigiMicro, Китай) с программным обеспечением MicroCapture Pro Version 2.2. Для интерпретации РЛА результат реакции учитывался по 4 проявлениям агглютинации: 0 (небольшая четкая точка из бусин в центре лунки), 1 (бусины аккуратно лежат на дне лунки в виде круга), 2 (бусины беспорядочно разбросаны по всему дну лунки),
3 (бусины лежат на дне лунки несклеенными, разбросанными, в виде круга неправильной формы). Уровни 1-3 регистрировались как положительный результат для данного разведения сыворотки крови, а уровень 0 - как отрицательный.
Исследованные в реакции латекс-агглютинации сыворотки крови использовали для оптимизации внутреннего ИФА. Антиген разводили в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) в концентрации 0,5 мкг на лунку. Иммобилизацию антигена на поверхность дна лунки планшета (Med Polymer, Россия) проводили при 4°C в течение 16-20 часов. Планшеты трехкратно отмывали ФСБ. Сыворотку норок в разведении 1:100 в ФСБ с 0,05 % Tween 20 (ФСБ-Т) вносили в лунки в объеме 100 мкл, инкубировали в течение 60 минут при 37°C. После инкубации пятикратно промывали ФСБ-Т. 100 мкл конъюга-та Protein-A HRP (Sigma, USA) разведенный в ФСБ-Т (1:75,000) вносили в лунки планшет и инкубировали 30 минут при 37°C. Промывали ФСБ-Т пятикратно и вносили субстрат TMB Slow Kinetic (Sigma, USA) и инкубировали в течение 15 минут при комнатной температуре в темноте. Останавливали реакцию внесением 100 мкл стоп-реагента (H2SO4). Регистрацию результатов реакции проводили на спектрофотометре при основной длине волны 450 нм и референсном фильтре 620 нм. Результат измерения оптической плотности (ОП) в ИФА считался положительным, когда значение было больше 0,200 [2].
Сравнительный анализ результатов РЛА и ИФА проводили с построением графика линейной зависимости с расчетом коэффициента детерминации R2, определением достоверности по значению p для коэффициента R2, с использованием Microsoft Excel 2018. Расчет 95 % доверительного интервала для значений превалентности T. gondii в популяции норок проводился с помощью онлайн-калькулятора Clinical Research Calculators: Clinical Calculator 1, доступного на сайте VassarStats: Website for Statistical Computation (http://vassarstats.net/).
Результаты исследований
Сыворотка крови норок была исследована в РЛА на наличие специфических антител
к антигену T. gondii. В 8 из 100 образцов титр антител составил 1:32, в 3 из 100 образцов титр антител составил 1:64, в 1 из 100 титр антител составил 1:128, 3 из 100 образцов титр антител составил 1:256, в 1 из 100 образцов титр антител составил 1:512, в 2 из 100 образцов титр антител составил 1:1024. Общее количество серопозитивных норок в РЛА составило 18 %.
В ходе ИФА сывороток норок было обнаружено 3 из 100 образцов c ОП в диапазоне 0,574-0,826 оптических единиц (ОЕ), 3 из 100 образцов с ОЕ, в диапазоне 1,158-1,300 ОЕ, 4 из 100 образцов с ОП в диапазоне 1,4772,009 ОЕ. В ИФА было обнаружено 7 образцов из 100 c ОП в диапазоне 0,206-0,326 ОЕ. Общее количество серопозитивных норок в ИФА составило 13 %.
По результатам сравнительной оценки се-ропревалентности T. gondii в РЛА и ИФА оба метода применимы для исследования норок. Коэффициент детерминации, полученный при определении линейной зависимости РЛА и ИФА, составил выше 80 % (R2=0,826, P=0,001). На графике показана зависимость значений оптической плотности в реакции иммунофер-ментного анализа от распределения значений титров специфических антител к T. gondii в реакции латекс-агглютинации (Рис. 1).
Обсуждение результатов
Сравнительный анализ показал, что использование обоих методов допустимо для серологического анализа на токсоплазмоз среди норок. Результаты серологической реакции РЛА при низких титрах антител к T. gondii у норок были интерпретированы в ИФА как неспецифические, исходя из чего необходим детальный подход к использованию ИФА. При умеренном соотношении результатов серопре-валентности между методами, каждый этап РЛА и ИФА возможно модифицировать при помощи сравнительного компонентного анализа для тестирования антител и антигенов, что повысит специфичность и чувствительность методов. Оба метода доступны для модификаций в компонентном составе, а также позволяют использовать неочищенный антиген [2, 4], что, по нашему мнению, позволит большему количеству образцов иметь достоверное пороговое значение серопозитивности.
6
К - 0.8403
5 О JK)
/
У
/
4 ООО/
У
у
^ /
|з о о оо рсУ
/
у
2 О О ^^
У
у
у
I ОО OD О О
у
у
у
у
0 ^ИЕГЖЮ О О
0.000 0.500 1.000 1.500 2.000 2.500
ИФА
Рис. 1. Распределение значений оптической плотности в реакции иммуноферментного анализа по титрам специфических антител к T. gondii в реакции латекс-агглютинации. На оси X показаны значения ОП в ИФА (ELISA). На оси Y показаны титры антител в РЛА (LAT), где 0 - отрицательный результат, 1 - титр 1:32, 2 - 1:64, 3 - 1:256, 4 - 1:512, 5 - 1:1024.
Заключение
Проведена сравнительная оценка методов иммуноферментного анализа и реакции латекс-агглютинации с использованием образцов сыворотки крови норок. Общее количество серопозитивных норок в РЛА составило 18 %. Общее количество серопозитивных норок в ИФА составило 13 %. Общая серопревалентность T. gondii среди норок в ходе использования двух методов составила 15,5 % (в диапазоне 7,37-21,56 % для 95 % CI). Высокий показатель линейной зависимости между техниками РЛА и ИФА (R2=0,826, P=0,001) показал согласование между техниками для выявления реакции антиген-антитело для подсчета титра антител к T. gondii у норок. Применение обоих методов доступно для эпизоотологического контроля распространения токсоплазмоза.
Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта № 19-34-90024.
Список литературы
1. Андреев В. П. Токсоплазмоз: этиология, эпидемиология, принципы диагностики / В. П. Андреев // Журнал ГрГМУ Беларусь. 2007. №3. С. 112-116.
2. Беспалова Н. С. Использование IMMUNOCOMB BIOGAL для экспресс-диагностики токсоплазмоза кошек / Н. С. Беспалова, С. С. Катков // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины имени Н. Э. Баумана. Казань. 2015. Т. 222(2). С. 24-27.
3. Бровкина А. Н. Разработка метода и тест-системы выявления бактерий рода salmonella на основе латекс-агглютинации. / А. Н. Бровкина // Научный журнал КубГАУ. Краснодар. №72(08) 2011. С. 1-2.
4. Катков С. С. Клинические проявления токсо-плазмоза кошек в Воронежской области / С. С. Катков, Н. С. Беспалова // Инновационные технологии и технические средства для АПК : материалы Междунар. науч.-практ. конф. молодых ученых и специалистов Воронежского ГАУ Воронеж. 2014. Ч. 2. С. 27-31.
5. Shamaev N. D. Prevalence and risk factors of Toxo-plasma-like and intestinal parasites in cats from urbanized area of Tatarstan, Russia / N. D. Shamaev, A. Yu. Fedotova, A. V. Galiullina, M. N. Mukminov, E. A. Shuralev // Research Journal of Pharmaceutical, Biological and Chemical Sciences. 2018. Vol. 9, Iss. 6. P. 465-471.
6. Shamaev N. D. Seroprevalence and B1 gene genotyping of Toxoplasma gondii in farmed European mink in the Republic of Tatarstan, Russia / N. D. Shamaev, E. A. Shuralev, S. V. Petrov, G. G. Kazaryan, N. M. Aleksandrova, A. R. Valeeva, K. S. Khaertynov, M. N. Mukminov, K. Kitoh, Y. Takashima // Parasitology International. 2020. Vol. 76. Art. 102067. P. 1-5. DOI: 10.1016/j.parint.2020.102067
7. Shuralev E. A. Toxoplasma gondii seroprevalence in goats, cats and humans in Russia / E. A. Shuralev, N. D. Shamaev, M. N. Mukminov, K. Nagamune, Y. Taniguchi, T. Saito, K. Kitoh, M. I. Arleevskaya, A. Y. Fedotova, D. R. Abdulmanova, N. M. Aleksandrova, M. A. Efimova, A. I. Yarullin, A. R. Valeeva, K. S. Khaertynov, Y. Takashima // Parasitology International. 2018. Vol. 67, Is. 2. P. 112-114. DOI: 10.1016/j.parint.2017.10.014.
АППАРАТ ДЛЯ ИМПУЛЬСНОЙ ЭЛЕКТРОМАГНИТНОЙ ТЕРАПИИ «УМИ-05»
На протяжении многих лет клиника БНПЦ ЧИН и Институт Ветеринарной Биологии (Санкт-Петербург) используют в своей практике уникальный прибор — генератор низкочастотного магнитного импульсного излучения большой мощности «УМИ-05» (ранее «УИМТ-2», «УИМТ-3»). Данный прибор применяется для моно-или комплексной терапии целого ряда болезней, которые ранее считались неизлечимыми или очень тяжело поддавались лечению.
Основные направления применения «УМИ-05»
Болезни мочевой системы: мочекаменная болезнь, пиелонефрит, поликистоз, цистит.
• Желчекаменная болезнь. Болезни опорно-двигательного аппарата: остеохондроз позвоночника, дископатия, артрозо-артриты, бурсит, растяжение связок, ушибы, контрактуры суставов, миозит.
• Купирование эпилептических приступов и эпилептического статуса.
• Гипертензия.
• Отит гнойный.
• Отит аллергический.
Стандартный курс лечения
• 10 сеансов по 30—50 импульсов на одну патологическую область. Мощность 50—80 %. Курс можно повторить с перерывом в 10 дней.
• Профилактический курс для животных группы риска (остеохондроз, МКБ и пр.) — 7—10 сеансов с интервалом 6 месяцев.
• Применение прибора не вступает в противоречие с использованием фармакологических и хирургических методов лечения.
• Магнитотерапию не следует проводить на области тела, содержащей металлоконструкции (например, штифты или пластины для остеосинтеза).
Экономика
• Быстрая окупаемость прибора.
• Минимальная затрата рабочего времени: длительность одного сеанса на одну патологическую зону — 2—3 минуты.
• Высокая эффективность лечения, полное излечение или введение животного в стойкую ремиссию по всем перечисленным болезням гарантируют значительное увеличение рейтинга клиники в целом и приток новых клиентов.
Стоимость прибора 27000 рублей Заказать УМИ - 05 можно по тел./факсу: (812) 927-55-92 доб 208; (812) 612-13-34 доб. 208 или по e-mail: ivb-info@mail.ru. подробности на сайте: www.invetbio.spb.ru
