CC BY
50
ВЕСТНИК ГЕМАТОЛОГИИ, том XVII, № 2, 2021
Ж.Н. Несипбаева, М.К. Каражанова, Д.З. Нурписова
АНАЛИЗ СТРУКТУРЫ ХРОМОСОМНЫХ АБЕРРАЦИЙ У ДЕТЕЙ С ОСТРЫМ
ЛЕЙКОЗОМ
АО «Научный центр педиатрии и детской хирургии», г. Алматы, Республика Казахстан
Введение. Лейкоз - это опухолевое новообразование гемопоэтической ткани с первичным поражением костного мозга, морфологическим субстратом которого является бластная клетка. Современные исследования показали, что возникновение опухоли всегда связано с перестройкой генетического аппарата гемопоэтической клетки. Хромосомные и молекулярно-генетические аберрации, играя основную роль в патогенезе острых лейкозов, определяют морфологические, иммунологические и клинические особенности заболевания.
Цель. Ретроспективный анализ структуры и частоты хромосомных аберраций у детей с первично диагностированным острым лейкозом.
Материал и методы. Был проведен ретроспективный анализ историй болезни детей, находившихся на стационарном лечении онкогематологического отделения АО «Научного центра педиатрии и детской хирургии» г. Алматы за период с 2015 по 2017 гг. Было исследовано 310 историй болезни с первично диагностированным острым лейкозом. Материалом исследования послужили клетки костного мозга, полученного при пункционной биопсии грудины или подвздошной кости. Цитогенетические исследования проводились в лаборатории центра стандартным цитогенетическим методом с помощью дифференциального окрашивания хромосом. Хромосомные препараты анализировались на микроскопах исследовательского класса с использованием программ автоматического кариотипирования. При отсутствии митозов, а также при подозрении на определенные варианты острого лейкоза по результатам иммунологических и морфологических исследований и клинических проявлений заболевания при нормальном кариотипе дополнительно проводили исследование методом флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) c использованием ДНК-зондов «Vysis Inc., Abbott Laboratories».
Результаты. Число пациентов с острым миелобластным лейкозом (ОМЛ) составило 22,6% (n=70), острый лимфо-бластный лейкоз - 75,5% (n=234), недифференцированные и бифенотипические варианты (другие виды лейкоза) встречены в 1,9% случаев (n=6). При цитогенетическом и моле-кулярно-цитогенетическом (методом in situ гибридизации) исследованиях опухолевых бластных клеток костного мозга среди 310 пациентов у 158 пациентов (51%) были выявле-
ны различные хромосомные аберрации. Хромосомные аномалии, ассоциированные с устойчивыми вариантами ОМЛ и ОЛЛ согласно классификации ВОЗ, были обнаружены у 117 больных (74% от всех случаев с хромосомными нарушениями). В 26% (n=41) имели место другие аберрации, не связанные с ВОЗ-вариантами острых лейкозов. Из 117 пациентов с рекуррентными хромосомными перестройками в бластных клетках ОЛ, случаи ОМЛ составили 18% (n=21), ОЛЛ - 82% (n=96). Нормальный кариотип наблюдался у 102 пациентов (33%). Не удалось получить метафазы для цитогенетическо-го анализа у 50 больных (16%). Иммунофенотипирование клеток костного мозга выявило преобладание В-клеточных лейкозов (91,8%) над Т-клеточными лейкозами (8,2%). В структуре В-ОЛЛ доминировали common (70,4%) и пре-В (13,3%) подварианты. Молекулярно-цитогенетическое исследование методом FISH с ДНК-зондами к известным хромосомным перестройкам было проведено 98 пациентам. У 66 пациентов было обнаружено наличие химерных генов, у 32 пациентов данный метод не обнаружил перестройки генов. Из 66 обнаруженных случаев, у 37 было выявлено ETV6/ RUNX1 - t(12;21), у 5 BCR/ABL - t(9;22), у 7 MLL rearranged - t(v;11q23.3), у 2 TCF3-PBXI - t(1;19), у 3 c-MYC - t(8;14), у 5 RUNX1/RUNX1T1 - t(8;21), у 4 PML/RARA - t(15;17), у 3 CBFB/ MYH11 - inv(16).
Выводы. В детской популяции преобладает лимфо-бластный вариант острого лейкоза (75,5%), занимающий ведущую роль в структуре ОЛ у детей разного возраста. На долю ОмЛ приходится 22,6% всех ОЛ. Самой частой хромосомной перестройкой у пациентов с ОЛЛ была гипердиплои-дия хромосом бластных клеток (10,6%), среди структурных перестроек доминирует транслокация t(12;21)(p13;q22)/ ETV6-RUNX1, которая была выявлена у 37 (16%) пациентов. Самой частой перестройкой при ОМЛ была t(8;21)(q22;q22)/ RUNX1-RUNX1T1, которая идентифицирована у 14 (20%) больных. Таким образом, определенные диагностические хромосомные перестройки связаны с благоприятным прогнозом, тогда как другие предсказывают высокий риск неэффективности стандартного лечения, что изначально помогает клиницистам выбрать более интенсивную терапию (высокодозные режимы химиотерапии, трансплантация ге-мопоэтических стволовых клеток).
Е.Е. Никулина, А.С. Пшеничный, Н.В. Рисинская, К.С. Сычевская, Н.В. Рыжикова, Ю.В. Сидорова, А.Б. Судариков
СРАВНЕНИЕ МЕТОДОВ ВЫДЕЛЕНИЯ ДНК ИЗ МАЛОКЛЕТОЧНЫХ ОБРАЗЦОВ
Федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Москва
Введение. В гематологической лабораторной практике нередко приходится осуществлять диагностику с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) на архивных образцах с низким содержанием клеток, таких как мазки периферической крови (ПК) и костного мозга (КМ), отпечатки лимфатических узлов. Цитологические образцы бывают необходимы при отсутствии иного альтернативного дебютного материала. Важно подобрать эффективную методику выделения нуклеиновых кислот для проведения ПЦР-анализа, обеспечивающую достаточное количество и качество мате-
риала. На данный момент существует большое количество методик выделения нуклеиновых кислот из различных биологических материалов. Однако, не все из них позволяют выделить ДНК/РНК из малого количества материала, в том числе, из образцов изначально не предназначенных для выделения нуклеиновых кислот.
Цель. Сравнить методики экстракции ДНК на твердом носителе (сорбенте) и с помощью протеиназы К из сложного материала с низкой клеточностью: мазки КМ, ПК, ликвора.
Материалы и методы. Проанализированы 23 неокра-
МАТЕРИАЛЫ КОНФЕРЕНЦИИ
шенных (нативных) и несколько окрашенных мазков костного мозга от пациентов с ОМЛ (в том числе ОПЛ), ОЛЛ, МДС, а также 10 образцов ликвора больных с ЛПЗ, наблюдавшихся в «НМИЦ гематологии» в период с 2020 г. На цитологические мазки наносили 1 каплю (20 мкл) соответствующего буфера, клетки снимали пипетированием с поверхности стекла и переносили в пробирки типа «Эппендорф». Ликвор центрифугировали 5 мин при 7000 тыс. об/мин. Экстракцию ДНК из смытых клеток или ликвора проводили двумя методами: 1 - набором реагентов для экстракции ДНК «АмплиПрайм ДНК-сорб-В» (ООО «НекстБио», Россия) по протоколу производителя; 2 - методом прямого лизиса клеток с протеиназой К. Во втором случае клетки суспендировали в 20 мкл лизис-ного буфера (0,5% NP40, 50 мМ Трис (pH 8,3), 75 мМ KCl, 20 мкг протеиназы К), инкубировали при 56 °C на протяжении 60 мин с последующим нагреванием в течение 15 минут до 100 °C (для инактивации протеиназы К). Лизаты подвергались центрифугированию длительностью 1 мин при 13 000 об/мин. Для каждой реакции использовали по 2 мкл супернатанта (1/10 от общего количества). Количество полученной ДНК измеряли на флуориметре Qubit 4.0 («Thermo Fisher Scientific», США) с использованием набора для количественной оценки образцов с низким содержанием ДНК и РНК dsDNA HS (на 100 реакций) в соответствии с протоколом производителя. Качество исследованной ДНК оценивали методом определения STR-профилей на основе мультиплексного ПЦР-анализа 19 локусов при помощи наборов COrDIS Plus («СИНТОЛ», Россия) согласно протоколу производителя. Фрагментный анализ ПЦР-продуктов выполняли на генетическом анализаторе «Нанофор-05» (СИНТОЛ). Для получения полного STR-профиля образца использовали от 0,2 нг (оптимально - от 0,5 нг) недеградированной ДНК. При фраг-ментном анализе STR-профилей ПЦР-продукт, полученный таким образом, не требует дополнительного разведения.
Результаты. Оба метода сравнимы по затратности и времени исследования (1 ч 15 мин и 55 мин, время выделения ДНК на твердом носителе короче на 20 минут). Методом с использованием протеиназы К была выделена ДНК из 23 (100%) цитологических образцов с концентрацией в диапазоне 0,3-4,6 нг. Экстракция ДНК с использованием твердого носителя (сорбента) была успешной для 20 препаратов из 23 (87%), диапазон концентраций составлял 0,05-1,5 нг. То есть при обработке мазков Км или ПК выход ДНК методом прямого лизиса в 3 раза превышал таковой при выделении на сорбенте. Выход ДНК из образцов ликвора с применением протеиназы составил в среднем до 10 нг, а на сорбенте - в среднем до 2 нг. Качество ДНК, оцененное по определению STR-профилей на ДНК выделенной на сорбенте и с протеиназой К при низких концентрациях исходного материала (0,27 и 0,3 нг/мл) было одинаковым. ДНК, выделенные из нескольких окрашенных мазков, не отличались существенно по концентрации и качеству от выделенных из нативных (неокрашенных) мазков.
Выводы. Сравнительная оценка методов показала большую эффективность экстракции ДНК методом прямого лизиса клеток с протеиназой К. Его можно рассматривать как эффективную экспресс-методику выделения качественной ДНК из сложного материала с низкой клеточностью. Основным недостатком выделения ДНК на твердом носителе (сорбенте), является низкий выход нуклеиновой кислоты. Метод прямого лизиса с пртеиназой К может быть использован для работы с архивными цитологическими образцами для определения аллельной нагрузки различных мутаций при гемобластозах. При этом основная часть мазка КМ или ПК может быть по-прежнему использована для подсчета общего количества клеток и бластных элементов (миелограм-мы).
В.А. Овсепян, Е.В. Трегубова, Н.В. Минаева
ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ ФЕРМЕНТОВ БИОТРАНСФОРМАЦИИ КСЕНОБИОТИКОВ И РЕГУЛЯЦИИ АПОПТОЗА У БОЛЬНЫХ С РАЗНЫМИ СТАДИЯМИ В ДЕБЮТЕ
ХРОНИЧЕСКОГО ЛИМФОЛЕЙКОЗА
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Федерального медико-биологического агентства», г. Киров
Введение. Стадия хронического лимфолейкоза (ХЛЛ) является интегральным клиническим параметром, отражающим степень распространенности опухолевого процесса, величину лимфоцитоза и характер угнетения нормальных ростков гемопоэза. К числу возможных факторов этиопа-тогенеза злокачественных новообразований относятся конституциональные особенности генома, в частности, функционально значимый полиморфизм генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков (ФБК), таких как GSTP1 и NQO, и вовлеченных в регуляцию апоптоза (РА) генов Т№А и MDM2.
Цель. Изучить ассоциации полиморфных локусов 609С>Т, 309Т>^ -308G>A и 105Пе>Уа1 соответственно генов TNFA и GSTP1 с разными стадиями ХЛЛ в диагностический период.
Материалы и методы. Материалом для исследования полиморфизмов послужила ДНК, выделенная из лейкоцитов венозной крови 235 больных ХЛЛ в возрасте от 33 до 82 лет (медиана возраста - 63 года) и с соотношением мужчин и женщин в диагностический период, равным 139/96. Ста-дирование болезни проводилось согласно классификационной системе К. Rai. Пациенты были разбиты на 3 группы в соответствии со степенью риска по Т(. Kipps et а1.( 2017), а именно: 107 больных со стадиями 0 и I составили группу низкого риска, 99 пациентов со стадией II — группу среднего
риска и 29 больных со стадиями III и IV — группу высокого риска. Группа сравнения состояла из 315 здоровых неродственных жителей Волго-Вятского экономического района России, сопоставимых по полу и возрасту с основной группой. Генотипирование полиморфных локусов NQO1*609C>T MDM2*309T>G и TNFA*308G>A выполняли разными вариантами аллель-специфичной ПЦР, а локуса GSTP1*105Ile>Val — методом ПЦР-ПДРФ. Ассоциацию полиморфных локусов изучаемых генов с разными стадиями ХЛЛ в период диагностики оценивали по отношению шансов (OR) с доверительным интервалом (И) при уровне доверия 95%.
Результаты. В ходе проведенного сравнительного анализа распределения частот аллелей полиморфных локусов генов ФБК и РА в группах сравнения и больных ХЛЛ с разными стадиями в диагностический период установлено, что аллель Т№А*308А встречался статистически значимо с большей частотой в основных группах со стадиями 04 и II, чем в группе сравнения (18,4 vs 6,3%, х2=27,08, р=2,ОЕ-7, рсог=6,ОЕ-6; и 12,1 vs 6,3%, х2 =7,04, р=0,008, рсог=0,024 соответственно), а аллель GSTP1*105Val — чаще в основной группе со стадией II, чем в контрольной (45,8 vs 32,5%, х2 =7,04, р=0,008, рсог=0,024). Встречаемость аллелей TNFA*308A и GSTP1*105Val была выше и в группе больных со стадиями III-IV по сравнению с группой здоровых лиц, однако межгруп-
