CC BY
11
Научная статья УДК 636.03
doi: 10.24412/2078-1318-2023-2-114-120
СРАВНЕНИЕ МЕТОДИК ВЫДЕЛЕНИЯ ООЦИТ-КУМУЛЮСНЫХ КОМПЛЕКСОВ ИЗ ЯИЧНИКОВ ЖИВОТНЫХ ПОСЛЕ ОВАРИОЭКТОМИИ
Шульгин Илья Константинович1, Ротарь Любовь Николаевна2, Шульгина Валерия Денисовна3
1 ФГБОУ ВО Санкт-Петербургский государственный аграрный университет 196601, Россия, г. Санкт-Петербург, г. Пушкин, Петербургское шоссе, дом 2,
ilya.shulgin@mail.ru, https://orcid.org/0000-0002-7652-966X
2 ФГБОУ ВО Санкт-Петербургский государственный аграрный университет 196601, Россия, г. Санкт-Петербург, г. Пушкин, Петербургское шоссе, дом 2,
valevskaya@bk.ru, https://orcid.org/0000-0001-8151-7164 3 ООО «НОВА КОРОВА» 125212, г. Москва, Войковский муниципальный округ, ш. Ленинградское, д. 39, vluzhnyak@mail.ru, https://orcid.org/0000-0001-9538-493X
Реферат. Вспомогательные репродуктивные технологии в животноводстве, в частности получение эмбрионов, набирают всё большую популярность в России, интерес вызывает получение эмбрионов in vitro post mortem. Данная процедура может быть применена в случае потери ценной особи, для обучения технологии получения эмбрионов животных in vitro, для постановки научных экспериментов и тестирования различных эмбриологических сред, а также для практической подготовки кадров в области биотехнологии. Объектом исследования служили яичники коров и тёлок крупного рогатого скота голштинской породы. Целью настоящего исследования было сравнение эффективности двух постмортальных методик получения ооцит-кумулюсных комплексов (ОКК) у крупного рогатого скота после овариоэктомии (удаления яичников). Нами был проведён эксперимент, в котором сравнивались методики фолликулярной аспирации и овариальной резекции. Всего в эксперименте было использовано 19 яичников крупного рогатого скота голштинской породы, полученных после убоя. На каждом яичнике было подсчитано количество видимых фолликулов и их диаметр, в работе использовались яичники без кист. В среднем из одного яичника методикой фолликулярной аспирации выделено 3,95 ОКК, что соответствует 47,8% от общего количества ОКК, полученных двумя методиками, применяемыми последовательно. Далее с использованием методики овариальной резекции из каждого яичника было дополнительно выделено в среднем 4,32 ОКК, что соответствует 52,2% от всех полученных ОКК. Таким образом, методика овариальной резекции оказалась эффективнее методики фолликулярной аспирации более чем в два раза и рекомендуется к применению для более высокого выхода ОКК, используемых для получения эмбрионов in vitro post mortem. Использование только методики овариальной резекции снижает затраты времени и расходных материалов, а также она способна показывать такие же результаты, как и использование двух этих методик последовательно.
Ключевые слова: эмбрионы in vitro, ооцит-кумулюсный комплекс, овариальная резекция, фолликулярная аспирация, крупный рогатый скот
Цитирование: Шульгин, И.К., Ротарь, Л.Н., Шульгина, В.Д. Сравнение методик выделения ооцит-кумулюсных комплексов из яичников животных после овариоэктомии // Известия
Санкт-Петербургского государственного аграрного университета. - 2023. - № 2 (71). - С. 114— 120, doi: 10.24412/2078-1318-2023-2-114-120
COMPARISON OF TECHNIQUES FOR EXTRACTING OOCYTE-CUMULUS COMPLEXES FROM THE OVARIES OF ANIMALS AFTER OVARIECTOMY
Ilya K. Shulgin1, Lyubov N. Rotar2, Valeria D. Shulgina3
1Saint-Petersburg State Agrarian University, Peterburgskoye shosse, 2, Pushkin, Saint Petersburg,
196601, Russia, ilya.shulgin@mail.ru, https://orcid.org/0000-0002-7652-966X 2Saint-Petersburg State Agrarian University, Peterburgskoye shosse, 2, Pushkin, Saint Petersburg, 196601, Russia, valevskaya@bk.ru, https://orcid.org/0000-0001-8151-7164 3LLC «NOVA KOROVA», Moscow city, Voykovsky municipality, Leningradskoe s. 39, b. 7, room IV, 125212, Russia, vluzhnyak@mail.ru, https://orcid.org/0000-0001-9538-493X
Abstract. Assisted reproductive technologies in animal husbandry, in particular embryo production, are gaining more and more popularity in Russia, the in vitro post mortem embryo production is of interest. This procedure can be applied in the case of the loss of a valuable individual, for training in the technology of obtaining animal embryos in vitro, for setting up scientific experiments and testing various embryological media, and for practical training in biotechnology. The ovaries of Holstein cattle and heifers were the objects of the study. The aim of this study was to compare the efficacy of two post-mortem techniques for obtaining oocyte-cumulus complexes (OCC) in cattle after ovariectomy (removal of the ovaries). We conducted an experiment comparing follicular aspiration and ovarian resection techniques. A total of 19 ovaries of Holstein cattle obtained after slaughter were used in the experiment. The number of visible follicles and their diameter were counted on each ovary, and ovaries without cysts were used. On average, 3.95 OCCs were isolated from one ovary by follicular aspiration, corresponding to 47.8% of the total number of OCCs obtained by the two techniques used in series. Then, using the ovarian resection technique, an average of 4.32 additional OCCs were isolated from each ovary, corresponding to 52.2% of all OCCs obtained. Thus, the ovarian resection technique has proven to be more than twice as effective as the follicular aspiration technique and is recommended for a higher yield of OCCs used for in vitro post-mortem embryo production. Using the ovarian resection technique alone reduces time and consumable costs, and is able to show the same results as using the two techniques in series.
Keywords: in vitro embryos, oocyte-cumulus complex, ovarian resection, follicular aspiration, cattle
Citation. Shulgin, I.K., Rotar, L.N., Shulgina, V.D. (2023), "Comparison of techniques for extracting oocyte-cumulus complexes from the ovaries of animals after ovariectomy" // Izvestiya of St. Petersburg State Agrarian University, vol. 71. no. 2. pp. 114-120 (In Russ) doi: 10.24412/20781318-2023-2-114-120
Введение. Методы получения эмбрионов сельскохозяйственных животных набирают всё большую популярность в России, в том числе большой интерес вызывает получение эмбрионов in vitro post mortem. Данная процедура может использоваться в случае смерти высокоценной особи, при экспериментальных разработках в области эмбриологии и в процессе обучения специалистов для наработки профессиональных навыков. Из
постмортальных яичников ооцит-кумулюсные комплексы выделяют, применяя две методики: овариальную резекцию и аспирацию овариальных фолликулов. Иногда эти методики применяют последовательно. В зависимости от поставленных целей необходимо определить концептуальные различия, преимущества и недостатки принятых методик и выбрать наиболее подходящую. Доставка яичников коров с бойни в лабораторию является важным фактором, т. к. необходимо сохранить в процессе транспортировки ооциты, которые в дальнейшем будут использоваться для получения эмбрионов in vitro [5, 6, 7, 8, 9].
Цель исследования - сравнение эффективности двух постмортальных методик получения ооцит-кумулюсных комплексов (ОКК) у крупного рогатого скота после овариоэктомии.
Материалы, методы и объекты исследования. Объектом исследования служили яичники коров и тёлок крупного рогатого скота голштинской породы. На бойне после убоя коровы из туши животного проводится извлечение яичников (овариоэктомия). Наиболее благоприятно, когда доставка яичников осуществляется в лабораторию при температуре 36-37°С, в растворе NaCl 0,9% или в стерильной герметичной таре, в пределах 1 часа. По прибытию в лабораторию с яичников удаляют остатки яйцеводов и 3 раза промывают в стерильном, подогретом до 37,5°С 0,9% растворе NaCl с добавлением 2% гентамицина (0,4 мл на 400 мл 0,9% NaCl), после чего помещают в чашку Петри с небольшим количеством среды ТС-199, модифицированной гентамицином, гепарином и бычьим сывороточным альбумином (BSA) (на 400 мл ТС-199 0,2 мл 2% раствора гентамицина, 2500 ЕД гепарина, 1 грамм BSA). Для работы отбирают яичники, на поверхности которых отсутствуют патологии, находящиеся в периоде фолликулярного роста или на лютеиновой стадии (с наличием желтого тела) [2].
В представленном исследовании мы проводили сравнение двух методик выделения ОКК из яичников после овариоэктомии: фолликулярной аспирации и овариальной резекции для определения наиболее удобной, быстрой и эффективной.
Методика фолликулярной аспирации
Выделение ооцит-кумулюсных комплексов для их дальнейшего дозревания и оплодотворения in vitro может проводиться путем фолликулярной аспирации. Приспособление для извлечения яйцеклеток из фолликулов овариальной ткани представляет собой инсулиновый шприц с иглой диаметром 18 G. Шприцем проводится аспирация содержимого фолликулов (фолликулярная жидкость, ооцит-кумулюсные комплексы, соматические фолликулярные клетки) [6, 8, 9, 10].
Манипуляция выполняется следующим образом: иглой прокалывается стенка фолликула и за счёт создания отрицательного давления в шприце фолликулярное содержимое попадает в шприц. Эта методика позволяет извлечь ооцит-кумулюсные комплексы из конкретных фолликулов определённого диаметра. В результате проведения фолликулярной аспирации аспират не содержит дополнительных включений в виде овариальной ткани, крови, за счёт чего снижается риск контаминации биологического материала (ОКК) в процессе работы в лаборатории.
Недостатки метода: слишком маленький диаметр некоторых фолликулов и отсутствие антральной полости не позволяют выделить ооциты методом фолликулярной аспирации. Также при использовании игл малого диаметра существует риск повреждения слоя кумулюсных клеток из-за воздействия на ОКК отрицательного давления, создаваемого в шприце, и наличия шероховатостей на внутренней поверхности инъекционной иглы [10].
Для изолированных яичников, подвергшихся овариоэктомии, аспирация фолликулярной жидкости осуществляется при помощи шприца объемом 2,0 мл с иглой 18G.
После аспирации фолликулярную жидкость помещают в чашку Петри. После завершения аспирации фолликулов каждую порцию полученной фолликулярной жидкости исследуют на наличие ОКК под микроскопом. ОКК извлекают и помещают в модифицированную среду ТС-199.
Методика овариальной резекции
Вторая методика - овариальная резекция. Резекцию проводят, помещая яичник в чашку Петри с небольшим количеством промывочной среды, разрезая его многолезвийной бритвой или скальпелем.
Устройство многолезвийной бритвы представляет собой 2 и более лезвий опасной бритвы, сложенных вместе и зафиксированных в корцанге. Яичник несколько раз рассекают лезвиями по всей его поверхности на глубину 1 -2 мм. Таким образом, фолликулы вскрываются, высвобождая ооцит-кумулюсные комплексы в чашку Петри. С помощью данной методики можно достаточно быстро получить большое количество ОКК из одного яичника. Ключевое преимущество данной методики - высокая скорость работы, а также максимальный выход ОКК со всей поверхности яичника. Недостатком методики является то, что ооциты выделяются сразу из всех фолликулов, при этом невозможно идентифицировать, из какого фолликула получен тот или иной ОКК. После проведения овариальной резекции в промывочной среде, исследуемой под микроскопом, остаются ткани резецированного яичника, что усложняет поиск ОКК, а лезвие устройства начинает заметно тупиться после резекции 2-3 яичников [1].
После завершения овариальной резекции рассечённый яичник промывается в среде, после чего она исследуется на наличие гамет с использованием бинокулярной лупы [2, 3].
Результаты исследования. Нами проведён эксперимент, в котором сравнивались методики фолликулярной аспирации и овариальной резекции (таблица). Всего в эксперименте было использовано 19 яичников крупного рогатого скота голштинской породы, полученных после убоя. На каждом яичнике было подсчитано количество видимых фолликулов и их диаметр. Далее проводилась фолликулярная аспирация по методике, описанной выше. После подсчёта количества полученных ОКК методикой фолликулярной аспирации производилась овариальная резекция этих же яичников. После этого также подсчитывалось количество дополнительно полученных ОКК.
Таблица. Сравнение методик фолликулярной аспирации и овариальной резекции Table. Comparing follicular aspiration and ovarian resection methods
Показатели Количество видимых фолликулов Методика фолликулярной аспирации, ОКК Методика овариальной резекции, ОКК Итого ОКК
диаметр до 2 мм диаметр 2-6 мм диаметр 6-10 мм фолликулов всего
Всего 159 65 10 235 75 82 157
Среднее 8,37 3,82 2,0 12,37 3,95 4,32 8,26
Стандартное отклонение 4,45 3,47 0,71 6,02 2,22 4,58 6,39
Стандартная ошибка 1,02 0,84 0,32 1,38 0,51 1,05 1,47
На один яичник насчитывалось в среднем 12,37 фолликулов, из которых 8,37 -диаметром до 2 мм, что соответствует размерам примордиальных фолликулов, около 3,8 фолликула - диаметром 2-6 мм, что соответствует размерам преантральных фолликулов, и около 2 фолликулов - диаметром 6-10 мм, что соответствует размерам антральных и доминантных фолликулов [3, 4].
В среднем из одного яичника методикой фолликулярной аспирации получено 3,95 ОКК, что соответствует 47,8% от общего количества ОКК, полученных двумя методиками. Далее методикой овариальной резекции с каждого яичника было дополнительно получено в среднем 4,32 ОКК, что соответствует 52,2% от всех полученных ОКК.
Выводы. Таким образом, можно сделать вывод о том, что методика овариальной резекции эффективнее методики фолликулярной аспирации более чем в два раза и рекомендуется к применению для более высокого выхода ОКК, используемых для получения эмбрионов in vitro post mortem. Использование только методики овариальной резекции снижает затраты времени и расходных материалов, а также способно показывать такие же результаты, как и использование двух этих методик последовательно.
Список источников литературы
1. Патент № 2745425 C1 Российская Федерация, МПК A01N 1/00. Способ выделения и дозревания незрелых ооцит-кумулюсных комплексов из ткани яичника после овариэктомии: № 2020129262: заявл. 04.09.2020: опубл. 25.03.2021 / А. О. Кирилова, Е. С. Буняева; заявитель федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова» Министерства здравоохранения Российской Федерации.
2. Ротарь, Л.Н. Влияние морфофункционального состояния яичников коров черно-пестрой породы на выход ооцит-кумулюсных комплексов / Л. Н. Ротарь, Е. И. Алимова, Т. Э. Позднякова // Научное обеспечение развития АПК в условиях импортозамещения : сборник научных трудов по материалам международной научно-практической конференции, посвящённой 115-летию Санкт-Петербургского государственного аграрного университета, Санкт-Петербург - Пушкин 24-26 января 2019 года. Часть I. - Санкт-Петербург - Пушкин: Санкт-Петербургский государственный аграрный университет, 2019. - С. 257-260.
3. Ротарь, Л.Н., Souza, J.F. Морфологическая характеристика ооцит-кумулюсных комплексов Bos taurus и Bos indicus разного направления продуктивности // Российская сельскохозяйственная наука. 2019. №3. C. 64-67. - DOI: https://doi.org/10.31857/S2500-26272019364-67.
4. Симоненко, В.П., [и др.] Цитологические, цитогенетические показатели гамет, физиологическое состояние яичников коров и жизнеспособность полученных эмбрионов // Актуальные проблемы интенсивного развития животноводства. - 2020. - № 23. - С. 13-21.
5. Aguila, L., Treulen, F., Therrien, J., Felmer, R., Valdivia, M., Smith, L.C. Oocyte Selection for In Vitro Embryo Production in Bovine Species: Noninvasive Approaches for New Challenges of Oocyte Competence. Animals. 2020; 10(12):2196. DOI: https://doi.org/10.3390/ani10122196.
6. Deize de Cássia Antonino, Mayara Mafra Soares, Jairo de Melo Júnior, Paula Batista de Alvarenga, Renata de Freitas Ferreira Mohallem, Carina Diniz Rocha, Luis Alberto Vieira, Aline Gomes de Souza, Marcelo Emilio Beletti, Benner Geraldo Alves, José Octavio Jacomini, Luiz Ricardo Goulart, Kele Amaral Alves, Three - dimensional levitation culture improves in-vitro growth of secondary follicles in bovine model, Reproductive BioMedicine Online, V. 38, I. 3, 2019, рр. 300-311, DOI: https://doi.org/10.1016/j .rbmo.2018.11.013.
7. Ferré, L.B., Kjelland, M.E., Strabech, L.B., Hyttel, P., Mermillod, P., Ross, P.J. Review: Recent advances in bovine in vitro embryo production: reproductive biotechnology history and methods, Animal, V. 14, I. 5, 2020, рр. 991-1004, ISSN 1751-7311, DOI: https://doi.org/10.1017/S1751731119002775.
8. Jason, R. Herrick, Assisted reproductive technologies for endangered species conservation: developing sophisticated protocols with limited access to animals with unique reproductive mechanisms, Biology of Reproduction, Volume 100, Issue 5, May 2019, рр. 1158-1170, DOI: https://doi.org/10.1093/biolre/ioz025.
9. Martinez, E.A., Martinez, C.A., Cambra, J.M., et al. Achievements and future perspectives of embryo transfer technology in pigs. Reprod Dom Anim. 2019; 54 (Suppl. 4): рр. 4-13. DOI: https://doi.org/10.1111/rda.13465.
10. Sjunnesson, Y. (2019). In vitro fertilisation in domestic mammals - a brief overview. Upsala Journal of Medical Sciences, 125(2), рр. 68-76. DOI: https://doi.org/10.1080/03009734.2019.1697911.
References
1. Patent № 2745425 C1 Russian Federation, MPK A01N 1/00. Method of isolation and ripening of immature oocyte-cumulus complexes from ovarian tissue after ovariectomy: No. 2020129262: application. 04.09.2020: publ. 25.03.2021 / A.O. Kirilova, E.S. Bunyaeva; applicant Federal State Budgetary Institution "National Medical Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology named after Academician V.I. Kulakov" Ministry of Health of the Russian Federation.
2. Rotar, L.N. Influence of morphofunctional state of ovaries of black-motley breed cows on the yield of oocyte-cumulus complexes / L. N. Rotar, E. I. Alimova, T. E. Pozdnyakova // Scientific support of development of agroindustrial complex under import substitution: collection of scientific papers on materials of international scientific and practical conference, dedicated to the 115th anniversary of St. Petersburg State Agrarian University, St. Petersburg - Pushkin, 24 - 26 January 2019. Volume Part I. - St. Petersburg - Pushkin: St. Petersburg State Agrarian University, 2019. - pp. 257-260.
3. Rotar, L.N., Souza, J.F. Morphological characterization of oocyte - cumulus complexes of Bos taurus and Bos indicus of different productivity direction // Russian Agricultural Science. - 2019. - №3. -pp. 64-67. DOI: https://doi.org/10.31857/S2500-26272019364-67.
4. Simonenko, V.P. et al. Cytological, cytogenetic parameters of gametes, physiological state of ovaries of cows and the viability of obtained embryos // Actual problems of intensive development of animal husbandry. 2020. №23. pp. 13-21.
5. Aguila, L., Treulen, F., Therrien, J., Felmer, R., Valdivia, M., Smith, L.C. Oocyte Selection for In Vitro Embryo Production in Bovine Species: Noninvasive Approaches for New Challenges of Oocyte Competence. Animals. 2020; 10(12):2196. DOI: https://doi.org/10.3390/ani10122196.
6. Deize de Cássia Antonino, Mayara Mafra Soares, Jairo de Melo Júnior, Paula Batista de Alvarenga, Renata de Freitas Ferreira Mohallem, Carina Diniz Rocha, Luis Alberto Vieira, Aline Gomes de Souza, Marcelo Emilio Beletti, Benner Geraldo Alves, José Octavio Jacomini, Luiz Ricardo Goulart, Kele Amaral Alves, Three - dimensional levitation culture improves in - vitro growth of secondary follicles in bovine model, Reproductive BioMedicine Online, V. 38, I. 3, 2019, рр. 300-311, DOI: https://doi.org/10.1016/j .rbmo.2018.11.013.
7. Ferré, L.B., Kjelland, M.E., Strabech, L.B., Hyttel, P., Mermillod, P., Ross, P.J. Review: Recent advances in bovine in vitro embryo production: reproductive biotechnology history and methods, Animal, V. 14, I. 5, 2020, рр. 991-1004, ISSN 1751-7311, DOI: https://doi.org/10.1017/S1751731119002775.
8. Jason R., Herrick, Assisted reproductive technologies for endangered species conservation: developing sophisticated protocols with limited access to animals with unique reproductive mechanisms, Biology of Reproduction, Volume 100, Issue 5, May 2019, рр. 1158-1170, DOI: https://doi.org/10.1093/biolre/ioz025.
9. Martinez, E.A., Martinez, C.A., Cambra, J.M., et al. Achievements and future perspectives of embryo transfer technology in pigs. Reprod Dom Anim. 2019; 54 (Suppl. 4): рр. 4-13. DOI: https://doi.org/10.1111/rda.13465. 10.Sjunnesson, Y. (2019). In vitro fertilisation in domestic mammals - a brief overview. Upsala Journal of Medical Sciences, 125(2), рр. 68-76. DOI: https://doi.org/10.1080/03009734.2019.1697911.
Cведения об авторах
Шульгин Илья Константинович - аспирант, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Санкт-Петербургский государственный аграрный университет», ассистент ветеринарного врача ООО «НОВА КОРОВА» spin-код: 4104-0828, AuthorID: 1108910.
Ротарь Любовь Николаевна - кандидат биологических наук, доцент кафедры генетики, разведения и биотехнологии животных, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Санкт-Петербургский государственный аграрный университет», ведущий эмбриолог ООО «НОВА КОРОВА» spin-код: 6515-9936, AuthorID: 1072165.
Шульгина Валерия Денисовна - ассистент эмбриолога ООО «НОВА КОРОВА» spin-код: 1854-6694, AuthorID: 1108750.
Information about the authors
Ilya K. Shulgin - postgraduate student, Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Education "St. Petersburg State Agrarian University", Veterinary assistant LLC «NOVA KOROVA» spin-code: 41040828, AuthorID: 1108910.
Lyubov N. Rotar - Candidate of Biological Sciences, Associate Professor of the Department of Genetics, Breeding and Biotechnology of Animals, Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Education "St. Petersburg State Agrarian University", Lead Embryologist LLC «NOVA KOROVA» spin-code: 65159936, AuthorID: 1072165.
Valeriya D. Shulgina - Assistant Embryologist LLC «NOVA KOROVA» spin-code: 1854-6694, AuthorID: 1108750.
Авторский вклад. Все авторы настоящего исследования принимали непосредственное участие в планировании, выполнении и анализе данного исследования. Все авторы настоящей статьи ознакомились и одобрили представленный окончательный вариант. Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Author's contribution. All authors of this research paper have directly participated in the planning, execution, or analysis of this study. All authors of this paper have read and approved the final version submitted. Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Статья поступила в редакцию 27.02.2023; одобрена после рецензирования 24.05.2023; принята к публикации 16.06.2023.
The article was submitted 2 7.02.2023; approved after reviewing 24.05.2023; accepted after publication 16.06.2023.
