CC BY
65
&
БИОМЕДИЦИНА • № 1 2005, с. 108-111
КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
Сравнение кластогенного эффекта канцерогена бенз(а)пирена у мышей, выращенных в гнотобиологическом изоляторе и в открытой среде
Т.Б. Бескова, А.М. Малашенко, Л.А. Болотских
Научный центр биомедицинских технологий РАМН, Москва
Самкам мышей BALB/c в возрасте 6 месяцев был введен раствор бенз(а)пирена. Сопоставлен кластогенный эффект канцерогена у конвенциональных и SPF мышей. Различия в реакции на введение БаП между этими группами не обнаружены. Результаты предполагают возможность использования гнотобиологических изоляторов для выращивания и содержания животных, предназначенных для тестирования химических соединений.
Ключевые слова: гнотобиологический изолятор, инбредные мыши, канцероген, мутагенез.
Надежность и точность результатов исследований биологической активности химических соединений на лабораторных животных в существенной степени зависит от качества животных. При изучении эффекта химических соединений, подавляющих активность иммунной системы, особенно в длительных эксперимента, у конвенциональных животных активизируется патогенная и условно-патогенная микрофлора, что вызывает искажение реакции и даже гибель животных. Поэтому для подобных работ рекомендуется использовать животных, свободных от патогенной микрофлоры (SPF). Животные SPF производятся в помещениях барьерного типа, которые в питомниках РАМН (основных производителях животных) еще не еще не функционируют. Второй способ производства SPF животных — разведение в гнотобиологических изоляторах. Однако в этом случае животные выращиваются в изолированном полихлорвиниловой пленкой пространстве, и возникает вопрос — не могут ли вещества, выделяемые из пленки во внутреннюю среду изолято-
108
ра, изменять реакции животных. Цель настоящей работы — проверить это предположение и оценить возможность использования мышей SPF, получаемых в гното-биологическом изоляторе в исследованиях канцерогенеза.
Мы исследовали кластогенную активность бенз(а)пирена (БаП) в клетках костного мозга мышей. Этот метод рассматривается как один из краткосрочных тестов оценки канцерогенов [2].
Известно, что для БаП наблюдается корреляция мутагенной и канцерогенной активностей. БаП является типичным по-лициклическим углеводородом. Соединения этой группы проявляют канцерогенную активность после метаболической активации, и, следовательно, можно ожидать, что при наличии в окружающей среде или корме факторов, подавляющих или активизирующих энзимы, участвующие в метаболизации, эффект канцерогена будет изменен.
Известно, что чувствительность к индукции опухолей БаП у мышей детерминирована генетически, и линии мышей
І І І І І
Сравнение кластогенного эффекта канцерогена бенз(а)пирена у мышей ...
различаются по частотам опухолей, индуцируемых БаП [5]. В цитируемой работе частота опухолей варьировала от 8 до 50% у мышей разных линий. У мышей линии БЛЬБ/е, использовавшихся в нашей работе, БаП (в дозе 0,004 мг/кг) индуцировал саркомы с частотой 23% у самцов и 21% у самок. Опубликованы данные о мутагенной активности БаП: индукции доминантных летальных мутаций в половых клетках самцов мышей [4], индукции хромосомных нарушений в клетках костного мозга [3]. Позднее БаП был использован в числе других соединений в программе ВОЗ, организованной для сравнения чувствительности тестов на мутагенность и определении их ценности как индикаторов канцерогенности [2, 3, 6].
Материалы и методы
Использованные в данной работе мыши инбредной линии ВЛЬВ/^РИ, свободные от патогенной микрофлоры, были получены из Института молекулярной генетики Чешской Академии наук, где они содержались в барьерном помещении. Мышей размножали в гнотобиологических изоляторах с момента поступления в НИЛ биомоделей (ныне ГУ НЦБМТ РАМН). Для настоящего эксперимента рожденные в изоляторе самки БЛЬБ/е содержались в изоляторе «Анимед» до опыта в течение 6 месяцев. Вторую группу составили из самок того же возраста этой линии, полученных от конвенциональных мышей, размножающихся в открытом виварии.
Изолятор «Анимед», использующийся для разведения SPF мышей, имеет следующие размеры (мм): длина — 3200, высота — 1800, ширина — 1100. Камера изолятора изготовлена из поливинилхлоридной пленки толщиной 150 мкм. Система очистки и подачи воздуха содержит фильтр предварительной очистки, входной и выходной фильтры тонкой очистки, два вентилятора.
В камере размещается до 30 клеток типа Т2. При обслуживании соблюдались все правила гнотобиотехнологии. Животные получали гранулированную диету ПК-120-10 Вороновского комбикормового завода. Размещали животных по 6 особей в клетке.
БаП был получен от фирмы Ьопеа81ег Ь1ё. Соединение растворяли в оливковом масле и вводили внутрибрюш-но в дозах 200 и 400 мг на 1 кг массы тела. В контроле использовали интактных самок аналогичного возраста (5—6 месяцев).
Хромосомные препараты клеток костного мозга готовили по принятой методике [1] через 24 часа после введения канцерогена. На каждую группу, состоящую из 6 самок, просмотрено по 600 метафаз. Учитывали пробелы и хромосомные аберрации. Статистическую обработку данных выполняли общепринятыми методами.
Результаты и обсуждение
В эксперименте зарегистрирован достаточно четкий эффект, зависящий от дозы БаП. Результаты хромосомного анализа представлены в таблице. БаП индуцирует сравнительно невысокие частоты хромосомных нарушений (по сравнению с ал-килирующими соединениями), регистрируются пробелы и делеции (хроматидные и изохроматидные фрагменты), другие типы структурных аберраций отсутствуют.
Если избрать в качестве основного признака для оценки эффекта частоту клеток с нарушениями всех типов, то средние частоты клеток с хромосомными нарушениями отличаются от уровня контроля с достоверностью р<0.01 (200 мг/кг) и р<0.001 (400 мг/кг). Оценка разности проводилась по методу Фишера (см. таблицу).
Совершенно очевидно, что нет различий между группами конвенциональных и SPF мышей. Следовательно, если в среду гнотобиологического изолятора и выделяются какие-либо продукты из ПВХ-плен-
Т.Б. Бескова, А.М. Малашенко, Л.А. Болотских
Частота и спектр хромосомных нарушений в клетках костного мозга мышей BALB/c после воздействия канцерогена бенз(а)пирена
Г руппа животных Доза, мг/кг Проанали- зировано клеток Количество клеток, содержащих:
пробелы фрагменты структурные аберрации (%) нарушения хромосом, включая пробелы (%)
хроматид- ные изохрома- тидные
1 0 600 3 3 — 3 (0.5) 6 (1.0+1.0)
2 0 600 1 2 2 (0.3) 3 (0.5±0.7)
1 200 600 5 9 9(1.5) 14 (2.3±1.5)
2 200 600 4 12 1 13(2.2) 17 (2.7±2.2)
1 400 600 5 14 5 19(3.2) 24 (4.2±2.0)
2 400 600 9 12 4 16(2.5) 25 (4.2±2.0)
В графе «Группа животных» использованы следующие условные обозначения:
1 — мыши BALB/c, выращенные в гнотобиотическом изоляторе;
2 — конвенциональные мыши BALB/c.
Различия между 1 и 2 при всех дозах недостоверны ф > 0,05).
ки, то при принятой интенсивности вентиляции они не оказывают заметного влияния на реакцию мыши на ксенобиотик.
Полученные данные хорошо согласуются с результатами работы [6]. В предыдущей работе эффект БаП (доза 252 мг/кг) был исследован у мышей линий ТРБ/У, т/Х 101/Н, C57BL/6J, CBA/CaLac. Линии приведены в порядке уменьшения чувствительности (максимум — 6.4%, минимум — 2.8%). Линия ВАЬВ/с была использована аналогично работе [3] при введении дозы 252 мг/кг, частота клеток с хромосомными нарушениями — 1.8%. Следовательно, линия ВАЬВ/с относительно устойчива и близка по чувствительности к СВА/Ьас. Интересно, что распределение линий по чувствительности к БаП точно совпадает с найденными в опытах с алкилирующими мутагенами (тио-ТЭФ, ЭМС и др.) [1, 3].
Таким образом, данный эксперимент свидетельствует о возможности использования гнотобиологических изоляторов для выращивания и содержания мышей, предназначенных для исследования кластогенного эффекта химических соединений.
110
Литература
Суркова Н.И., Малашенко А.М. Мутагенный эффект тио-ТЭФ у лабораторных мышей. Сообщение 2. Цитогенетический анализ повреждений в клетках костного мозга мышей. Генетика, 1974, т. 10, с. 81-87.
Adler I.D. Summary report on the performance of the in vivo mammalian cell cytogenetics chromosome aberrations — metaphase analysis assays. In: Evaluation of short-term tests for carcinogens. Eds. Ashby J. et al. WHO, Cambridge Univ. Press, 1988, 1.91—1.97.
Coton C., Leonard A., Decat G. Induction of chromosome aberrations in BALB/c mouse bone marrow cells. In: Evaluation of short-term tests for carcinogens. Eds. Ashby J. et al. WHO, Cambridge Univ. Press, 1988, 1.08—1.111. Generoso W.M., Cain K.T., Hellwig C.S., Cacheiro N.L. Lack of association between induction of dominant-lethal mutations and induction of heritable translocations with benzo-(a)pyrene in postmeiotic germ cells of mice. Mutat. Res., 1982, v. 94, 155-163.
Liebelt R.A., Suzuki S., Liebelt A.G., Lane M. Virus-like particles in chemically induced sarcomas in high- and low-leukemia strains of mice. Cancer Res., 1970, v. 30, 2438.
Сравнение кластогенного эффекта канцерогена бенз(а)пирена у мышей ...
Malashenko A.M., Uvarova T.B. A study of the inbred strains of mice. In: Evaluation of short-
ability of benzo(a)pyrene, pyrene, 2-acetyl- term tests for carcinogens. Eds. Ashby J. et al.
aminofluorene and 4-acetylaminofluorene to WHO, Cambridge Univ. Press, 1988, 1.115-
damage bone marrow cell chromosomes in fine 1.118.
COMPARISON OF BENZO(A)PYRENE CARCINOGEN CLASTOGENIC EFFECT IN MICE REARED IN GNOTOBIOTIC ISOLATOR AND IN CONVENTIONAL
ENVIRONMENT
T.B. Beskova, A.M. Malashenko, L.A. Bolotskih
Research Center for Biomedical Technologies of RAMS, Moscow
Benzo(a)pyrene solution was injected into 6-month-old mice females BALB/cJPh. Clastogenic effect in conventional and SPF mice reared in gnotobiotic isolator was compared. There was no difference in reaction to BaP between these groups. The results suggest the possibility of gnotobiotic isolators use for breeding and keeping the animals for chemical compounds testing.
Key words: gnotobiological isolator, inbred mice, carcinogen, mutagenesis.
