CC BY
2
микробиология и вирусология microbiology and virology
сравнение эффективности использования твёрдых питательных сред при культивировании изолятов neisseria gonorrhoeae в лабораторных условиях
резюме
Носов Н.ю., Шагабиева ю.З., Шпилевая М.В., Соломка В.С.
ФГБУ «Государственный научный центр дерматовенерологии и косметологии» Минздрава России (107076, г. Москва, ул. Короленко, 3, стр. 6, Россия)
Автор, ответственный за переписку: Шпилевая марина Валентиновна,
e-mail: aniram1970@list.ru
Обоснование. Neisseria gonorrhoeae - факультативно анаэробный микроорганизм, крайне требовательный к составу питательной среды и условиям культивации. В ситуации нарастающего дефицита и увеличения стоимости зарубежных компонентов для приготовления твёрдых питательных сред актуальным является исследование возможности выращивать труднокультивируемые микроорганизмы на питательных средах отечественного производства.
Цель исследования. Проведение оценки роста колоний возбудителя гонококковой инфекции на двух типах твёрдых питательных сред - шоколадном агаре с ростовыми и селективными добавками, приготовленном с использованием импортных реагентов, и шоколадном агаре с ростовыми добавками производства российской компании ООО «Гем» (Москва). Материалы и методы. В исследовании был использован контрольный штамм N. gonorrhoeae NCTC12700/АТСС49226 и два вида шоколадного агара: приготовленный в ФГБУ «Государственный научный центр дерматовенерологии и косметологии» Минздрава России с использованием импортных компонентов и от отечественного производителя ООО «Гем». Результаты. Была выявлена равноценность ростовых свойств исследованных питательных сред при культивировании чистой культуры гонококка.
Заключение. Готовый к использованию шоколадный агар с ростовыми добавками производства ООО «Гем» может успешно использоваться в лаборатории для культивирования чистой культуры N. gonorrhoeae. Первичное выделение штаммов N. gonorrhoeae из клинического материала более целесообразно проводить на среде, обеспечивающей подавление роста посторонней микрофлоры за счёт включения антибиотикосодержащей добавки. Организация производства отечественных бактериологических сред для микроорганизмов с высокими питательными потребностями снижает зависимость отечественной микробиологии от импорта и обеспечивает быструю их доставку в лаборатории.
Ключевые слова: Neisseria gonorrhoeae, питательная среда, лабораторная диагностика, шоколадный агар, селективная добавка, Isovitalex, VCAT, ингибитор Мартина и Льюиса
Статья поступила:16.02.2023 Статья принята: 13.06.2023 Статья опубликована: 11.07.2023
для цитирования: Носов Н.Ю., Шагабиева Ю.З., Шпилевая М.В., Соломка В.С. Сравнение эффективности использования твёрдых питательных сред при культивировании изолятов Neisseria gonorrhoeae в лабораторных условиях. Acta biomedica scientifica. 2023; 8(3): 90-95. doi: 10.29413/ABS.2023-8.3.9
comparison of the effectiveness of solid nutrient medium in the in vitro cultivation of neisseria gonorrhoeae isolates
ABSTRACT
Nosov N.Yu., Shagabieva Yu.Z., Shpilevaya M.V., Solomka V.S.
State Scientific Center of Dermatovenerology and Cosmetology (Korolenko str. 3, build. 6, Moscow 107076, Russian Federation)
Corresponding author: Marina V. Shpilevaya,
e-mail: aniram1970@list.ru
Background. Neisseria gonorrhoeae is a facultatively anaerobic microorganism which is extremely demanding to the composition of a nutrient media and cultivation conditions. In a situation of the increasing shortage and cost of foreign components for the preparation of solid nutrient media, it is important to study the possibility of growing hard-to-cultivate microorganisms on domestically produced nutrient media.
The aim of the study. To evaluate the growth of gonococcus colonies on two types ofsolid nutrient media - chocolate agar with growth and selective additives prepared using imported reagents and chocolate agar with growth additives manufactured by "Gem LTD" (Moscow, Russian Federation).
Materials and methods. A reference strain of N. gonorrhoeae NCTC 12700/ ATCC 49226 and two types of chocolate agar (the first one - prepared in the State Scientific Center of Dermatovenerology and Cosmetology using imported components and the other one - from the domestic manufacturer "Gem LTD") were used in the research.
Results. The equivalence of the growth properties of both studied types of nutrient media when cultivating pure gonococcus was revealed.
Conclusions. Ready-to-use chocolate agar with growth additives produced by "Gem LTD" can be successfully used in the laboratory for the cultivation of N. gonorrhoeae pure culture. Primary isolation of N. gonorrhoeae strains from clinical material is more appropriate to carry out on a medium that suppresses the growth of foreign microflora due to the inclusion of antibiotic additive. The organization of production of domestic bacteriological media for microorganisms with high nutrient requirements reduces the dependence of domestic microbiology on import and ensures their rapid delivery to laboratories.
Key words: Neisseria gonorrhoeae, nutrient medium, laboratory diagnostics, chocolate agar, selective supplement, Isovitalex, VCAT, Martin and Lewis inhibitor
Received: 16.02.2023 For citation: Nosov N.Yu., Shagabieva Yu.Z., Shpilevaya M.V., Solomka V.S. Comparison
Ac«pted: 13.06.2023 of the effectiveness of solid nutrient medium in the in vitro cultivation of Neisseriagonor-
Published: 11.07.2023 rhoeae isolates. Acta biomedica scientifica. 2023; 8(3): 90-95. doi: 10.29413/ABS.2023-8.3.9
введение
Возбудитель гонококковой инфекции Neisseria gonorrhoeae является факультативно анаэробным микроорганизмом, требовательным к составу питательных сред и условиям культивирования. В принятой Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) «Глобальной стратегии сектора здравоохранения по инфекциям, передаваемым половым путём, 2016-2021» [1] гонорея указывается в качестве одной из трёх наиболее важных инфекций, передаваемых половым путём (ИППП), борьба с которыми требует неотложных и согласованных действий на межгосударственном уровне. Возбудитель гонококковой инфекции также был включён в «Список ВОЗ приоритетных возбудителей заболеваний для НИОКР в области создания новых антибиотиков» с высоким уровнем приоритетности [2]. Актуальность гонококковой инфекции определяется её способностью вызывать высокую заболеваемость среди лиц репродуктивного возраста с выраженным негативным воздействием на фертильность и повышать риск ко-инфицирования другими ИППП. Важно также отметить отсутствие средств специфической профилактики и прогрессирующую устойчивость N. gonorrhoeae к антимикробным препаратам [3].
Выделение чистой культуры гонококка - классический культуральный метод, который до сих пор является «золотым стандартом» диагностики гонореи. Принципиальным преимуществом метода является выделение жизнеспособной культуры Neisseria gonorrhoeae, которая используется для проведения дальнейших мо-лекулярно-биологических и генетических исследований, а также для оценки чувствительности микроорганизма к антимикробным препаратам, проводимой бактериологическим методом [4, 5].
Культуральная среда для выделения N. gonorrhoeae включает основу агара, предоставляющую питательные вещества в форме казеина и пептонов, фосфатный буфер для поддержания pH и кукурузный крахмал для нейтрализации токсичных жирных кислот, которые могут присутствовать в агаре. Гемоглобин из бычьей крови обеспечивает доставку X-фактора (гемин). Обогащающая добавка Isovitalex является источником витаминов, аминокислот, ко-энзимов, глюкозы, ионов железа и других факторов, улучшающих рост нейссерий. Селективная среда отличается от обычной культуральной среды тем, что содержит противомикробные агенты (например, ванкомицин, колистин и нистатин или другой противогрибковый агент), которые ингибируют рост других бактерий и грибков, не подавляя рост гонококков. Использование селективных сред способствует изоляции чистой культуры нейссерии, т. к. анатомический источник образца также обычно содержит другие виды бактерий, хотя было показано, что в редких случаях некоторые штаммы гонококков могут быть чувствительны к используемым концентрациям ван-комицина [6]. Среда для выделения N. gonorrhoeae
должна быть недорогой, но отличаться специфичностью и чувствительностью.
В ФГБУ «Государственный научный центр дерматовенерологии и косметологии» (ГНЦДК) Минздрава России в связи с практической реализацией в России международной программы GASP (Gonococcal Antimicrobial Surveillance Programme) [7] в 2008 г. был разработан пакет «Стандартных операционных процедур» (СОП), включающий «Стандартные операционные процедуры по проведению видовой идентификации возбудителя гонореи»[8]. В документе предложены среды для первичного выделения N. gonorrhoeae из клинических образцов и для последующего культивирования с целью определения антибиотикорезистентности. Для выделения N. gonorrhoeae используют шоколадный агар на основе GC Medium Agar Base. В соответствии с СОП, при приготовлении неселективной культуральной среды к основе GC Medium Agar Base добавляются бычий гемоглобин и ростовая добавка Isovitalex. Для получения селективного агара дополнительно вносится добавка VCAT (ингибитор Мартина и Льюиса), содержащая ванкомицин, колистин, анизомицин и триметоприм.
В связи с введением экономических санкций в отношении Российской Федерации со стороны США, стран Евросоюза и ряда других государств закупка продукции для бактериологических высокотехнологичных питательных сред ограничена, поэтому представляется актуальным поиск отечественных импортозамещающих питательных сред. Одной из отечественных компаний, осуществляющих промышленный выпуск готовых питательных сред с составом, пригодным для выращивания культур возбудителя гонококковой инфекции, является ООО «Гем» (Москва).
Целью настоящего исследования была оценка эффективности роста колоний N. gonorrhoeae на двух видах шоколадного агара - производства ООО «Гем» (специализированный агар для культивирования N. gonorrhoeae) и среды, приготовленной из реагентов импортного производства в соответствии с СОП.
материалы и методы
Для выращивания культуры N. gonorrhoeae использовали два вида шоколадного агара - производства компании ООО «Гем» и приготовленного согласно инструкции в СОП по проведению видовой идентификации возбудителя гонореи, разработанной в ФГБУ «ГНЦДК» Минздрава России.
Шоколадный агар производства компании ООО «Гем» представляет собой плотную питательную среду, приготовленную в соответствии с требованиями ТУ 9385-003-16665457-2013 [9]. В состав агара входит дефибринированная овечья кровь, которая обогащает среду железосодержащим пигментом гемином (фактор роста Х). Термостабильный гемин высвобождается из эритроцитов, когда кровь добавляется к основе
шоколадного агара при температуре около 80 °С. Для улучшения ростовых свойств питательной среды в охлаждённый до температуры 45-50 °С шоколадный агар дополнительно вносится термолабильный фактор V (НАД, никотинамидадениндинуклеотид), который участвует в окислительно-восстановительных реакциях. Готовая к использованию среда разливается в чашки Петри диаметром 90 мм. Чашки со средой герметично упаковываются в полиэтиленовые пакеты и хранятся в сухом защищённом от света месте при температуре 2-8 °С в течение 2 месяцев.
При приготовлении шоколадного агара в ФГБУ «ГНЦДК» Минздрава России в соответствии с СОП используются компоненты, имеющие импортное происхождение: GC Medium Agar Base производится индийскими или американскими фирмами (Pronadisa, Thermo Fisher Scientific, Becton Dickinson); гемоглобин бычий ли-офилизованный (Hemoglobin Bovine), Isovitalex и VCAT закупаются преимущественно у американского поставщика Becton Dickinson. Приготовление навесок и авто-клавирование основы агара и гемоглобина проводятся на базе лабораторного центра ФГБУ «ГНЦДК» Минздрава России; добавки вносятся непосредственно перед заливкой чашек. Используются чашки диаметром 90 мм, которые после заливки и подсушивания упаковываются в полиэтиленовые пакеты и хранятся при температуре 2-8 °С до 3 недель.
Для контроля качества сред использовали эталонный штамм N. gonorrhoeae NCTC 12700/ATCC 49226, рекомендованный для тестирования чувствительности к антибиотикам [10]. Штамм хранился в криосре-де при температуре -80 °С и за сутки до исследования со среды хранения был посеян в чашки Петри со средой, приготовленной в соответствии с СОП.
Из ночной культуры эталонного штамма готовили солевую суспензию, эквивалентную стандарту McFarland 0,5 - 108 колониеобразующих единиц в мл (КОЕ/мл), а на её основе - тестовые инокуляты 104, 103 и 102 КОЕ/мл. Посев каждого инокулята осуществляли на 3 чашки шоколадного агара каждого из производителей в объёме 0,1 мл, что соответствовало 103, 102 и 10 КОЕ. Для контроля стерильности по 3 чашки с шоколадным агаром каждого производителя инкубировали без посева.
Характер роста и количество выросших на поверхности агара колоний оценивали через 24 и 48 ч инкубации при 37 °С и повышенном (3-5 %) содержании СО2. При исследовании осуществляли качественный и количественный контроль роста N. gonorrhoeae на питательных средах. Качественный контроль основан на оценке характера роста тестовой культуры. Показателем количественного контроля был выход микробных клеток при посеве тестовых инокулятов.
результаты и обсуждение
Через 24 ч инкубации на всех трёх чашках с шоколадным агаром производства ООО «Гем» отмечен
рост колоний размером до 0,5 мм в диаметре, непрозрачных, округлой формы. Количество выросших колоний было прямо пропорционально количеству посеянных (рис. 1), а именно: на чашках с посевом 103 КОЕ/мл выросло в среднем 750 колоний N. gonorrhoeae на чашку, с посевом 102 КОЕ/мл - 90 колоний, с посевом 10 КОЕ/мл - 7 колоний. На всех чашках со средой, приготовленной в соответствии с СОП, рост колоний спустя сутки после посева отсутствовал, но через 48 ч колонии нейссерий появились в следующих количествах: на чашках с посевом 103 КОЕ/мл их количество выросло в среднем до 950 колоний на чашку; на чашках с посевом 102 КОЕ/мл - до 80 колоний; на чашках с посевом 10 КОЕ/мл - до 7 колоний. Независимо от среды культивирования все колонии были серого цвета, с блестящей поверхностью, непрозрачные, выпуклые, округлой формы, 1,5-2 мм в диаметре. Принадлежность микроорганизмов к роду Neisseria подтверждалась оксидаз-ным тестом: на выросшие колонии наносили одну каплю реагента тетраметил-пара-фенилендиамин-дигидрохлорида, через 10 с колонии приобретали синюю окраску (рис. 2).
РИС. 1.
Колонии N. gonorrhoeae на шоколадном агаре производства ООО «Гем» через 24 ч после посева 10 КОЕ на чашку FIG. 1.
N. gonorrhoeae colonies on chocolate agar manufactured by "Gem LTD" 24 hours after inoculation with 10 CFU per plate
На контрольных чашках, на которых не производился посев, спустя 24 и 48 ч инкубации не отмечался рост посторонней микрофлоры, что подтверждает факт отсутствия контаминации питательных сред на всех этапах приготовления.
РИС. 2.
Колонии N. gonorrhoeae на шоколадном агаре производства ООО «Гем» через 48 ч после посева 100 КОЕ на чашку: оксидаз-ный тест FIG. 2.
N. gonorrhoeae colonies on chocolate agar manufactured by "Gem LTD" 48 hours after inoculation with 100 CFU per plate: oxidase test
Таким образом, шоколадный агар - как приготовленный в соответствии с СОП, так и производства компании «Гем» - обеспечивает рост и проявление типичных культурально-морфологических свойств гонококка в течение 24-48 ч. Более позднее появление колоний N. gonorrhoeae на среде, приготовленной в соответствии с СОП, объясняется наличием селективной добавки VCAT, содержащей атимикробные препараты (ванкомицин, колистин, анизомицин и триметоприм), задерживающие, в том числе, и рост гонококка.
заключение
Проведённое исследование показало равноценность ростовых свойств шоколадного агара, приготовленного как в соответствии с СОП, так и в компании «Гем». Оба вида культуральной среды поддерживают рост тестового штамма гонококка даже при таком низком уровне тестового посева, как 102 КОЕ/мл, что важно при выделении чистой культуры гонококка из клинического материала.
Готовый к использованию шоколадный агар с ростовыми добавками производства ООО «Гем» может успешно использоваться в лаборатории для культивирования чистой культуры N. gonorrhoeae, в частности для проведения работ по плановому пересеву ко-
лоний в рамках коллекционной или иной лабораторной и экспериментальной деятельности. При добавлении к агару селективных компонентов он может быть испытан на выделение патогенных нейссерий также из клинических образцов. Таким образом, в условиях экономических и иных санкций, приводящих к ограничению ввоза реагентов для приготовления питательных сред зарубежного производства, наличие отечественных сред высокого качества для работ с трудно-культивируемыми микроорганизмами, к которым относится N. gonorrhoeae, является особо важным для непрерывного осуществления работ по мониторингу антимикробной резистентности.
Конфликт интересов
Авторы данной статьи заявляют об отсутствии конфликтов интересов.
литература / references
1. World Health Organization. Global health sector strategy on sexually transmitted infections, 2016-2021. URL: https://www. who.int/publications/i/item/WHO-RHR-16.09 [date of access: 11.04.2023].
2. WHO publishes list of bacteria for which new antibiotics are urgently needed. 27.02.2017. URL: https://www.who.int/ru/ news/item/27-02-2017-who-publishes-list-of-bacteria-for-which-new-antibiotics-are-urgently-needed/ [date of access: 11.04.2023].
3. Кубанов А.А., Соломка В.С., Рахматулина М.Р., Дерябин Д.Г. Устойчивость Neisseria gonorrhoeae к антимикробным препаратам и средства терапии гонококковой инфекции: вчера, сегодня, завтра. Вестник дерматологии и венерологии. 2022; 98(3): 15-23. [Kubanov AA, Solomka VS, Rakhmatulina MR, Deryabin DG. Antimicrobial resistance of Neisseria gonorrhoeae and gonococcal infection therapy: Yesterday, today, tomorrow. Vestnik dermatologii i venerologii. 2022; 98(3): 15-23. (In Russ.)]. doi: 10.25208/vdv1317
4. Общероссийская общественная организация «Российское общество дерматовенерологов и косметологов», Российское общество акушеров-гинекологов. Гонококковая инфекция: клинические рекомендации. 2021. [All-Russian Public Organization "Russian Society of Dermatovenereologists and Cosmetologists", Russian Society of Obstetricians and Gynecologists. Gonococcal infection: Clinical guidelines. 2021. (In Russ.)]. URL: https://legalacts. ru/doc/klinicheskie-rekomendatsii-gonokokkovaja-infektsija-utv-minzdravom-rossii/ [date of access: 11.05.2023].
5. Рэдклиф К. Европейские стандарты диагностики и лечения заболеваний, передаваемых половым путем. М.: Медицинская литература; 2021. [Radcliffe K. European standards for diagnosis and treatment of sexually transmitted diseases. Moscow: Meditsinskaya literatura; 2021. (In Russ.)].
6. Mirrett S, Reller LB, Knapp JS. Neisseria gonorrhoeae strains inhibited by vancomycin in selective media and correlation with auxotype. J Clin Microbiol. 1981; 14: 94-99. doi: 10.1128/ jcm.14.1.94-99.1981
7. Wi T, Lahra MM, Ndowa F, Bala M, Dillon J-AR, Ramon-Pardo P, et al. Antimicrobial resistance in Neisseria gonorrhoeae: Global surveillance and a call for international collaborative
action. PLoS Med. 2017; 14(7): e1002344. doi: 10.1371/journal. pmed.1002344
8. Кубанова А.А., Кубанов А.А., Фриго Н.В., Полевщико-ва С.А., Соломка В.С., Лесная И.Н., и др. Стандартные операционные процедуры по проведению видовой идентификации возбудителя гонореи. Сборник стандартных операционных процедур (СОП № ГОН 003/04; СОП № ГОН 004/04; СОП № ГОН 005/04). М.: ООО «ДЭКС-ПРЕСС»; 2008. [Kubanova AA, Kubanov AA, Frigo NV, Polevshchikova SA, Solomka VS, Lesnaya IN, et al. Standard operating procedures for species identification of the gonorrhea pathogen. Collection of standard operating procedures (SOP No. GON 003/04; SOP No. GON 004/04; SOP No. GON 005/04). Moscow: OOO «DEKS-PRESS»; 2008. (In Russ.)]. URL: https://www.cnikvi.ru/upload/ files/369_SOP_ident_gonorei.pdf [date of access: 11.04.2023].
9. Плотная питательная среда для выделения прихотливых микроорганизмов, готовая к использованию, шоколадный агар с ростовыми добавками по ТУ 9385-00316665457-2013: Регистрационное удостоверение на медицинское изделие № РЗН 2014/2242 от 31.12.2014. [Dense nutrient medium for the isolation of fastidious microorganisms, ready to use, chocolate agar with growth additives according to TU 9385-00316665457-2013: Registration certificate for a medical device No. RZN 2014/2242 d.d. from 31.12.2014. (In Russ.)]. URL: https:// nevacert.ru/reestry/med-reestr/rzn-2014-2242-2796 [date of access: 11.04.2023].
10. CLSI methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically: Approved standard; 9th ed. Wayne, PA; 2014.
Сведения об авторах
Носов Никита Юрьевич - кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник отдела лабораторной диагностики ИППП и дерматозов, ФГБУ «Государственный научный центр дерматовенерологии и косметологии» Минздрава России, e-mail: nnosov@cnikvi.ru, https://orcid.org/0000-0002-3967-8359
Шагабиева Юлия Зинуровна - кандидат химических наук, старший научный сотрудник отдела лабораторной диагностики ИППП и дерматозов, ФГБУ «Государственный научный центр дерматовенерологии и косметологии» Минздрава России, e-mail: shagabieva1412@mail.ru, https://orcid.org/0000-0002-7595-0276
Шпилевая Марина Валентиновна - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник отдела лабораторной диагностики ИППП и дерматозов, ФГБУ «Государственный научный центр дерматовенерологии и косметологии» Минздрава России, e-mail: shpilevaya@cnikvi.ru, https://orcid.org/0000-0002-9957-4009
Соломка Виктория Сергеевна - доктор биологических наук, советник директора по науке, ФГБУ «Государственный научный центр дерматовенерологии и косметологии» Минздрава России; e-mail: solomka@cnikvi.ru, https://orcid.org/ 0000-00026841-8599
Information about the authors
Nikita Yu. Nosov- Cand. Sc. (Biol.), Leаding Research Officer at the Department of Laboratory Diagnostics of Sexually Transmitted Infections and Dermatosis, State Scientific Center of Dermatovenerology and Cosmetology, e-mail: nnosov@cnikvi.ru, https://orcid.org/0000-0002-3967-8359
Yulia Z. Shagabieva - Cand. Sc. (Chem.), Senior Research Officer at the Department of Laboratory Diagnostics of Sexually Transmitted Infections and Dermatosis, State Scientific Center of Dermatovenerology and Cosmetology, е-mail: shagabieva1412@mail.ru, https://orcid.org/0000-0002-7595-0276
Marina V. Shpilevaya - Cand. Sc. (Biol.), Senior Research Officer at the Department of Laboratory Diagnostics of Sexually Transmitted Infections and Dermatosis, State Scientific Center of Dermatovenerology and Cosmetology, е-mail: shpilevaya@cnikvi.ru, https://orcid.org/0000-0002-9957-4009
Viktoria S. Solomka - Dr. Sc. (Biol.), Advisor to the Director for Science, State Scientific Center of Dermatovenerology and Cosmetology, е-mail: solomka@cnikvi.ru, https://orcid.org/0000-00026841-8599
