CC BY
13© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2016
Ю.А.Панфёрова', О.А.Фрейлихман1, Н.К.Токаревич1, С.Ф.Карпенко2, Х.М.Галимзянов2
СРАВНЕНИЕ ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ МЕТОДОВ ДЕТЕКЦИИ COXIELLA BURNETII В КРОВИ БОЛЬНЫХ ЛИХОРАДКОЙ КУ НА ОСНОВЕ АМПЛИФИКАЦИИ ФРАГМЕНТОВ ГЕНА 16S рРНК (СТАНДАРТНАЯ ПЦР) И ГЕНА groEL (ПЦР В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ)
1 НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера, Санкт-Петербург;2 Астраханский государственный медицинский университет
Цель. Сравнение диагностических возможностей двух вариантов ПЦР для выявления персистенции Coxiella burnetii в динамике инфекционного процесса у больных лихорадкой Ку. Материалы и методы. Было исследовано 110 проб клинического материала, полученного от больных лихорадкой Ку в эндемичном для данной инфекции регионе (Астраханская область). Пробы были исследованы в стандартной ПЦР (маркер — фрагмент гена 16S рРНК) и в ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ) (маркер — фрагмент гена groEL). Результаты. Было установлено, что оба маркера являются перспективными для обнаружения ДНК С. burnetii в клиническом материале, а РВ-ПЦР выявляет положительный результат, в том числе на поздних сроках заболевания (21 — 31 день болезни). Заключение. Данная работа является первой российской публикацией о сравнении разных вариантов ПЦР для выявления С. burnetii в крови больных Ку-лихорадкой в динамике инфекционного процесса.
Журн. микробиол, 2016, № 3, С. 70—74
Ключевые слова: лихорадка Ку, Coxiella burnetii, ПЦР, ПЦР в режиме реального времени, чувствительность, диагностическая эффективность
Yu.A.Panferova', OA-Freilikhman1, N.K.Tokarevich1, S.F.Karpenko2, Kh.M.Galimzyanov2
COMPARISON OF DIAGNOSTIC EFFECTIVENESS OF METHODS OF DETECTION OF COXIELLA BURNETII IN BLOOD OF PATIENTS WITH Q FEVER BASED ON AMPLIFICATION OF 16S rRNA GENE FRAGMENTS (STANDARD PCR) AND groEL GENE (REALTIME PCR)
'Pasteur Research Institute of Epidemiology and Microbiology, St. Petersburg; 2Astrakhan State Medical University, Russia
Aim. Comparison of diagnostic capabilities of 2 variants of PCR for detection of Coxiella burnetii persistence in dynamics of infectious process in patients with Q fever. Materials and methods. 110 samples of clinical material, obtained from patients with Q fever in an endemic region for this infection (Astrakhan region), were studied. The samples were studied in a standard PCR (marker — 16S rRNA gene fragment) and in real-time PCR (RT-PCR) (marker — groEL gene fragment). Results. Both markers were established to be perspective for detection of C. burnetii DNA in clinical material, and RT-PCR detects positive result including late stages of the disease (illness day 21 — 31). Conclusion. This study is the first Russian publication on comparison on different PCR variants for detection of C. burnetii in blood of Q fever patients in dynamics of the infectious process.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2016, No. 3, P. 70-74
Key words: Q fever, Coxiella burnetii, PCR, real-time PCR, sensitivity, diagnostic effectiveness
ВВЕДЕНИЕ
Лихорадка Ку представляет собой распространенное по всему миру зооан-тропонозное заболевание, вызываемое облигатным внутриклеточным патогеном С. burnetii. Острая форма лихорадки Ку часто проявляется в виде гриппоподоб-ного заболевания, атипичной пневмонии, сопровождающейся головной и пери-орбитальной болью, и реже гепатитом [4, 12]. В зависимости от состояния пациента и его иммунного статуса, примерно у пяти процентов больных, не получающих рациональную терапию, может развиваться хроническая форма данной инфекции, сопровождающаяся эндокардитом с высокой степенью летальности в 60 — 70% случаев [8,9].
Отсутствие патогномонических симптомов у больных лихорадкой Ку не позволяет диагностировать эту инфекцию без применения лабораторных методов. Лабораторная диагностика лихорадки Ку, как правило, проводится с помощью серологических методов, таких как реакция непрямой иммунофлюоресценции и иммуноферментный анализ, направленный на выявление антител [7, 9]. Однако данные методы имеют ограниченное применение на ранних сроках заболевания, поскольку процесс образования антител, выявляемых в этих реакциях, может достигать двух недель. Столь позднее обнаружение антител связано с существенной гиподиагностикой лихорадки Ку, в ряде случаев — с нерациональным лечением больных, что может привести кхронизации инфекции. Для прямого определения ДНК С. burnetii в клинических образцах за рубежом успешно применяют методы детекции, основанные на амплификации нуклеиновых кислот, в том числе стандартную ПЦР, гнездовую ПЦР, ПЦР в режиме реального времени и изотермическую реакцию с формированием петель (LAMP) [5, 10, 11]. Для надежного определения ДНК патогена в клиническом материале требуются высокочувствительные модификации ПЦР [8], в частности, ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ), основанная на накоплении флюоресцентного сигнала в процессе анализа. Хотя для выявления ДНК С. burnetii у экспериментально и естественно зараженных животных успешно применялись различные модификации ПЦР [3, 5, 6], диагностика лихорадки Ку у людей методами детекции, основанными на амплификации нуклеиновых кислот, нашла применение преимущественно за рубежом [11]. Кроме того, остается не ясным, в какие сроки целесообразно применять молекулярные методы детекции и как долго можно обнаруживать ДНК патогена в крови больных, получающих антибиотики.
Астраханская область является эндемичным регионом по заболеваемости лихорадкой Ку [ 1, 2]. Ранее нами была разработана методика детекции ДНК кок-сиелл на основе амплификации фрагмента высококонсервативного гена groEL в стандартной ПЦР, успешно применяющаяся нами для работы с биологическим материалом (органы мелких диких млекопитающих и иксодовые клещи) [3]. Эти данные побудили нас разработать набор для выявления С. burnetii методом ПЦР-РВ с данным генетическим маркером. Целью настоящего исследования являлось сравнение диагностических возможностей двух вариантов ПЦР для выявления персистенции C.burnetii в динамике инфекционного процесса у больных лихорадкой Ку.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Материалом исследования были 110 образцов цельной венозной крови пациентов, больных Ку-лихорадкой, на разных сроках болезни и реконвалесценции. Пробы были получены от 97 пациентов со среднетяжелым течением Ку-лихорадки (77 мужчин, средний возраст 30,94 лет; 20 женщин, средний возраст 48,2 лет; средний возраст всех больных 35,25 лет). Все больные находились на лечении в Областной инфекционной клинической больнице им. А.М.Ничоги (ОИКБ) в городе Астрахань. Диагноз ставился на основании клинических данных, эпиде-
миологического анамнеза и результатов лабораторных исследований. Все больные получали антибиотики (доксициклин, амоксиклав, цефтриаксон либо ципроф-локсацин) по стандартной схеме.
У части больных был проведен анализ крови методом ПЦР на ранних сроках заболевания (преимущественно 4 — 10 день болезни, на высоте лихорадки) в лаборатории ОИКБ с коммерческой тест-системой «Амплисенс Coxiella burnetii-FL» (ЦНИИЭ, Россия) согласно инструкции. При отрицательном результате ПЦР и в случаях, когда ПЦР не проводилась, диагноз был подтвержден серологическими методами, IgM и IgG к коксиеллам определяли с использованием тест-систем для ИФА, фаза II «Coxiella burnetii ELISA kits IgM, IgG» (Vircell, Испания) согласно рекомендациям производителя.
Отбор больных и образцов крови проводился сотрудниками Астраханского государственного медицинского университета. Анализируемые образцы крови однократно замораживали при -20°С для хранения и пересылки. Выделение ДНК из 200 мкл оттаявшей цельной крови проводили методом лизиса гуанидинизо-тиоционатом с последующей сорбцией на носителе с помощью набора «Diatom DNA Ргер200» (Изоген лаборатория, Россия) согласно инструкции.
Стандартная ПЦР, ПЦР-РВ и секвенирование фрагмента гена 16S рРНК проводилось в НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера. Стандартную ПЦР проводили с праймерами ribo-F TTCTCAAGGGTAATATCCTTG и ribo-R CGCTACTAAGAAGTGAACTTC, фланкирующими фрагмент гена 16S рРНК размером 403 п.н., в термоциклере «\feriti thermal cycler» (Life Technologies, США). Амплификация проводилась с использованием готовой пятикратной смеси для ПЦР «PCR ScreenMix» (Евроген, Россия) и включала следующие параметры: денатурация 95°С 3 мин., 40 циклов денатурация 95°С 15 сек, отжиг 57°С 30 сек, элонгация 72°С 40 сек. Результаты ПЦР определяли после электрофоретического разделения продукта в 1,5% агарозном геле.
ПЦР в режиме реального времени проводили с оригинальными праймерами groEL-F CTTCTACTGTTATGACGCCTTCTTTGС и groEL-R CGCAAGTAGG CACCATTTCTGC, фланкирующими фрагмент гена шаперонина GroEL, и зондом groEL-Probe FAM-CACTTTCTCCATCGCTTCCGCAATAATA-BHQ1 (патент РФ № 2525059) в термоциклере «Stratagene МХ3005Р» (Agilent, США) с детекцией флюоресцентной метки по каналу FAM. Для амплификации применялась пятикратная смесь «qPCR Mix HotStart» (Евроген, Россия). Программа амплификации включала следующие параметры: денатурация 95°С 5 мин., 40 циклов денатурация 95°С 15 сек, отжиг 60°С 30 сек с детекцией флюоресцентного сигнала по конечной точке, элонгация 72°С 30 сек.
Часть положительных проб, несущих фрагмент гена 16S рРНК, была секвени-рована с использованием генетического анализатора «MegaBase 1000» и набора «BigDye Terminator kit» (Life Technologies, США) согласно рекомендациям производителя. Полученные нуклеотидные последовательности сравнивали с последовательностями гена 16S рРНК С. burnetii, депонированными в базе данных NCBI GeneBank, с помощью программы NCBI BLAST.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Установлено, что применение тест-системы «Амплисенс Coxiella burnetii-FL» на первых днях болезни позволило выявить ДНК С. burnetii у большей части больных. Так, на 4 — 5 сутки болезни количество положительных проб составило 82,4%, а на 6 — 10 сутки — 75,6% соответственно. Среди проб, проанализированных на более поздних сроках, процент выявляемое™ ДНК коксиелл в пробах был значительно ниже (50% на 10 — 15 день и ни одной пробы на 21 — 25 день болезни).
С помощью стандартной ПЦР с фрагментом гена 16S рРНК были получены
следующие результаты: на 6— 10 день болезни было получено 87,5% положительных образцов, на 11 — 15 — 75%, на 16 — 20 — 100%, на 21 — 25 день — 46,2%, на 26 — 31 день — 20%. Отрицательные результаты, полученные с помощью тест-системы «Амплисенс Coxiella burnetii-FL» и стандартной ПЦР на поздних сроках инфекции, вероятно, обусловены недостаточной чувствительностью, не позволяющей с помощью этих методик выявлять небольшое количество коксиелл, циркулирующих в крови пациентов, получающих антибиотики. Средний процент положительных результатов ПЦР с данным маркером составил 76,4% (84 пробы из 110). Проведенный анализ методом секвенирования полученных ампликонов гена 16S рРНК выявил высокую степень гомологии (99%) амплифицированных фрагментов с опубликованными в базах данных GeneBank последовательностями данного гена С. burnetii и подтвердил специфическую амплификацию фрагмента гена 16S рРНК в исследованных нами в режиме стандартной ПЦР пробах.
Для ПЦР в режиме реального времени с фрагментом гена groEL была отмечена высокая чувствительность практически на всех сроках заболевания. Частота обнаружения ДНК коксиелл составила на 6 — 10 день болезни 97,5%, на 11 — 15 день — 100%, на 16 — 20 — 91,7%, на 21 — 25 и 25 — 31 дни болезни — по 100%. Средний процент положительных результатов ПЦР с данным генетическим маркером составил 98,2% (108 проб из 110).
. Таким образом, наибольшая чувствительность среди использованных нами двух оригинальных диагностических систем отмечена для ПЦР-РВ с фрагментом гена groEL, в том числе на поздних сроках заболевания (21 — 31 день болезни), что позволяет проводить диагностику методом ПЦР в режиме реального времени даже в период реконвалесценции и при интенсивной антибиотикотерапии.
В ходе работы было установлено, что амплификация целевых фрагментов ДНК С. burnetii происходит с неодинаковой частотой для различных вариантов ПЦР. Так, стандартная ПЦР 16S рРНК была положительной в 76,4%, а ПЦР-РВ groEL — в 98,2% от общего числа проб.
Установлено, что амплификация таких генетических мишеней, как 16S рРНК и фрагмент гена groEL, является высокоэффективным методом детекции коксиелл в крови больных лихорадкой Ку на разных сроках заболевания, в том числе в ходе проведения антибиотикотерапии, когда происходит элиминация патогена из циркулирующей крови. Показана высокая чувствительность ПЦР-РВ с фрагментом гена groEL на разных сроках инфекционного процесса, что позволяет не только диагностировать Ку-лихорадку на ранних сроках болезни, когда применение серологических методов, как правило, неэффективно, но и проводить ретроспективный анализ с использованием этого генетического маркера для выявления коксиеллез-ной этиологии. Данная работа является первой российской публикацией о сравнении разных вариантов ПЦР для выявления С. burnetii в крови больных Ку-лихорад-кой в динамике инфекционного процесса и позволяет судить об эффективности ПЦР-РВ для выявления ДНК коксиелл на разных сроках заболевания.
ЛИТЕРАТУРА
1. Бармин А.Н., Колчин Е.А., Шуваев Н.С., Дмитриева М.В. Анализ проявления при-родно-очаговых заболеваний на территории Астраханской обл. Естес. науки. 2012, 3 (40): 44-50.
2. Садретдинов Р.А, Галимзянов Х.М. Гемодинамические типы микроциркуляции у больных инфекционными лихорадками. Фундамент, исслед. 2010,7:63-66.
3. Фрейлихман О.А., Панфёрова Ю.А., Токаревич Н.К. Совершенствование метода детекции Coxiella burnetii в биологическом материале на основе амплификации гена gro Е L. Журн. микробиол. 2010,4:71-74.
4. Arricau-BouveryN., HauckY., BejaouiA.etal. Molecularcharacterisationof Coxiella burnetii isolâtes byinfrequent restriction site-PCR and MLVAtyping. BMC Microbiology. 2006,6(38). doi: 10.1186/1471-2180-6-38.
5. Bielawska-Drozd A., Cieslik P., Mirski T. et al. Q fever — selected issues. Ann. Agric. Environmental Med. 2013, 20 (2): 222-232.
6. Freylikhman O., Tokarevich N., Suvorov A et al. persistence in three generation of mice after application of live attenuated human M-44 vaccine against Q fever. Ann. N.Y. Acad. Sei. 2003, 990:496-499. .
7. Jaton K., Peter O., Raoult D. et al. Development of a high throughput PCR to detect Coxiella burnetii and its application in a diagnostic laboratory over a 7-year period. New Microbes New Infect. 2013,1 (1): 6-12. doi: 10/1002/2052-2975.8.
8. MarrieT., Raoult D. Qfever-a review and issues for the next century. Int. J. Antimicrob. Agents. 1997,8(3): 145-161. doi: 10.1016/S0924-8579(96)00369-X.
9. Maurin M., Raoult D. Q fever. Clin. Microbiol. Rev. 1999, 12 (4): 518-553.
10.Raele D., Garofolo G., Galante D. et al. Molecular detection of Coxiella burnetii using an alternative loop-mediated isothermal amplification assay, \feterinaria Italiana. 2015, 51 (1): 73-78. doi: 10.12834/\fetlt.3041168.4.
11. Hlburg J., Melchers W., Pettersson A. et al. Interlaboratory evaluation of different extraction and real-time PCR methods for detection of Coxiella burnetii in serum. J. Clin. Microbiol. 2010,48 (11): 3924-3927. doi: 10.1128/JCM.01006-10.
12. van Schaik E., Chen C., Mertens К. et al. Molecular pathogenesis of obligate intracellular bacterium. Nat. Rev. Microbiol. 2013, 11 (8): 561-573. doi: 10.1038/nrmicro3049.
Поступила 04.11.15
Контактная информация: Панфёрова Юлия Александровна,
197101, Санкт-Петербург, ул. Мира, 14, р.т. (812)232-21-36
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2016
A.Ю.Попова12, А.Н.Куличенко3, О.В.Малецкая3,
B.М.Дубянский3, А.Г.Рязанова3, ДА.Прислегина3, Л.И.Шапошникова3, ЕА.Манин3, Ю.В.Юничева4, Л.Е.Василенко4, Д.С.Агапитов3, В.Н.Савельев3, Д.Ю.Дегтярев3, Е.В.Герасименко3, Е.В.Лазаренко3, А.Ю.Жильцова3, А.С.Волынкина3, Е.С.Котенев3, И.В.Савельева3, АА.Хачатурова3, И.В.Кузнецова3, И.В.Жарникова3, Ю.М.Евченко3, АЛЗайцев3, АДАнтоненко5, В.Г.Оробей5
ОБЕСПЕЧЕНИЕ САНИТАРНО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОГО БЛАГОПОЛУЧИЯ В РЕГИОНЕ Г.-К. СОЧИ ПО ОПАСНЫМ И ПРИРОДНО-ОЧАГОВЫМ ИНФЕКЦИОННЫМ БОЛЕЗНЯМ В 2015 ГОДУ
'Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Москва; Российская медицинская академия последипломного образования, Москва; Ставропольский противочумный институт; 4Сочинское отделение Причерноморской противочумной станции, Сочи; Ставропольский государственный медицинский университет
Цель. Анализ результатов эпидемиологического мониторинга особо опасных, природно-очаговых и других инфекционных болезней, а также эпизоотологической активности природных очагов инфекций на территории г.-к. Сочи. Материалы и методы. Проведены лабораторные исследования ПЦР, иммуно- и бактериологическими методами 820 проб, из них 344 — клинического материала, 12 — воды открытых водоемов и 321—полевого материала. Выполнена молекулярно-генетическая идентификация 143 штаммов Vibrio cholerae, выделенных из открытых водоемов г.-к. Сочи. Результаты. Установлена циркуляция возбудителей Ку-лихорадки, туляремии и геморрагической лихорадки с почечным синдромом генотипа Добрава-Адлер, а также риккетсий группы клещевых пятнистых лихорадок. При исследовании проб клинического материала в этиологической структуре спорадически возникающих острых кишечных инфекций выявлено преобладание ротавирусов (70,9%). Поддержанию контаминации V. cholerae воды р. Агура способствовали относительно высокие значения температуры речной
