CC BY
16
УДК 577.151.45 + 571.27
СРАВНЕНИЕ БАКТЕРИОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ИНТЕРЛЕЙКИНА-2 ЧЕЛОВЕКА И ЯИЧНОГО КУРИНОГО ЛИЗОЦИМА НА КЛЕТКАХ Lactobacillus plantarum И Escherichia coli
П.А. Левашов, Д.А. Матолыгина, Е.Э. Осипова, С.С. Савин, Г.С. Захарова, Д.А. Гасанова, Н.Г. Белогурова, Е.Д. Овчинникова, С.А. Смирнов, В.И. Тишков, А.В. Левашов
(кафедра химической этимологии химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова; e-mail: levashov@yahoo.com)
Продолжено исследование недавно обнаруженной бактериолитической активности интерлейкина-2. Ранее было выявлено, что интерлейкин-2 (IL-2) обладает более узкой субстратной специфичностью в сравнении с куриным яичным лизоцимом. IL-2 разрушал клеточную стенку Escherichia coli, но не лизировал такие субстраты ли-зоцима, как клеточные стенки Micrococcus luteus и Bacillus subtilis. В данной работе впервые показано, что IL-2, как и куриный яичный лизоцим, способен лизировать клетки Lactobacillusplantarum. Действие IL-2 и яичного куриного лизоцима на Lactobacillus plantarum сравнивается в работе с их действием на Escherichia coli. Исследована зависимость скорости лизиса от концентрации бактериолитических факторов и ионной силы, а также изучены рН-профили активности.
Ключевые слова: интерлейкин-2, яичный куриный лизоцим, Lactobacillus plantarum, Escherichia coli, бактериолитическая активность.
Обнаружено [1, 2], что интерлейкин-2 обладает бактериолитической активностью, подобно яичному куриному лизоциму, однако, в отличие от лизоцима, демонстрирует более строгую субстратную специфичность, лизируя грамотрица-тельные палочки Escherichia coli, но не действуя на грамположительные кокки Micrococcus luteus и спорообразующие грамположительные бактерии Bacillus subtilis.
Поиск новых субстратов-бактерий, на которых проявляет активность интерлейкин-2, является фундаментальной научной задачей, так как механизм бактериолитического действия интерлейкина-2 до сих пор не изучен. С точки зрения медицинской прикладной науки особенно важно знать характер действия интерлейки-на-2 на те бактерии, которые взаимодействуют с человеческим организмом, так как интерлей-кин-2 выступает в качестве важного фактора в различных воспалительных процессах, сепсисе, онкологии. Кроме того, IL-2 является и диагностическим маркером, и лекарственным препаратом [3-7].
Данная работа посвящена обнаружению и исследованию бактериолитической активности ин-
терлейкина-2 человека на грам-положительных молочнокислых бактериях Lactobacillus planta-rum, которые являются важным компонентом симбиотической микрофлоры человека [8-10].
Материалы и методы
В работе использованы следующие материалы: ронколейкин (раствор очищенного интерлей-кина-2 для внутривенного и подкожного введения (0,5 мг в 1 мл; «Биотех», Россия); MES, Tris («ч.д.а», «ICN Biomedicals», США); лиофилизи-рованный куриный яичный лизоцим (95% чистоты, «Sigma Aldrich», США); лимонная кислота, CuSO4, NaCl, NajCO3, NaOH («ч.д.а», «Merck», Германия); CH3COOH («ч.д.а», «Реахим», Россия); HCl («Germed», Германия); 10%-й водный раствор додецилсульфата натрия («BioRad», США).
Клетки Е. coli JM109 любезно предоставлены Дж. Мессингом (Waksman Institute, New Jersey, США). Клетки Е. coli растили 1 сут на 1%-й твердой агаризованой среде LB при температуре 37°С по стандартной методике [11]. Использовали препарат лиофилизированных бактерий L. plantarum («Микроген», Россия), из которого перед началом работы готовили суспензию (10 мл воды на одну
*Институт биохимии им. А.Н. Баха Федерального исследовательского центра «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН (РФ); Институт экспериментальной кардиологии, Российский кардиологический научно-производственный комплекс Министерства здравоохранения РФ.
ампулу). Перед началом измерений препараты клеток Е. coli и L. plantarum центрифугировали при 3500 об/мин в течение 4 мин на центрифуге «Minispin» («Eppendorf», Германия), затем ресу-спендировали в буферном растворе, используемом для измерения активности. Результаты измерений скорости лизиса клеток лиофилизи-рованного препарата L. plantarum совпадают с таковыми для свежевыращенных клеток [12]. Раствор яичного куриного лизоцима готовили непосредственно перед экспериментом, используя ту же буферную смесь, что и для измерения активности. В качестве стандартного раствора интерлейкина-2 использовали готовый препарат без дополнительной обработки, ампулу вскрывали непосредственно перед экспериментом. Так как в исходном растворе интерлейкина-2 присутствует додецилсульфат натрия (0,5%), то в работе также приведены данные по влиянию разных концентраций данного компонента на фоновый лизис клеток и на лизис в присутствии интерлейкина-2. Для измерения светопоглоще-ния растворов использовали двухлучевой спектрофотометр «UV-1601PC» («Shimadzu», Япония). Измерения проводили в кюветах с длиной оптического пути 1 см и объемом 0,5 мл. Кон -центрацию белка определяли микробиуретовым методом [13] с использованием модифицированного реагента Бенедикта [14].
Определение бактериолитической активности
Бактериолитическую активность белков определяли турбидиметрическим методом [12, 15] на длине волны 650 нм при температуре 37°С. В качестве начальной скорости лизиса клеток использовали изменение поглощения A650 в интервале времени от 5 до 20-30 с от начала лизиса. В отсутствие бактериолитических факторов фоновый самопроизвольный лизис клеток в условиях эксперимента не наблюдался. При определении активности использовали суспензию клеток с начальным поглощением A650 = 0,4. Измерение активности проводили в буферном растворе 10 мМ MES-Tris-CH3COOH при разных значениях pH. В качестве показателя активности в работе приведены значения начального изменения поглощения -dA/dt (с-1), которые в данных условиях связаны постоянными множителями с -dKOE/dt и с изменением степени лизиса d©/ dt [12, 15] (0 = 0, если все клетки целы, и 0 = 1 в случае 100%-го разрушения клеток препарата). Множитель (а) для пересчета -dA/ dt в d0/ dt зависит от клеток-субстратов. Для разных клеток-субстратов одно и то же изменение
поглощения соответствует разному изменению степени лизиса. Скорость лизиса и удельная скорость лизиса (СЛ) могут быть рассчитаны по следующим формулам:
d©/ dt = (-dA/dt) •а,
СЛ = (1/[E])d0/ dt = ((-dA/dt>a)/[E].
Согласно данным предыдущих работ, множитель а (для пересчета скорости начального падения величины оптического поглощения в скорость изменения степени лизиса) равен 8,9 и 3,3 для L. plantarum и E. coli соответственно [12, 15].
Результаты и обсуждение
На рис. 1 представлены зависимости скорости лизиса от концентрации бактериолитического фактора. Сразу отметим тот факт, что в сравнении с литературными данными [1] активность используемого в данной работе интерлейкина-2 оказалась ниже в 7-8 раз в аналогичных условиях измерения. Этот феномен связан, вероятно, с отсутствием контроля за уровнем прямой бактериолитической активности в коммерческом препарате, который может отличаться по этому свойству в зависимости от партии. В целом все зависимости активности от концентрации бактериолитического фактора имеют сходный характер. Скорость лизиса клеток пропорциональна концентрации бактериолитиче-ского фактора в области малых концентраций последнего, когда скорость-лимитирующей стадией лизиса является ферментативный процесс. В области больших концентраций фермента зависимость имеет более сложный характер, стремясь к горизонтальной асимптоте, когда скорость лизиса перестает зависеть от концентрации фермента. При большой концентрации фермента происходит множественное одновременное повреждение клеточной стенки, и скорость осмотического разрыва клетки оказывается медленней ферментативных процессов, которые перестают быть скорость-ли-митирующими [1, 12]. Приближение к горизонтальной асимптоте явно наблюдается в экспериментах с лизоцимом как для L. plantarum, так и для E. coli. В экспериментах с интерлейкином-2, как сказано выше, скорость лизиса клеток сравнительно невысока, поэтому в рабочем диапазоне концентраций наблюдается только линейный диапазон зависимости. В дальнейших экспериментах для удобства сравнения мы выбрали такие концентрации бактериолитических факторов, при которых наблюдаемые скорости имеют один порядок.
На рис. 2 представлены pH-зависимости скорости лизиса клеток L. plantarum и E. coli под дей-
Рис. 1. Зависимости скорости лизиса клеток от концентрации бактериолитиче-ских факторов: 1 - лизоцим (E. coli, pH 8,5); 2 - лизоцим (L. plantarum, pH 7,0); 3 - интерлейкин-2 (E. coli, pH 8,5); 4 - интерлейкин-2 (L. plantarum, pH 7,0)
Рис. 2. Зависимость скорости лизиса от pH: 1 - лизоцим (0,1 мкг/мл, E. coli)', 2 - лизоцим (2,5 мкг/мл, L. plantarum); 3 - интерлейкин-2 (15 мкг/мл, E. coli); 4 - интерлейкин-2 (30 мкг/мл, L. plantarum)
ствием IL-2 и яичного куриного лизоцима. Как видим, картина кардинально меняется в зависимости от используемых клеток-субстратов. И для яичного куриного лизоцима, и для интерлейкина-2 оптимумы активности на L. plantarum лежат в нейтральной области. Для E. coli pH-оптимумы активности для обоих бактериолитических факторов смещены в щелочную область. Согласно данным, полученным в работе [1], оптимум активности
яичного куриного лизоцима и интерлейкина-2 человека на клетках E. coli также смещен в щелочную область в аналогичных условиях. Для интер-лейкина-2, выделенного из плазмы крови барана [2], тоже наблюдается оптимум pH-активности в щелочной области в случае использования в качестве субстрата E. coli. Для сложного полимерного субстрата рН-профиль активности фермента может существенно отличаться от теоретического,
основанного на знании рК ионогенных групп активного центра [16, 17]. Эффективное значение рН для микроокружения участвующих в катализе ионогенных групп в области заряженной поверхности бактерии может отличаться от значения рН в объеме раствора. Отдельной проблемой описания ферментативной кинетики для полимерных субстратов является сложность учета вклада разных типов сорбции фермента [18]. Для лизоцима известно явление различного характера сорбции фермента на клетках Е. евИ и Ь. р1аШатыш в разных условиях [12, 19], что может вносить искажения в характер рН-зависимостей активности. Таким образом, для сложного полимерного субстрата на характер зависимости активности от рН влияют многие факторы. Можно утверждать, что имеет место сходный характер смещения рН-оптимума активности для интерлейкина-2 и лизо-цима в зависимости от используемого субстрата бактериальных клеток. Выяснение деталей взаимодействия антибактериального белка с клеткой при разных значениях рН выходит за рамки данной работы и может быть предметом будущих исследований.
В табл. 1 представлен пересчет наблюдаемых значений активности (-ёЛШГ) в оптимумах рН-
зависимостей активности в истинную скорость изменения степени лизиса (СЛ). Величина 100%*СЛ соответствует процентному содержанию в системе клеток, разрушенных в 1 с, в расчете на кон -центрацию фермента 1 г/л (мг/мл). Как видим из соотношения удельных скоростей лизиса, лизоцим почти в десять раз эффективней лизирует клетки E. coli, а интерлейкин-2 приблизительно одинаково эффективен в отношении E. coli и L. plantarum.
В табл. 2 представлены данные по скорости лизиса L. plantarum и E. coli в присутствии интерлейкина-2 при разных значениях ионной силы. Для обоих субстратов наблюдается уменьшение скорости лизиса при увеличении ионной силы до значения 0,03 М. Падение скорости лизиса при увеличении ионной силы может быть связано с уменьшением скорости осмотического разрыва клетки [12, 15]. Однако в сравнении с яичным куриным лизоцимом для интерлейкина-2 данный эффект от повышения ионной силы более явно выражен. По литературным данным, действие яичного куриного лизоцима на E. coli [15] и L. plantarum [12] также уменьшается с ростом ионной силы, но при кон -центрации NaCl 0,03 М скорость лизиса еще не снижается и лишь при концентрациях NaCl 0,06
Т а б л и ц а 1
Расчет истинных значений скорости лизиса клеток на основе наблюдаемой скорости падения
величины поглощения
Показатель Интерлейкин-2 Лизоцим
E. coli L. plantarum E. coli L. plantarum
-dA/dt, 10-4 с-1 2,1 1,7 2,0 1,95
[E], г/л 0,015 0,03 0,0001 0,0025
1/[E]-(-dA/dt), 10-3 л-г-1-с-1 14 5,7 2000 78
СЛ = (1/[E])-(d0/dt) =(-dA/dt) a/[E], 10-2л-г-1-с-1 или 100%-СЛ, л-г-1-с-1 4,62 5,07 660 69,42
GH(E. coli)/СЛ(L. plantarum) 0,9 9,5
Т а б л и ц а 2
Влияние концентрации соли на бактериолитическую активность интерлейкина-2 (pH 7,6)
[NaCl], M 0 0,03
-dA/dt, 10-4 с-1
15 мкг/мл интерлейкина-2 на E. coli 1,2±0,2 0,5±0,1
30 мкг/мл интерлейкина-2 на L. plantarum 1,4±0,2 0,4±0,1
М и выше она начинает заметно снижаться. В отличие от лизоцима интерлейкин-2 из плазмы крови барана [2] при действии на E. coli также демонстрировал резкое уменьшение скорости лизиса клеток при концентрации NaCl 0,03 М.
В табл. 3 представлены данные по влиянию на скорость лизиса поверхностно-активного вещества додецилсульфата натрия (ДСН), который может входить в состав медицинских препаратов, в том числе на основе интерлейкина-2. Как видим, на действие интерлейкина-2 и на фоновый лизис клеток данный ПАВ практически не влияет до концентраций как минимум 0,5 мг/мл. Согласно литературным данным, ДСН оказывает действие на активность яичного куриного лизоцима [20]. Можно предположить, что данный ПАВ может связываться в активном центре яичного куриного лизоцима, изменяя его свойства, но не оказывает подобного действия на интерлейкин-2. В нашей работе максимальная концентрация интерлейкина-2 в экспериментах составляла 0,03 мг/мл, что соответствует внесению ПАВ до концентрации 0,3 мг/мл. Можно утверждать, что данный ПАВ в условиях экспериментов данной работы не оказывает заметного
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Левашов П.А., Седов С.А., Белогурова Н.Г., Шиповсков С.В., Левашов А.В. // Биохимия. 2012. Vol. 77. N 11. С. 1567.
2. Седов С.А., Белогурова Н.Г., Шиповсков С.В., Семёнова М.В., Гитинов М.М., Левашов А.В., Левашов П.А. // Биоорг. химия. 2012. Т. 38. № 3. C. 315.
3. Baaten G., Voogd A.C., Wagstaff J. // Eur. J. Cancer. 2004. Vol. 40. N 8. P. 1127.
4. Aurelius J., Martner A., Brune M., Palmqvist L., Hans-son M., Hellstrand K., Thoren F.B. // Haematologica. 2012. Vol. 97. N 12. P. 1904.
5. Wagner S.C., Markosian B., Ajili N., Dolan B.R., KimA.J.,
действия на активность ферментов и не вызывает лизиса клеток сам по себе.
Таким образом, в работе показано, что интерлей-кин-2 обладает бактериолитической активностью в отношении не только E. coli, но и L. plantarum. При этом яичный куриный лизоцим лизирует клетки E. coli на порядок эффективней, чем клетки L. plantarum. Интерлейкин-2 оказался одинаково активен и в отношении E. coli, и в отношении L. plantarum. Положение pH-оптимума активности как для интерлейкина-2, так и для лизоцима зависит в первую очередь от клетки- субстрата, находясь в области нейтральных pH (6,7-7,3) для L. plantarum и в области щелочных значений pH (8,3-8,7) для E. coli. Действие на бактериальные клетки интерлей-кина-2 по сравнению с лизоцимом более чувствительно к повышению ионной силы. Наблюдаемое значение активности интерлейкина-2 падает более чем в два раза при концентрации NaCl 0,03 M, а аналогичное падение активности для яичного куриного лизоцима происходит лишь при концентрации NaCl 0,06-0,08 M [2, 15]. На действие интерлейки-на-2 не влияет присутствие ДСН (вплоть до концентраций последнего 0,5 мг/мл).
Т а б л и ц а 3
Alexandrescu D.T., Dasanu C.A., Minev B., Koropat-nick J., Marincola F.M., Riordan N.H. // J. Transl. Med. 2014. Vol. 12. P. 127.
6. Sari T.T., Gatot D., Akib A.A., Bardosono S., Hadine-goro S.R., Harahap A.R., Idjradinata P.S. // Acta Med. Indones. 2014. Vol. 46. N 3. P. 217.
7. Witkowska A., Zywiec J., Strozik A., Gorczynska-Ko-siorz S., Trautsolt W., Strzalka-Mrozik B., Kimsa M., Owczarek A., Stfpieh B., Mazurek U., Grzeszczak W., Gumprecht J. // Ann. Agric. Environ. Med. 2015. Vol. 22. N 2. P. 320.
8. Reid G., Burton J. //Microbes and Infections. 2002. Vol. 4. P. 319.
Влияние додецилсульфата натрия на фоновый лизис клеток и на активность интерлейкина-2
ДСН, мг/мл 0,1 0,15 0,2 0,3 0,5
Фоновый лизис при pH 7,0 L. plantarum, 10-5 с-1 0 0 0 0 0
10 мкг/мл интерлейкина-2 при pH 7,0 на L. plantarum, 10-5 с4 5,5±1,4 5,7±2,0 5,3±1,7 5,9±2,7 6,2±2,6
Фоновый лизис при pH 8,5 E. coli, i n-5 -1 10 с 0 0,5±0,3 0,7±0,3 1,0±0,3 1,5±0,5
10 мкг/мл интерлейкина-2 при pH 8,5 на E. coli, 10-5 с-1 12,2±1,8 11,5±1,6 12,4±1,9 13,1±2,3 14,7±2,5
Работа выполнена при финансовой поддержке РНФ (проект № 15-14-00012 «Исследование бактериолитической активности интерлейкина-2»).
9. Merk K., Borelli C., Korting H.C. // Intern. J. Med. Microbiol. 2005. Vol. 295. P. 9.
10. VriesM.C. de, Vaughan E.E, Kleerebezem M., Vos W.M. de // Intern. Diary J. 2006. Vol. 16. P. 1018.
11. Maniatis T., Fritsch E.F., Sambrook J. // Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor. N.Y., 1982.
12. Матолыгина Д.А., Осипова Е.Э., Смирнов С.А., Белогурова Н.Г., Еремеев Н.Л., Тишков В.И., Левашов А.В., Левашов П.А. // Вестн. Моск. ун-та. Сер. 2. Химия. 2015. Т. 56. № 6. С. 365.
13. Levashov P.A., Sutherland D.S., Besenbacher F., Shipovskov S. // Anal. Biochem. 2009. Vol. 395. P. 111.
14. Левашов П.А., Овчинникова Е.Д., Афанасьева М.И., Фрид Д. А., Азьмуко А. А., Беспалова Ж. Д., Адамова И.Ю., Афанасьева О.И., Покровский С.Н. //
Биоорг. химия. 2012. Т. 38. № 1. C. 58.
15. Levashov PA., Sedov S.A., Shipovskov S., Belogu-rova N.G., LevashovA.V. // Anal. Chem. 2010. Vol. 82. Р. 2161.
16. Рабинович М.Л., Клесов А.А., Березин И.В. // Биоорг. химия. 1976. Т. 2. № 6. C. 795.
17. Смотров О.И., Борзенков В.М., Суровцев В.И. // Биоорг. химия. 2011. Т. 37. № 5. C. 631.
18. Рабинович М.Л., Клесов А.А., Березин И.В. // Биоорг. химия. 1976. Т. 2. № 5. C. 689.
19. Sedov S.A., Belogurova N.G., Shipovskov S., Levashov A.V., Levashov P.A. // Colloids Surf. B. 2011. Vol. 88. P. 131.
20. Иванов Р. А., Соболева. О .А., Смирнов С.А., Левашов П.А. // Биоорг. химия. 2015. Т. 41. № 3. C. 292.
Поступила в редакцию 01.08.15
COMPARISON OF BACTERIOLYTIC ACTIVITY OF HUMAN INTERLEUKIN-2 AND CHICKEN EGG LYSOZYME ON THE CELLS OF Lactobacillus plantarum AND Escherichia coli
P.A. Levashov, D.A. Matolygina, H.E. Osipova, S.S. Savin, G.S. Zaharova, D.A. Gasanova, N.G. Belogurova, E.D. Ovchinnikova, S.A. Smirnov, V.I. Tishkov, A.V. Levashov
(Department of Chemical Enzymology, Faculty of Chemistry, М. V Lomonosov Moscow State University)
This paper continues the study of the recently discovered bacteriolytic activity of interleukin-2. It has earlier been revealed that interleukin-2 (IL-2) has a narrower substrate specificity in comparison with chicken egg lysozyme. IL-2 destroys Escherichia coli, but can not destroy Micrococcus luteus and Bacillus subtilis. For the first time in the present study it is demonstrated that IL-2 is capable to destroy Lactobacillus plantarum. The action of IL-2 and that of chicken egg lysozyme are compared in their effect on Lactobacillus plantarum and Escherichia coli. There have been investigated the dependences of the rate of lysis on the concentration of bacteriolytic factors, pH and ionic strength.
Key words: interleukin-2, chicken egg lysozyme, Lactobacillus plantarum, Escherichia coli, bacteriolytic activity.
Сведения об авторах: Левашов Павел Андреевич - ст. науч. сотр. кафедры химической энзимологии химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова, ст. науч. сотр. Института экспериментальной кардиологии Кардиологического научного центра Министерства здравоохранения Российской Федерации, канд. хим. наук (levashov@yahoo.com); Матолыгина Дарья Андреевна - студентка химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова (dashunechka.m@yandex.ru); Осипова Елена Эдуардовна - студентка химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова (polza_1993@mail.ru); Савин Святослав Сергеевич - науч. сотр. кафедры химической энзимологии химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова, канд. биол. наук (sslavas86@gmail.com); Захарова Галина Сергеевна - мл. науч. сотр. Института биохимии им. А.Н. Баха, Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН (galina.s.zakharova@gmail.com); Гасанова Дария Алановна - студентка химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова (sova-sipuha@hotmail.com); Белогурова Наталья Георгиевна - доцент кафедры химической энзимологии химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова, канд. хим. наук (nbelog@mail.ru); Овчинникова Екатерина Дмитриевна - мл. науч. сотр. Института экспериментальной кардиологии Кардиологического научного центра Министерства здравоохранения РФ (k.ovchinnikova@gmail.com); Смирнов Сергей Александрович - науч. сотр. кафедры химической энзимологии химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова (sergik-2001@yandex.ru); Тишков Владимир Иванович -профессор кафедры химической энзимологии химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова, зав. лабораторией молекулярной инженерии Института биохимии им. А.Н. Баха, Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН, докт. хим. наук (vitishkov@gmail.com); Левашов Андрей Вадимович - профессор кафедры химической энзимологии химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова, докт. хим. наук, профессор (a_levashov@bk.ru).
