CC BY
47
СРАВНЕНИЕ АНТИМИКРОБНОЙ АКТИВНОСТИ РАЗЛИЧНЫХ ШТАММОВ БАКТЕРИЙ РОДА LACTOBACILLUS ПРОТИВ РЯДА ПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ
Кулиев А.А.1, Демнерова К.2, Абдуллаева У.Д.3 ©
1Профессор, кафедра Биохимии и биотехнологии, Бакинский государственный университет;
2профессор, кафедра Биохимии и биотехнологии, Химико-технологический университет;
3докторант, кафедра Биохимии и биотехнологии, Бакинский государственный университет
Аннотация
В статье исследуются штаммы молочнокислых бактерий и их антимикробная активность к ряду патогенных микроорганизмов. Молочнокислые бактерии представляют особый научный и практический интерес так как являются частью нормальной микробиоты человека и животных. Несмотря на успехи, достигнутые в изучении молочнокислых бактерий, многое до сих пор остается неясным. Изучение антимикробной активности данной культуры бактерий по отношению к патогенным микроорганизмам позволят определить, как молочнокислые бактерии, входя в состав микробиоты человека и животных, влияют на патогенные микроорганизмы и представителей нормальной микрофлоры, каким образом они действуют на ткани, отдельных систем и на организм в целом.
Ключевые слова: молочнокислые бактерии, антимикробная активность, Lactobacillus, питательная среда, патоген.
Keywords: lactic acid bacteria, antimicrobial activity, Lactobacillus, media, pathogen.
1. Введение
Молочнокислые бактерии это группа грамположительных палочковидных бактерии, к числу которых относятся бактерии роду Lactobacillus и Enterococcus. Они представляют особый научный и практический интерес так как являются частью нормальной микробиоты человека и животных. Эти бактерии участвуют в поддержании колонизационной резистентности и гомеостаза, нормализуют содержание в организме углеводов, желчных кислот, холестерина, осуществляют синтез витаминов и других биологически активных соединений [1,19;4, 72].
Молочнокислые бактерии широко распространены в природе, встречаются природной микрофлоре, и играют важную роль в процессах ферментации. Среди группы молочнокислых бактерий представители рода Lactobacillus представляют наибольший интерес и часто рассматриваются как источники пробиотиков и антимикробных метаболитов так как проявляют ряд антимикробных активностей [5, 4].
Антимикробная активность объясняется выработкой антимикробных метаболитов, таких как органические кислоты, пероксид водорода, бактериоцины и бактериоциноподобные вещества которые ингибируют рост и развитие ряда патогенных бактерий. Среди них наибольший интерес представляют бактериоцины. Эта вещества белковой природы, синтезируемые в рибосомах и выделяемые клеткой в форме биологически активных пептидов, обладающих бактериоцидным и бактериостатическим действием. Бактериоцины как правило оказывают антимикробное действие влиянием на клеточную стенку и мембраны, ингибируя синтез клеточной стенки и формирование пор что завершается гибелью микробного организма. Бактериоцины и молочнокислые бактерии образующие антимикробные метаболиты пользуются большой популярностью в пищевой промышленности и используются для предотвращения порчи продуктов [1,19; 2, 23]
© Кулиев А.А., Демнерова К., Абдуллаева У.Д., 2017 г.
Несмотря на успехи, достигнутые в изучении молочнокислых бактерий, многое до сих пор остается неясным. Неизвестно, как молочнокислые бактерии, входя в состав микробиоты человека и животных, влияют на патогенные микроорганизмы и представителей нормальной микрофлоры, каким образом они действуют на ткани, отдельных систем и на организм в целом. Обнаружены существенные различия в спектрах антибактериального действия различных штаммов молочнокислых бактерий, а также в их способности влиять иммунитет и метаболические процессы, происходящие в организме человека и животных [4,72; 5,4].
Основной целью работы является изучения антимикробной активности ряда представителей молочнокислых бактерий, а также сравнение ее интенсивности среди различных штаммов рода Lactobacillus против штаммов патогенных бактерий [3, 2].
2. Материалы и методы
Данная исследовательская работа была проведена с сентября 2015 года по февраль 2016 года в Химико-технологическом Университете в Праге. Штаммы молочнокислых бактерий используемые в данной работе были предоставлены из числа коллекционных культур кафедры Биохимии и Микробиологии, факультет Пищевой и биохимической технологии.
2.1. Определение антимикробной активности штаммов молочнокислых бактерий.
Штаммы молочнокислых бактерий рода Lactobacillus, Enterococcus, Lactococcus, Pediococcus (80 штаммов) были исследованы на наличие антимикробной активности против ряда патогенных бактерий Bacillus cereus, Listeria ivanovii, Staphylococcus aureus и Escherichia coli. 24-часовые культуры изолированных штаммов молочнокислых бактерий были выращены на MRS агаре при температуре 37 °C и стандартной оптической плотности 0.5 при длине волны 600 нм. После 24 часовой инкубации при температуре 37 °C бактериальные клетки были отделены методом центрифугирования в течении 15 мин. при 10 000 об/мин. Далее показатель кислотности одной порции супернатанта был доведен до 7.0, после чего супернатанты были профильтрованы через мембранный фильтр диаметром 0.22 мкм. Полученные фильтраты как с кислотностью приближенной к 7.0, так и без были использованы для определения антимикробной активности. Положительные результаты были отмечены при наличии зоны лизиса диаметром как минимум 1 мм [2, 23; 3, 3].
2.2. Приготовление тест-культуры микроорганизма
Патогенные культуры бактерий Bacillus cereus, Listeria ivanovii, Staphylococcus aureus и Escherichia coli предоставленные из числа коллекционных культур кафедры Биохимии и Микробиологии, факультет Пищевой и биохимической технологии, Химико-технологического Университета были культивированы в течении 24 часов в сердечно-мозговом бульоне при температуре 37 °C и использованы в качестве тест-микроорганизмов для изучения антимикробной активности [5,25].
2.3. Метод диффузии в агар
Антимикробная активность изолятов молочнокислых бактерий против тест-микроорганизмов (Bacillus cereus, Listeria ivanovii, Staphylococcus aureus и Escherichia coli) была определена методом диффузии в агар. Патогенные тест-микроорганизмы были инокулированы в количестве 0.1 мл в 5 мл сердечно-мозгового бульона и культивированы в течении 24 часов при температуре 37 °C. Заранее приготовленные чашки Петри содержащие 20 мл питательной среды MRS-агар были предварительно засеяны 2 мл соответствующего тест-микроорганизма. Далее в вырезанные в агаре при помощи прокаленного сверла лунки были заполнены 25мкм, 50 мкм,75 мкм и 100 мкм фильтрата и помещены в термостат на 24 -48 часов при температуре 37 °C. Степень чувствительности тест-микроорганизма к испытуемому фильтрату была определена по ширине зоны задержки роста, выражаемой в миллиметрах или по концентрации фильтрата добавляемого в лунки [4, 73-75].
2.4. Метод двухслойных агаровых пластинок
Приготовленные заранее чашки Петри с 20 мл питательной среды MRS-агар (1%)содержащие испытуемые штаммы бактерий рода Lactobacillus (13.3, 21.3, 21.1, 39.1,
45.1, 16.3, 16.8, LP2) были залиты вторым слоем той же питательной среды (MRS - агар) приготовленной с меньшей концентрацией агара (0.75%) в составе и содержащей штаммы тест-микроорганизмов (Bacillus cereus, Listeria ivanovii, Staphylococcus aureus и Escherichia coli) и оставлены для затвердевания на 15 - 20 минут. Тест-микроорганизмы патогенных бактерий также как испытуемые культуры молочнокислых бактерий были добавлены в питательные среды 2 мкл на 20 мл среды. Далее чашки Петри были инкубированы на 48 часов при температуре 37 °C. Антимикробная активность была определена по наличию и диаметру образованной зоны лизиса [4;74-76].
3. Результаты и их обсуждение
В процессе исследования 80 штаммов молочнокислых бактерий различных родов (Lactobacillus, Enterococcus, Lactococcus, Pediococcus) были исследованы на антимикробную активность против ряда патогенный микроорганизмов (Bacillus cereus, Listeria ivanovii, Staphylococcus aureus и Escherichia coli) и лишь 8 (13.3 - L.crispatus, 21.3 - L.crispatus, 21.1-L.crispatus, 39.1 - L.rhamnosus, 45.1- L.rhamnosus, 16.3 - L.vaginalis, 16.8 -L.plantarium, LP2-L.vaginalis) штаммов проявили максимальную антимикробную активность по отношению к патогенам. Все штаммы с наибольшей антимикробной активностью принадлежали к роду молочнокислых бактерий Lactobacillus и проявляли различную активность по отношению к патогенные тест-микроорганизмам.
В ходе исследования было установлено что штаммы Lactobacillus проявляют антимикробную активность различной интенсивности по отношению к штаммам патогенных бактерий. Каждый штамм имеет свой спектр активности по отношению к тест -микроорганизму (Bacillus cereus, Listeria ivanovii, Staphylococcus aureus и Escherichia coli).
Таблица 1
Сравнение антимикробной активности штаммов молочнокислых бактерий рода Lactobacillus против патогенных тест-микроорганизмов
Молочнокислые Диаметр зоны Диаметр зоны Диаметр зоны Диаметр зоны
Бактерии лизиса лизиса лизиса лизиса
E.coli Staphylococcus aureus Bacillus cereus Listeria ivanovii
21.1 +++ +++ ++ +++
13.3 - +++ +++ ++
16.3 +++ +++ +++ ++
39.1 +++ +++ +++ +++
16.8 - +++ +++ ++
45.1 +++ +++ ++ -
21.3 +++ +++ +++ ++
LP2 ++ +++ +++ ++
Diameter of the inhibition zone: (+) weak (6 - 9 mm), (++) intermediate (10 - 13 mm), (+++) strong (14 - 16 mm), (-) no growth
Итак, в результате проведенного исследования было установлено что среди молочнокислых бактерий наибольшей антимикробной активностью обладают представители рода Lactobacillus, и кроме того каждый представитель данного рода обладает индивидуальным спектром антимикробной активности по отношению к штаммам патогенных тест микроорганизмов.
Литература
1. Mami Anasa , Kerfouf Ahmedb and Kihal Mebrouk - Study of the Antimicrobial and Probiotic Effect of Lactobacillus Plantarum Isolated from Raw Goat's Milk from the Region of Western Algeria //
International journal of science: Basic and applied research (IJSBAR). - 2014. - Volume 13. No 1. -С.18-27.
2. H Jamalifar, HR Rahimi, N Samadi, AR Shahverdi, Z Sharifian, F Hosseini,1 H Eslahi,1 and MR Fazeli1 - Antimicrobial activity of different Lactobacillus species against multi- drug resistant clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa // Iranian journal of Microbiology. - 2011. - № 3. C.21-25
3. D Tambekar, S Bhutada. Studies on Antimicrobial Activity and Characteristics of Bacteriocins Produced by Lactobacillus strains Isolated from Milk of Domestic Animals// Internet journal of microbiology. - 2009. - № 2. - C.1-5
4. Mounyr Balouiri n, Moulay Sadiki, Saad Koraichi Ibnsouda. Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review // Journal of pharmaceutical analysis. - 2016. - № 6. - С.71-79
5. Сравнительная характеристика антагонистической активности промышленных молочнокислых заквасок // Выпускная квалификационная работа [электронный реcурс] - режим доступа: http://kpfu.ru/portal/docs/f_533849844/nizamieva.pdf
