CC BY
124
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014 УДК 579.841.11:546.215.083.3
Плюта В.А.1'2, Попова А.А.1, Кокшарова О.А.1'3, Кузнецов А.Е.2, Хмель И.А.1
способность природных кетонов взаимодействовать с бактериальными Quorum sensing системами
1ФГБУН Институт молекулярной генетики Российской академии наук, 123182, Москва; 2Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, 125047, Москва; 3НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова, 119234, Москва
Исследовано действие природных кетонов, образуемых бактериями (2-нонанон, 2-гептанон, 2-ундеканон), на функционирование Quorum Sensing (QS) систем. В работе были использованы в качестве биосенсоров N-ацил-гомосеринлактонов три /ux-репортерных штамма, содержащих компоненты QS-систем LasI/LasR, RhlI/RhlR, LuxI/LuxR. Показано, что при концентрациях, не оказывающих бактерицидного действия или слабо влияющих на выживаемость штаммов-биосенсоров, указанные кетоны могут модулировать QS-ответ, подавляя экспрессию /их-репортерного оперона в большей степени, чем жизнеспособность клеток этих штаммов.
Ключевые слова: кетоны, Quorum Sensing; /их-биосен-соры.
Многие микроорганизмы синтезируют летучие соединения, в том числе летучие органические соединения (ЛОС), которые могут подавлять рост грибов и бактерий, а также оказывать стимулирующее или ингибирующее действие на растения [1—3]. Среди бактерий-продуцентов ЛОС почвенные и ризос-ферные штаммы, относящиеся к различным родам Pseudomonas и Serratia [4-6], оппортунистический патоген человека P. aeruginosa [7, 8], морские бактерии [9]. Предполагают, что продукция ЛОС является одним из факторов конкурентной борьбы между микроорганизмами. Кроме того, ЛОС могут играть существенную роль в коммуникации между организмами («infochemicals») [10, 11]. ЛОС могут быть рассмотрены как важные компоненты, участвующие во взаимодействии между различными микроорганизмами и высшими организмами в природных условиях. Так как регуляция многих клеточных процессов бактерий контролируется системами Quorum Sensing (QS), представляет интерес исследовать, оказывают ли ЛОС воздействие на эти системы, функционирующие как глобальные регуляторы экспрессии генов бактерий [12].
Нами было показано, что летучие соединения, выделяемые различными почвенными и ризосферными штаммами Pseudomonas и Serratia (общий пул), могут подавлять функционирование различных QS-систем коммуникации бактерий, использующих в качестве сигнальных молекул N-ацил-гомосеринлактоны (АГЛ), осуществляя так называемый Quorum-Quenching (QQ) эффект. В присутствии летучих соединений существенно подавлялся синтез АГЛ. Ингибирующее
Для корреспонденции: Хмель Инесса Александровна, e-mail: khmel@img.ras.ru
For correspondence: Khmel I.A., e-mail: khmel@img.ras.ru
действие на QS-ответ оказывал диметилдисульфид (ДМДС), основное ЛОС, синтезируемое Serratia ply-muthica IC1270. С помощью RT-PCR было показано, что общий пул летучих соединений, выделяемых штаммами Pseudomonas chlororaphis 449, P. fluore-scens B-4117 и S. plymuthica IC1270, а также отдельно ДМДС подавляют экспрессию генов синтаз АГЛ phzI и csal P chlororaphis 449. 1-Ундецен, основное ЛОС, образуемое штаммом P. fluorescens B-4117, не проявлял этого эффекта [13, 14]. Модуляция QS-ответа (снижение и увеличение) некоторыми ЛОС, выделяемыми морскими бактериями, была показана в работе [9] при использовании двух биосенсоров АГЛ.
Среди ЛОС, образуемых бактериями, часто присутствуют кетоны [7, 8, 10]. Целью настоящей работы было исследовать действие трех индивидуальных природных кетонов (2-нонанон, 2-гептанон, 2-ундеканон; рис. 1) на функционирование QS-сигнальных систем бактерий. Работу проводили с использованием трех lux-репортерных штаммов Escherichia coli, отвечающих на различные экзогенные АГЛ. Получены данные, показывающие, что кетоны, синтезируемые бактериями, могут взаимодействовать с QS-системами, включающими АГЛ в качестве сигнальных молекул, и снижать эффективность их функционирования.
Материалы и методы
Бактерии, условия выращивания
Штаммы бактерий, использованные в работе, приведены в таблице. Бактерии выращивали на жидкой среде LB или на LA («Sigma», США) при 300 C. Антибиотики добавляли в среду в концентрациях: тетрациклин гидрохлорид 20 мкг/мл («AppliChem», Германия), хлорамфеникол 25 мкг/мл («Sigma»). 2-нонанон (>99% чистоты); 2-гептанон (>99% чистоты); и 2-ундеканон (98%) были получены от «Sigma-Aldrich Chimie GmbH» (Steinheim, Germany).
Действие кетонов на биосенсоры
В работе были использованы 3 биосенсора, содержащие lux-оперон в качестве репортера. Клетки штаммов-биосенсоров выращивали в течение 17-18 ч при 300С на среде LB с соответствующими антибиотиками (см. таблицу). Культуры биосенсоров разводили в 10 раз в LB без антибиотиков. Кетоны добавляли непосредственно в жидкую культуру. АГЛ вносили в объеме этилацетата, не превышающем 2 мкл на 2 мл культуры; при большем количестве этилацетата подавляется рост культур E. coli. Пробирки плотно закрывали парафильмом, чтобы избежать удаления летучих кетонов, и культуры выращивали на качалке при 30oC.
Биолюминесценцию сенсоров, содержащих определенные концентрации кетонов и соответствующего AHL-стандарта, и контроля (содержат AHL-стандарт, но не содержат кетонов), измеряли по мере роста культур (обычно после 4 или 6 ч роста).
н3с
сн3 н3с
сн„
о
2-Нонанон
О
2-Ундеканон
2-Гептанон
Рис. 1. Кетоны, использованные в работе.
Измерения проводили на приборе Modulus microplate Multimode Reader («Turner BioSystems inc.», США). Затем проводили высев клеток из соответствующих разведений культур биосенсоров на среду LA и определяли число КОЕ/мл в контроле и при различных концентрациях кетонов. В каждом варианте эксперименты повторяли не менее 3 раз.
Результаты и обсуждение В работе были использованы три кетона, синтезируемые бактериями, с различной длиной углеводородной цепи, но с одинаковым положением кетонной группы в этой цепи (рис. 1).
Предварительно мы определили влияние концентрации добавленных АГЛ, узнаваемых использованными биосенсорами, и времени инкубации культур с АГЛ на индукцию QS-ответа, т.е. на величину биолюминесценции. Было установлено, что снимать результаты опытов лучше всего при выращивании культур с АГЛ в течение 6 ч, когда величина люминесценции достаточно высока, но еще не выходит на плато. Затем было необходимо определить, как влияют исследуемые кетоны на жизнеспособность клеток; было целесообразно использовать такие концентрации кетонов, которые не подавляли или слабо подавляли рост клеток, чтобы разделить эти два эффекта. Очевидно, что при гибели основного количества клеток сенсора будет наблюдаться резкий спад биолюминесценции, определяемой репортерным /мх-опероном, уже за счет гибели бактерий. Результаты проведенных опытов представлены на рис. 2-4.
При использовании репортерного штамма E. co/i JLD271/pAL105, содержащего компоненты QS-сис-
К с; о 100-
1-Z 90-
ё 80-
H
о 70-
R0-
о:
50-
т
ч 40-
а
ш т 30-
? ?0-
<Р
ч о 10-
s ш о4
Контроль, 2-нонанон, в отсутствие 1 мкМ кетонов
2-гептанон, 2-ундеканон, 5 мкМ 5 мкМ
-100
-90
о;
-80 ÎS
-70 Q. IX
-60 ё
-50 о
-40 <£
с
-30 к
III
-20 О
-10
Рис. 2. Действие кетонов на биолюминесценцию биосенсора E. coli JLD271 / pAL105.
Светлые столбцы - уровень биолюминесценции репортерного штамма, (относительные единицы) в % от контроля; штриховка - КОЕ/мл репортерного штамма, % от контроля. Контроль - в присутствии 3-oxo-C12-ГЛ, без добавления кетонов.
темы Pseudomonas aeruginosa (ген рецепторного регуляторного белка LasR, взаимодействующего с АГЛ, и ген синтазы АГЛ LasI со вставкой репортера /ux-оперона), в среду вносили N-3-оксо-додеканоил-гомосеринлактон (3-оксо-С12-ГЛ), специфичный для этой QS-системы [12]. При конечной концентрации АГЛ 0,25 мкг/мл и 2-нонанона 1 мкМ количество выросших за 6 ч опыта клеток составляло ~ 100%, как и в контроле без добавления кетона; в то же время, уровень биолюминесценции снижался в среднем до 46% от контроля (см. рис. 2), т.е. QS-ответ был более чувствителен к действию 2-нонанона, чем жизнеспособность клеток. При концентрации 2-нонанона 2 мкМ количество живых клеток уменьшалось в этих условиях до 62%, а биолюминесценция снижалась до 34% от контроля. При более высоких концентрациях 2-нонанона наблюдалась почти полная гибель клеток биосенсора.
Сходная картина наблюдалась при действии на биосенсор 2-гептанона (5 мкМ): отсутствие подавления выживаемости клеток и уменьшение до 47% уровня биолюминесценции репортерного штамма по
Штаммы бактерий, использованные в работе
Штамм
Характеристика
Происхождение или
Escherichia co/i DH5a
E. co/i DH5a / pSB401
E. co/i JLD271
E. co/i JLD271 / pAL101
E. co/i JLD271 / pAL105
F- endAl hsdR17 (rk- mk+) supE44 thi-1 recAl gyrA96 relAl 980dlacZ Д M15 X
E. co/i DH5a, pSB401: luxR+ luxI::luxCDABE, TetR p15A origin
K-12 ДксХ74 sdiA271::Cam
E. co/i JLD271, pAL101: rhlR+ rhlI::luxCDABE; TetR p15A origin
E. co/i JLD271, pAL105: lasR+ luxI:: luxCDABE; TetR p15A origin
Коллекция Института молекулярной генетики РАН, Москва
[15]
[17]
[17]
[17]
1 ЮО а н х
§ 80-Б 70-
90-
ч
i 60-ï 50-
S
и
¥ 30
40-
2010-
m
Контроль, 2-нонанон, в отсутствие 1 мкМ кетонов
-100 90
80 j
70 |
60 '
50 1
40 ;
30 I
20 <
10 '
2-гептанон, 2-ундеканон, 5 мкМ 5 мкМ
Рис.
. 3. Действие кетонов на биолюминесценцию биосенсора E. coli JLD271 / pAL101.
Обозначения те же, что и на рис. 2. Контроль - в присутствии С4-ГЛ, без добавления кетонов.
100
о;
§ 90 Н о.
5 801
6 70"
^ 60-□г
I 50-
403020-
ш Ю-
-100
-90
-80 К
с;
-70 а
I-
-60 s
н
-50 о
-40 с;"
?
-30 пг
Г)
-20 V
-10
-0
Контроль, в отсутствие кетонов
2-нонанон, 1 мкМоль
2-гептанон, 5 мкМоль
Рис. 4. Действие кетонов на биолюминесценцию биосенсора E.
coli DH5a / pSB401. Обозначения те же, что и на рис. 1, 2. Контроль - в присутствии С8-ГЛ, без добавления кетонов.
сравнению с контролем без 2-гептанона. Несколько иную картину мы наблюдали при использовании 2-ундеканона в такой же концентрации: биосенсор был более чувствителен к нему и количество КОЕ / мл снижалось до 50% от контроля - однако и в этом случае уровень биолюминесценции ингибировался в большей степени, до 20% от контроля. Таким образом, степень подавления биолюминесценции при действии трех указанных кетонов на биосенсор E. coli JLD271/ pAL105 была существенно большей, чем влияние кетонов на выживаемость клеток (см. рис. 2).
Вторым lux-биосенсором был штамм E. coli JLD27l/pAL101, сконструированный на основе компонентов второй использующей АГЛ QS-системы P. aeruginosa, RhlI/RhlR. Специфичным АГЛ для этой системы P. aeruginosa является N-бутаноил-гомосерин-лактон (С4-ГЛ) [12], который мы вносили в культуру в концентрации 0,25 мкг/мл. 2-Нонанон и 2-гептанон, при их использовании в тех же концентрациях, что и при действии на биосенсор E. coli JLD271/pAL105, не оказывали в этом случае заметного влияния на жизнеспособность клеток и уровень биолюминесценции. Однако при внесении в культуру 5 мкМ 2-ундеканона наблюдалось снижение уровня люминесценции до 30% по сравнению с контролем. Жизнеспособность клеток сенсора оставалась такой же, как в контроле (см. рис. 3). Таким образом, существенное влияние на QS-ответ в случае этой QS-системы из трех тестированных кетонов оказывал только 2-ундеканон. Увеличение концентрации кетонов приводило к резкому уменьшению выживаемости клеток.
Третьим репортерным штаммом, использованным в экспериментах по изучению действия кетонов на функционирование QS-систем, был lux-биосенсор E. coli DH5a / pSB401, полученный на основе QS-системы Vibrio fischeri Luxl/LuxR. Этот сенсор содержит ген рецепторного белка luxR и ген синтазы АГЛ luxI со вставкой lux-оперона; он наиболее чувствителен к АГЛ С6-ГЛ - С8-ГЛ, включая АГЛ, содержащие оксогруппы [15]. В качестве АГЛ стандарта мы вносили в культуру N-октаноил-гомосеринлактон (С8-ГЛ) концентрации в пробе
0,25 мкг/мл. Были использованы те же концентрации кетонов, что и в случае биосенсоров на основе LasI/LasR и RhlI/RhlR QS-систем. В присутствии 2-нонанона уровень биолюминесценции биосенсора снижался до 28% от уровня контроля, однако, и выживаемость клеток при его действии уменьшалась до ~ 40% от контроля. Эффект 2-гептанона на уровень биолюминесценции был более выраженным: снижение до 14% от контроля без 2-гептанона при уменьшении выживаемости до 55% от контроля (см. рис. 4). При увеличении концентраций 2-нонанона и 2-гептанона больше 2 и 5 мкМ соответственно наблюдалась почти полная гибель клеток биосенсора. При использовании 2-ундеканона биосенсор E. coli DH5a/pSB401 оказался крайне чувствительным, клетки при добавлении в культуру этого кетона практически все погибали. Причина этого различия в чувствительности к 2-ундеканону с клетками других биосенсоров неясна. Таким образом, при действии двух кетонов (2-нонанона и 2-гептанона) мы наблюдали ту же зависимость, что и в случае других сенсоров - снижение QS-ответа в большей степени, чем выживаемости клеток.
Суммируя результаты работы, можно видеть, что природные летучие кетоны могут модулировать экспрессию генов различных QS-систем бактерий, использующих различные АГЛ в качестве сигнальных молекул, в меньшей степени влияя на жизнеспособность клеток штаммов биосенсоров. Подавление экспрессии репортерного lux-оперона происходит, по-видимому, в результате ингибирования транскрипции оперона с промотора гена синтазы АГЛ. Эти эффекты зависят от уровня выживаемости биосенсоров и, как мы показали, лучше всего проявляются в условиях, когда кетоны слабо подавляют или не подавляют рост клеток. При этом наблюдались некоторые различия в чувствительности к кетонам биосенсоров, содержащих компоненты разных QS-систем. Ни в одном случае не обнаружено стимуляции кетонами экспрессии репортерного lux-оперона. Мы не определяли, влияют ли кетоны непосредственно на АГЛ. Однако, в предыдущей работе [13] показано, что при QQ-эффекте общего пула ЛОС, выделяемых штаммом P. chlororaphis, в котором содержались значительные количества кетонов 2-нонанона и 2-ундеканона, не происходило прямой инактивации АГЛ.
Синтез ЛОС - часто встречающееся свойство многих бактерий [16]. QS-системы, как известно, участвуют в регуляции большого количества клеточных процессов, в том числе в контроле антагонистических свойств бактерий, их способности к колонизации определенных экологических ниш, вирулентности. Можно предположить, что подавление QS-регуляции продуцируемыми ЛОС является еще одной стороной конкурентной борьбы бактерий вместе с ингибиторным действием ЛОС на их рост и жизнеспособность. Это свойство бактерий может быть важным для взаимодействия бактерий в почве и ризосфере растений, для защиты растений от фитопа-тогенных бактерий. Вполне возможно, что ЛОС играют существенную роль и во взаимоотношениях микроорганизмов микрофлоры человека.
Работа частично финансировалась грантом РФФИ № 12-04-00636.
Сведения об авторах:
Плюта Владимир Александрович (Plyuta VA.) -стажер РХТУ им. Д.И. Менделеева; науч. сотр. ФБУН ИМГ РАН; e-mail: plyutaba@gmail.com
Попова Александра Антоновна (Popova A.A.) - мл. научн. сотр.ФБУН ИМГ РАН; e-mail: french@land.ru
Кокшарова Ольга Алексеевна (Koksharova O.A.) - ст. научн. сотр. ФБУН ИМГ РАН; e-mail: oa-koksharova@ rambler.ru
Кузнецов Александр Евгеньевич (Kuznetsov A.E.) - канд. техн. наук, доцент, зам. зав. каф. биотехнологии РХТУ им. Д.И. Менделеева; e-mail: ae-kuz@yandex.ru
Хмель Инесса Александровна (Khmel I.A.) -д-р биол. наук, зав. лаб. регуляции экспрессии генов микроорганизмов ФБУН ИМГ РАН; e-mail: khmel@img. ras.ru
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
1. Barret M., Morrissey J.P., O'Gara F. Functional genomics analysis of plant growth-promoting rhizobacterial traits involved in rhizosphere competence. Biol. Fertil. Soils. 2011; 47: 729-43.
2. Ryu C.M., Farag M.A., Hu C.H., et al. Bacterial volatiles promote growth in Arabidopsis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003; 100: 4927-32.
3. Vespermann A., Kai M., Piechulla B. Rhizobacterial volatiles affect the growth of fungi and Arabidopsis thaliana. Appl. Environ. Microbiol. 2007; 73: 5639-41.
4. Dandurishvili N., Toklikishvili N., Ovadis M. et al. Broad-range antagonistic rhizobacteria Pseudomonas fluorescens and Serratia plym-uthica suppress Agrobacterium crown gall tumours on tomato plants. J. Appl. Microbiol. 2011; 110: 341-52.
5. Kai M., Effmert U., Berg G., Piechulla B. Volatiles of bacterial antagonists inhibit mycelial growth of the plant pathogen Rhizoctonia solani. Arch Microbiol. 2007; 87: 351-60.
6. Mueller H., Westendorf C., Leitner E. et al. Quorum-sensing effects in the antagonistic rhizosphere bacterium Serratia plymuthica HRO-C48. FEMSMicrobiol. Ecol. 2009; 67: 468-78.
7. Labows J.N., McGinley K.J., Webster C.F., Leyden J.J. Headspace analysis of volatile metabolites of Pseudomonas aeruginosa and related species by gas chromatography-mass spectrometry. J. Clin. Microbiol. 1980; 12: 521-6.
8. Zechman J.M., Labows J.N. Jr. Volatiles of Pseudomonas aeruginosa and related species by automated headspace concentration - gas chromatography. Can. J. Microbiol. 1985; 31: 232-7.
9. Schulz S., Dickschat J.S., Kunze B. et al. Biological activity of volatiles from marine and terrestrial bacteria. Mar. Drugs. 2010; 8: 2976-87.
10. Effmert U., Kalderas J., Warnke R., Piechulla B. Volatile mediated interactions between bacteria and fungi in the soil. J. Chem. Ecol. 2012; 38: 665-703.
11. Santoro M.V., Zygadlo J., Giordano W., Banchio E. Volatile organic compounds from rhizobacteria increase biosynthesis of essential oils and growth parameters in peppermint (Mentha piperita). Plant Physiol. Biochem. 2011; 49: 1177-82.
12. Хмель И.А., Метлицкая А.З. Quorum Sensing регуляция экспрессии генов - перспективная мишень для создания лекарств против пато-генности бактерий. Молекулярная биология. 2006; 40: 195-210. [Khmel I.A., Metlitskaia A.Z. Quorum sensing of genes expression-perspective drug target against bacterial pathogenicity. Mol. Biol. (Moskow). 2006; 40(2): 195-210 (in Russian).]
13. Chernin L., Toklikishvili N., Ovadis M., et al. Quorum-sensing quenching by rhizobacterial volatiles. Environ Microbiol Rep. 2011; 3: 698-704.
14. Chernin L., Toklikishvili N., Ovadis M., Khmel I. Quorum Sensing Quenching by volatile organic compounds emitted by rhizosphere bacteria. Mol. Microb. Ecol. 2013; 2: 791-800.
15. Winson M.K., Swift S., Fish L., et al. Construction and analysis of luxCDABE-based plasmid sensors for investigating N-acyl homo-serine lactone-mediated quorum sensing. FEMS Microbiol. Lett. 1998; 163: 185-92.
16. Kai M., Haustein M., Molina F., et al. Bacterial volatiles and their action potential. Appl. Microbiol. Biotech. 2009. V. 81. P. 1001-12.
17. Lindsay A., Ahmer B.M. Effect of sdiA on biosensors of N-acylho-moserine lactones. J. Bacteriol. 2005; 187: 5054-8.
Поступила 20.02.14 Received 20.02.14
THE ABILITY OF THE NATURAL KETONES TO INTERACT WITH BACTERIAL QUORUM SENSING SYSTEMS
Plyuta V. A.1,2, Popova А. А.1, Koksharova О. А.13, Kuznetsov A. E.2, Khmel I. A.1
institute of Molecular Genetics, Russian Academy of Sciences, Moscow, Russia; 2Mendeleev University of Chemical Technology
of Russia, Moscow, Russia; 3Belozersky Institute of Physical-Chemical Biology, Lomonosov Moscow State University, Moscow,
Russia
The effect of the natural ketones emitted by bacteria (2-nonanone, 2-heptanone, 2-undecanone) on the functioning of the Quorum Sensing (QS) systems was studied. In this work, three lux-reporter strains containing the components of the LasI/LasR, RhlI/RhlR, LuxI/ LuxR QS systems were used as biosensors for the N-acyl-homoserine lactones. It was shown that at concentrations of ketones that exhibited little or no bactericidal action the ketones could modulate the QS-response by suppressing the expression of the lux-operon reporter to a greater extent than the cell viability of these strains. Key words: ketones, Quorum Sensing, lux-biosensors.
