CC BY
68
JOURNAL OF NEW MEDICAL TECHNOLOGIES, eEdition - 2017 - N 4
УДК: 615.33+615.065 DOI: 10.12737/article_5a32124941da88.60854778
СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ НАЧАЛЬНЫХ КАРДИОТОКСИЧЕСКИХ ЭФФЕКТОВ
ДОКСОРУБИЦИНА
В.И. ХАРИНА, Т.А. БЕРЕЖНОВА, К.М. РЕЗНИКОВ, А. Д. БРЕЗДЫНЮК
ФГБОУ ВО ВГМУ им. Н.Н. Бурденко Минздрава России, ул. Студенческая, д.10, Воронеж, 394000, Россия, e-mail: vista.vrn@mail.ru
Аннотация. Доксорубицин - антибиотик антрациклинового ряда, является мощным противоопухолевым агентом, применяющимся для лечения широкого спектра онкологических заболеваний. Однако, его использование ограничивается из-за развития жизнеугрожающей кардиомиопатии. Этот факт, в свою очередь, ставит перед врачами новую задачу - раннее выявление кардиотоксичности.
Однако, существующие способы раннего выявления кардиотоксичности, вызванной доксорубици-номлибо мало информативны, либо регистрируют уже наступившие грубые изменения структуры и функции, что не позволяет в полной мере оперативно предпринимать меры по профилактике развития осложнения.
Таким образом, целью нашего исследования стала разработка способа выявления начальных кар-диотоксических эффектов доксорубицина методом непрерывной регистрации разности температур между биологически активной точкой и интактной зоной кожи.
Эксперимент был проведен на 36 кроликах-самцах породы Шиншилла. Кардиомиопатию моделировали фармакологическим путем - в/в введением доксорубицина. Для оценки кардиотоксичности использовались акупунктурные, биохимические, инструментальные и морфологические методы исследования.
В результате проведенного эксперимента на основании изменений показателей дифференциальной термометрии, ЭКГ, биохимических показателей крови и морфологического исследования показано, что доксорубицин в коммулятивной дозе 8 мг/кг вызывает развитие кардиомиопатии.
В статье изложены данные о динамике изменении показателей дифференциальной термометрии биологически активных точек при введении животным доксорубицина. Установлено, что при помощи этого метода можно судить об активности функционировании меридиана в условиях развития патологического процесса.
Ключевые слова: мониторирование действия лекарств, непрерывной регистрация разности температур, биологически активные точки, доксорубицин, кардиотоксичность, кардиомиопатия.
METHOD FOR IDENTIFICATION OF INITIAL CARDIOTOXIC EFFECTS
OF THE DOXORUBICIN
V.I. KHARINA, T.A. BEREZHNOVA, K.M. REZNIKOV, A.D. BREZDYNIUK
Voronezh State N.N. Burdenko Medical University, Studencheskaya str., 10, Voronezh, 394000, Russia,
e-mail: vista.vrn@mail.ru
Abstract. Doxorubicin, an antibiotic of the anthracycline series, is a potent antitumor agent used to treat a wide range of oncological diseases. However, its use is limited by the development of life-threatening cardiomyopathy. This fact, in turn, puts before doctors new task - early detection of cardiotoxicity.
However, the existing methods of early detection of cardiotoxicity caused by doxorubicin are either not very informative, or they register already severe changes in structure and function that do not allow to take measures to prevent the development of complications in full.
Thus, the purpose of our study was to develop a method for detecting the initial cardiotoxic effects of doxorubicin by continuously recording the temperature difference between the biologically active point and the intact skin zone.
The experiment was carried out on 36 male rabbits of the Chinchilla breed. Cardiomyopathy was modeled pharmacologically -intravenous the administration of doxorubicin. To assess cardiotoxicity we used acupuncture, biochemical, instrumental and morphological methods of investigation.
As a result of the experiment on the basis of changes in the parameters of differential thermometry of biologically active point, ECG, biochemical blood indices and morphological study, it was shown that doxorubicin in a commutative dose of 8 mg / kg causes the development of cardiomyopathy.
The article contains data on the dynamics of changes in the parameters of differential thermometry of biologically active point when doxorubicin is administered to animals. It is established that using the differential
JOURNAL OF NEW MEDICAL TECHNOLOGIES, eEdition - 2017 - N 4
thermometry method of biologically active point, one can judge the activity of the meridian functioning in the conditions of development of the pathological process.
Key words: drug monitoring, continuous temperature difference recording, biologically active points, doxorubicin, cardiotoxicity, cardiomyopathy.
Актуальность. Доксорубицин - антибиотик антрациклинового ряда, является мощным противоопухолевым агентом, применяющимся для лечения широкого спектра онкологических заболеваний [13]. Однако, его использование ограничивается из-за развития тяжелого жизнеугрожающего состояния -кардиомиопатии [4, 11, 15]. Этот факт, в свою очередь, ставит перед врачами новую задачу - раннее выявление кардиотоксичности, вызванной доксорубицином, решение которой имеет основополагающее значение для профилактики сердечной недостаточности.
В последнее время было проведено много исследований, посвященных методам раннего выявления кардиотоксичности, вызванной доксорубицином [14, 16].Однако, существующие методы диагности-кив большинстве случаев либо мало информативны [12], либо регистрируют уже наступившие грубые изменения структуры и функции, что не позволяет в полной мере оперативно предпринимать меры по профилактике развития осложнений.
Постоянство структуры и функции поддерживается системой регуляторных процессов в пределах определенного физиологического коридора. Развитие патологии, в свою очередь, сопровождается длительным и постоянным нарушением процессов регуляции, которое является первичным и возникает до появления структурно-функциональных изменений [5,10]. Одним из направлений, позволяющих регистрировать изменения регуляторных процессов, является акупунктурная диагностика, которая позволяет оценивать состояние внутренних органов в режиме реального времени по электрическим и температурным параметрам биологически активных точек (БАТ). В частности, возможно, производить термопунк-турное мониторирование действия лекарственных средств на основании изменения температурных показателей БАТ [3]. Опираясь на эти данные можно предположить возможным, что термопунктурная диагностика позволит оценить состояние организма, в том числе и при развитии доксорубициновой кардио-миопатии.
Цель исследования - обосновать возможность применения способа мониторирования действия лекарственных средств методом дифференциальной термометрии БАТ для выявления кардиотоксично-сти, вызванной доксорубицином.
Материалы и методы исследования. Рандомизированное проспективное исследовании проводились на 36 кроликах-самцах породы Шиншилла массой 3,5-4,2 кг. В соответствии с положениями о правилах работы с животными [9]. Кардиомиопатию моделировали фармакологическим путем -в/ввведением доксорубицина [12]. Модель доксорубициновой кардиомиопатии воспроизводит основные метаболические и морфофункциональные изменения, характерные для дилатационной кардиомиопатии [4]. Все животные были разделены на 2 группы. Простую рандомизацию осуществляли на основании таблицы случайных чисел. Первая группа - опытная (30 животных), животным данной группы 1 раз в неделю в краевую вену уха вводили доксорубицин, из расчета 2 мг на 1 кг, четырехкратно. Вторая группа - контрольная (6 животных), животным данной группы вводили воду для инъекций в эквивалентной доксорубицину дозе. Животные наблюдались ежедневно и взвешивались еженедельно.
Для регистрации разности температур (ДТ) между БАТ и интактной зоной кожи использовался автономный регистратор разности температур, содержащий дифференциальную термопару с термоэлектрическим усилителем постоянного тока и блок цифровой регистрации термограммы (патент на полезную модель № 134028). В качестве методологической основы анализа разности температур выступал математический анализ ритма сердца Р.М. Баевского [8]. На БАТ устанавливался основной датчик термопары, а второй накладывался на интактную зону кожи на расстоянии 1,0-1,5 см. вне сосуда. Записанные в память прибора термограммы по интерфейсу передавались в персональный компьютер для детального анализа и сохранения в базе данных. Для исследования была выбрана БАТ меридиана сердца, расположенная на ухе кролика [2]. Регистрацию ДТ производили всем кроликам в течении 120 секунд до начала введения доксорубицина и на 1 сутки после введения последней дозы. Анализ полученных термограмм проводился по 16 показателям дифференциальной термометрии БАТ, описывающих процессы функционирования меридиана, программа расчета которых зарегистрирована в Реестре программ для ЭВМ (свидетельство № 2011611929 от 2.03.2011) [6].
До и на 1 сутки после введения последней дозы доксорубицина у всех кроликов регистрировали ЭКГ в 3-х стандартных отведения (I, II, III). Оценивали: ЧСС, продолжительность интервала PQ; наличие и характер нарушений ритма и реполяризации. Выделяли 3 степени изменения ЭКГ: I - снижение вольтажа зубцов R и/или Т, II - инверсия зубца Т, III - элевация сегмента ST и/или появление патологического зубца Q. В плазме крови определяли аланин-аминотрансферазу (АЛТ), аспартат-аминотрансферазу (ACT), лактатдегидрогеназу (ЛДГ) и общую креатинкиназу (КФК). По окончанию эксперимента, после эвтаназии животных под обязательным эфирным наркозом, производили взятие фрагментов левого же-
JOURNAL OF NEW MEDICAL TECHNOLOGIES, eEdition - 2017 - N 4
лудочка сердца с последующей фиксацией их в нейтральном растворе 10% формалина. Спустя 24-48 часов биоматериал подвергался стандартной процедуре пробоподготовки для заливки биообразцов в парафин. Из подготовленных блоков готовили гистологические срезы толщиной 5 мкм, которые окрашивали гематоксилином Майера и эозином в целях проведения обзорной микроскопии [1]. Для выявления поврежденных участков миокарда с ишемическими нарушениями срезы окрашивали по методу ГОФП (гематоксилином, основным фуксином, пикриновой кислотой) [7]. Оценка метаболического состояния сократительных элементов миокарда производилась путем количественного подсчета кардиомиоциов с признаками фуксинофили на поле зрения с помощью комплекса визуализации с программным пакетом "Микро-Анализ View" при использовании объектива х40 (ОАО ЛОМО - Микросистемы). Исследуемые площади микропрепарата не пересекались друг с другом. Для получения объективного представления об уровне метаболических нарушений миокарда анализировали не менее 100 полей зрения в каждом срезе.
Животные, которые спонтанно умерли во время исследования, не были включены в анализ данных. Статистическая обработка количественных данных проводилась с использованием параметрических и непараметрических критериев. Различия оценивали как достоверные при p<0,05.
Результаты и их обсуждение. Общая токсичность. В ходе эксперимента 8 кроликов, получавших доксорубицин, спонтанно умерли (2 кролика после кумулятивной дозы 4 мг/ кг и по 3 кролика после коммулятивных доз 6 мг/кг и 8 мг/кг соответственно). Масса тела животных контрольной группы на протяжении всего эксперимента достоверно не изменялась. У животных опытной группы наблюдалась потеря массы тела в среднем на 350 г, что на 10% меньше по сравнению с исходными значениями (табл. 1).
Таблица 1
Изменения среднего веса кроликов во время кардиотоксичности, вызванной доксорубицином (и=22, M±m)
Группы Исходные значения На 22 день эксперимента
Контрольная 3,6±0,08 3,6±0,06
Опытная 3,8±0,06 3,4±0,07*
Примечание: *-/><0,05 - различия достоверны по сравнению с исходными значениями.
В процессе записи разности температур между БАТ меридиана сердца и интактной зоной кожи в ходе моделирования доксорубициновой кардиомиопатии отмечали ее колебания (флуктуации), как в положительную от изолинии(стационарная разность температур) сторону (I тип), так и в отрицательную (II тип). Регистрировали частоту этих флуктуаций и длительность их отсутствия. Нами были проанализированы 16 показателей и выявлены 7 наиболее чувствительных и информативных (табл. 2), к которым относились: 1 - (ОКПО) - общее количество флюктуаций I и II типа, оценивает 2 противоположенных процесса функционирования меридиана; 2 - (КПО/мин) - общее количество флюктуаций I и II типа в 1 минуту, оценивает 2 противоположенных процесса функционирования меридиана в 1 мин; 3 -(КП/мин) - количество флюктуаций I типа в 1 минуту, оценивает однонаправленность процессов функционирования меридиана I типа; 4 - (КО/мин) - количество флюктуаций II типа в 1 минуту, оценивает однонаправленность процессов функционирования меридиана II типа; 7 - (ДО/мин) - длительность флюктуаций II типа в 1 минуту, оценивает устойчивость процессов функционирования меридиана II типа; 14 - (ДГС/мин) - длительность отсутствия флюктуаций за 1 мин, указывает на отсутствие функционирования меридиана по длительности; 16 - (% ДФ/2мин) - процент длительности флуктуаций в течение 120 сек, показатель дает представление о доле регуляторных воздействий, произошедших за 2 мин. По этим параметрам можно оценивать процесс формирования регуляторных воздействий в реальном времени, и тем самым получать представление о действии лекарственных средств. Величины показателей выражали в расчётных единицах (р. ед.). В ходе исследования оказалось, что показатель ДГС/мин изменялся всегда обратно пропорционально остальным 6 показателям.
Так, после 4-х кратного введения животным доксорубицина в кумулятивной дозе 8 мг/кг отмечалось снижение активности функционирования меридиана по сравнению с исходным уровнем. Установлено, что ряд описываемых показателей изменялся в сторону уменьшения своих значений более чем на 22% (р<0,05), к ним относились: ОКПО (1), КПО/мин (2), КП/мин (3), КО/мин (4), ДО/мин (7). Процента регуляторных воздействий за 2 мин (16 показатель) также снижался с 32% до 25%. На фоне общей тенденции к уменьшению показателей ДТ БАТ показатель ДГС/мин (14) - увеличивался более чем на 20% (р<0,05).
Показатели разности температур БАТ меридиана сердца животных контрольной группы в ходе эксперимента достоверно не изменялись.
Таким образом, изменения вышеописанных показателей свидетельствует о том, что введение док-сорубицина приводит к достоверному снижению интенсивности регуляторных процессов.
JOURNAL OF NEW MEDICAL TECHNOLOGIES, eEdition - 2017 - N 4
Таблица 2
Показатели дифференциальной термометрии БАТ здоровых животных и при доксорубициновой кардиомиопатии (р. ед., M± m, n=22)
Показатели ДТ БАТ Время регистрации
Исходные значения На 22 день эксперимента
1 36,81±1,45 28,69±1,32*
2 18,41±0,72 14,34±0,66*
3 9,13±0,4 7,08±0,57*
4 9,28±0,43 7,26±0,6*
7 9,78±0,5 7,1±0,67*
14 38,22±1,51 46±1,25*
16 (%) 32,18±1,56 25,09±2,04*
Примечание: *-р<0,05 - различия достоверны по сравнению с исходным уровнем;
р. ед. - расчетные единицы
При анализе ЭКГ животных опытной группы были выявлены изменения, свидетельствующие о кардиотоксическом действии доксорубицина (рис. 1). Так, ЧСС снижалось на 14% (р<0,05), по сравнению со значениями, полученными до введения. У 12 из 22 животных (54%) наблюдались изменения, характерные для повреждения миокарда III степени, у 8 животных (37%) II степени и у 2 животных (9%). Интервал PQ достовенрно не изменялся.
При анализе ЭКГ животных контрольной группыпризнаков патологических и специфических изменений выявлено не было, так же как и не было выявлено изменения величины ЧСС и инт. PQ (рис. 1).
%
Рис. 1. Изменения ЭКГ при доксорубициновой кардиомиопатии у кроликов (в % к исходным показателям)
На фоне введения доксорубицина в опытной группе все исследуемые нами биохимические показателя возрастали. Так АЛТ достоверно увеличился на 85% (р<0,05) по сравнению с исходными значениями, АСТ на 168% (р<0,05), ЛДГ на 183% (р<0,05), КФК на 266% (р<0,05). В контрольной группе биохимические показатели плазмы крови изменялись не значительно (табл. 3).
Таблица 3
Динамика биохимических показателей крови кроликов при введении доксорубицина (М± т, п=22)
Показатели Исходные значения На 22 день эксперимента
АЛАТ 41,1±2,7 76,2±4,7*
АСАТ 25,6±1,7 68,8±4,2*
ЛДГ 203,9±13,5 577,6±18,5*
КФК 284,2±14,8 1041,1±7,3*
Примечание: *-/><0,05 - различия достоверны по сравнению с исходным уровнем
ВЕСТНИК НОВЫХ МЕДИЦИНСКИХ ТЕХНОЛОГИЙ, электронный журнал - 2017 - N 4 JOURNAL OF NEW MEDICAL TECHNOLOGIES, eEdition - 2017 - N 4
Таким образом, рост биохимических показателей подтверждает кардиотоксическое действие док-сорубицина.
При изучении биоматериала контрольной группы животных кардиомиоциты с признаками фукси-нофилии встречались редко (табл. 4, рис. 2). Единичные кардиомиоциты с метаболическими нарушениями выявлялись без видимой упорядоченности на всем протяжении миокарда. Очевидно, наблюдающиеся изменения сократительных элементов были обратимы и представляли собой преходящее состояние метаболического статуса кардиомиоцитов.
етвн SBB^ië SSSfîrv". «• * -/
• . "-.-'а- -л-- о - -
,, ^ ••• 4.:v: .
, ; ■•>. . .V - ■ ■> '
-а'-' - BP -, :
А.
S
на
Б.
Рис. 2. Миокард животных контрольной группы. Единичные кардиомиоциты с признаками фуксинофиллии цитоплазмы. Окраска: ГОФП-метод. А - ув.*20, Б - ув. х40
В опытной группе животных после введения доксорубицина морфологическое исследование показало высокую распространенность ишемических и метаболических повреждений миокарда. Об этом свидетельствовало достоверное увеличение по сравнению с показателями контрольной группы животных содержания кардиомиоцитов с фуксинофильным субстратом в цитоплазме при окраске методом ГОФП. Количество фуксинопозитивных кардиомиоцитов в поле зрения животных опытной группы в 8,3 раза превышало показателями контрольной группы (табл. 4). Довольно частой картиной было образование определенных территорий, на протяжении которых кардиомиоциты с ишемическими изменениями формировали обширные группы (рис. 3). На достаточно серьезную степень метаболических нарушений при моделировании кардмиомиопатии указывала высокая интенсивность фуксинофилии цитоплазмы сократительных элементов, диффузной распространявшаяся на все структурные элементы кардиомиоцитов (рис. 3. б.).
Рис. 3. Миокард животных основной группы. Окраска: ГОФП-метод. А - формирование обширных групп кардиомиоцитов с фуксинофильным субстратом в цитоплазме, ув. х20. Б - высокая интенсивность фуксинофилии цитоплазмы сократительных элементов, ув. х40
Таблица 4
Количество кардиомиоцитов с признаками ишемических нарушений (на п/з, методика - окрашивание ГОФП-методом)
Группы Количество кардиомиоцитов с признаками фуксинофилии цитоплазмы
Контрольная группа 1,9 ±0,1
Опытная группа 15,7 ±1,3*
Примечание: *- /><0,05 - по сравнению с показателями контрольной группы животных
JOURNAL OF NEW MEDICAL TECHNOLOGIES, eEdition - 2017 - N 4
Таким образом, в опытной серии после четырехкратного введения доксорубицина в кумулятивной дозе 8 мг/кг на 22-е сутки у всех животных нами были выявлены изменения ЭКГ, биохимических показателей крови и морфологические изменения свидетельствующие о кардиотоксическом действии препарата.
Поскольку, на фоне введения доксорубицина динамика изменения ДТ БАТ меридиана сердца была значительно выражена в сравнении с группой контроля, можно предположить, что снижение показателей ДТ БАТ меридиана сердца, в частности ОКПО (1), КПО/мин (2), КП/мин (3), КО/мин (4), ДО/мин (7) более чем на 20%, подтверждает неблагоприятную динамику развития кардиотоксичности в процессе введения доксорубицина.
Выводы:
1. Разработанный способ мониторирования действия лекарственных средств дает возможность выявить в режиме реального времени развитие кардиотоксичности при введении доксорубициномна основании динамики показателей дифференциальной термометрии БАТ.
2. Установлены наиболее информативные показатели дифференциальной термометрии БАТ, ха-растеризующие действие лекарственных средств, к которым относятся: 1 (ОКПО); 2 (КПО/мин); 3 (КП/мин); 4 (КО/мин); 6 (ДП/мин); 7 (ДО/мин); 14 (ДГС/мин).
Литература
1. Атякшин Д.А., Бухвалов И.Б., Тиманн М. Гистохимия ферментов. Воронеж: Издательско-полиграфический центр «Научная книга», 2016. 120 с.
2. Казеев Г.В. Ветеринарная акупунктура. М.: РИО РГАЗУ, 2000. 398 с.
3. Лаптева В.И. Акупунктурный мониторинг действия лекарственных средств // Современные проблемы науки и образования. [Электронный ресурс]. 2014. № 5. URL: http://www.science-education.ru/119-14952.
4. Особенности антрациклиновой модели кардиомиопатии: снижение синтеза белка, нарушение внутриклеточной регенерации и безнекротической элиминации кардиомиоцитов / Семенов Д.Е. [и др.] // Бюллетень экспериментальной биол. и медицины. 2001. Т. 131, № 5. С. 594-599.
5. Резников К.М., Борисова Е.А.Концепция генерализованной рецепторно-информационной системы организма // Традиционная Медицина. 2012. Т. 31, № 4. С. 52-55.
6. Резников К.М., Борисова Е.А., Лаптева В.И., Глотов А.И. Показатели дифференциальной термограммы биологически активных точек для оценки действия лекарственных средств // Фундаментальные исследования. 2015. № 1-3. С. 577-582.
7. Сапожников А.Г., Доросевич А.Е. Гистологическая и микроскопическая техника. Смоленск, 2000. С. 151-153.
8. Шлык Н.И. Сердечный ритм и тип регуляции у детей, подростков и спортсменов. Ижевск: Изд-во «Удмуртский университет», 2009. 259 с.
9. Этические, деонтологические и методологические вопросы проведения работ и доклинических исследование на лабораторных животных: учеб. пособие для врачей, интернов, аспирантов, ординаторов, студентов мед. и фармацевт. вузов / Покровский М. В. [и др.]. Белгород: ИПК НИУ БЕЛГУ, 2011. 88 с.
10. Hossu M., Rupert R. Quantum events of biophoton emission associated with complementary and alternative medicine therapies // J. Altern. Complement. Med. 2006. Vol. 12, № 2. P. 119-124.
11. Long-term effects of treatments for childhood cancers / Alvarez J.A. [et al.] // Curr. Opin. Pediatr. 2007. №19. P. 23-31.
12. Oxidative stress markers may not be early markers of doxorubicin-induced cardiotoxicity in rabbits / Lai Renchun [et al.] // Experimental and therapeutic medicine. 2011. №2. P. 947-950.
13. Phase II trial of combination of pegylated liposomal doxorubicin, cisplatin, and infusional 5-fluorouracil (CCF) plus trastuzumab as preoperative treatment for locally advanced and inflammatory breast cancer / Torrisi R. [et al.] // Clin. Breast Cancer. 2010. №10. P. 483-488.
14. The use of cardiac biomarkers in detection of cardiotoxicity associated with conventional and highdose chemotherapy for acute leukemia / Horacek J.M. [et al.] // Exp. Oncol. 2010. №32. P. 97-99.
15. Thrombopoietin protects against in vitro and in vivo cardiotoxicity induced by doxorubicin / Li K. [et al.] // Circulation. 2006. №113. P. 2211-2220.
16. Use of multiple biomarkers for evaluation of anthracycline-inducedcardiotoxicity in patients with acute myeloid leukemia / Horacek J.M. [et al.] // Exp. Oncol. 2008. №30. P. 157-159.
References
1. Atyakshin DA, Bukhvalov IB, Timann M. Gistokhimiya fermentov [the Histochemistry of enzymes]. Voronezh: Izdatel'sko-poligraficheskiy tsentr «Nauchnaya kniga»; 2016. Russian.
2. Kazeev GV. Veterinarnaya akupunktura [Veterinary acupuncture]. Moscow: RIO RGAZU; 2000. Russian.
