CC BY
68
Научные М©©ЛЕЙ@©АНМЯ
_
Рис. 5. Микропрепарат дентина; ультразвуковое препарирование; окраска эозин; ув. 100
'■ - ■ «н^, А4 >
Рис. 7. Микропрепарат дентина; ультразвуковое препарирование; окраска эозин; ув. 200
тонкой бесструктурной базофильной линии. Смазанный слой выражен в меньшей степени по сравнению с таковым в полости, отпрепарированной ротационными инструментами (рис. 5-8).
Таким образом, в ходе исследования выявлены существенные морфо-
Рис. 6. Микропрепарат дентина; ультразвуковое препарирование; окраска эозин; ув. 200
Рис. 8. Микропрепарат пульпы и дентина; ультразвуковое препарирование; окраска эозин; ув. 200
логические различия твердых тканей зубов, обработанных ультразвуковым и классическим методами одонтопре-парирования. Сравнительная морфологическая и морфометрическая характеристика показала меньшую выраженность смазанного слоя, более
ровную поверхность дентина, высокую конусность и большую сглаженность зубцов дентина, меньшую максимальную высоту зубца дентина в микропрепаратах зубов, обработанных ультразвуковым препарированием.
В сравнительном аспекте оптимальным методом одонтопрепарирования является ультразвуковой, который не только обеспечивает безболезненное препарирование, минимизирует стресс ребенка в процессе стоматологического вмешательства, но и является более щадящим с точки зрения морфологической характеристики твердых тканей зубов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Дружинина О.Н. // Уральский стом. журн. - 2001. -№2. - С.9-12.
2. Елин В.А. Оптимизация технологий подготовки твердых тканей зуба к реставрации: автореф. дис. ... канд. мед. наук - Самара, 2004 -25 с.
3. Ломиашвили Л.М., Погадаев Д.В., Елендо М.Б., Михайловский С.Г. // Клинич. стоматология. - 2010. -№1. - С.30-33.
4. Максимовский Ю.М., Фурлянд Д.Г. // Новое в стоматологии. - 2001. - №2. - С.3-11.
5. Розенфельд П.С. Влияние препарирования ультразвуком на ткани зуба и амфодонт: эксперим. исследование: дис. .канд. мед. наук. - М., 1958. - 124 с.
6. Фурлянд Д.Г. Применение системы «Sonicsys ap-prox» при лечении II класса кариеса по Блэку: дис. .канд. мед. наук. - М., 2003. - 120 с.
7. Юдина НА., Манюк О.Н. // Соврем. стоматология. - 2008. - №4. -С.12-15.
8. Daniel W. Boston// Клинич. стоматология. - 2010. -№1. - С.34-38.
9. GaryUnterbrink// Новое в стоматологиии. - 2001. -№2. - С.28-36.
Поступила 06.01.2012
СПОСОБ ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОЙ ОЦЕНКИ СТОМАТОЛОГИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
Поляков К.М., Богдан А.С.
Белорусская медицинская академия последипломного образования, Минск Республиканский научно-практический центр гигиены
Paliakov K.M., Bogdan A.S.
Belarusian Medical Academy of Post-Ggraduate Education, Minsk Republican Scientific Practical Center of Hygiene
Method of toxicological evaluation of dental materials
Резюме. Все без исключения реставрационные материалы, поступающие в распоряжение врачей-стоматологов, проходятобязательную токсикологическую экспертизу. Степень возможной токсичности материалов предопределяет их использование в пракике врача. В настоящее время большую актуальность при токсикологическихисследованияхприобретаетразработка методологическихи теоретическихвопросов применения биологических тест-объектов, которые позволяют в короткие сроки получить ценную информацию о наличии химических веществ и их токсическом действии.
Ключевые слова: стеклокерамика, дисиликатлития, нанокомпозит, микрогибридный композит, гибридный композит, тест-объект Tetrahy-menapyriformis.
Summary. All without exception restorative materials received at the disposal of dentists go through mandatory toxicological examination. The degree of the possible toxicity of materials determines their use in the practice of a dentist. Currently, more relevant for toxicological studies acquires the development of methodological and theoretical issues of biological test-objects, which allow to quickly get valuable information about the presence of certain chemicals and their toxic effect.
Keywords: glass ceramics, lithium disilicate, nanocomposite, micro-hybrid composite, hybrid composite, the test object Tetrahymenapyriformis.
Прежде чем поступить на стоматологический рынок, новые реставрационные материалы проходят экспертизу соответствия физико-химических свойств заявляемым производителем позициям. Оценка безопасности медицинских изделий включает в себя санитарно-химические и токсикологические испытания. Санитар-но-химические испытания проводятся с целью идентификации и количественного определения потенциально опасных химических соединений, мигрирующих в вытяжку из медицинских изделий и материалов. Токсикологические испытания проводятся с целью выявления потенциально опасного воздействия медицинских изделий на организм: оценка гемолитической активности, цитотокси-ческого, раздражающего, сенсибилизирующего, общетоксического, мутагенного и других эффектов.
Токсиколого-гигиеническая оценка современных стоматологических материалов имеет большую значимость, а ряд последних публикаций свидетельствует о токсичности пломбировочных композитов. Санитарно-химическое исследование пятнадцати композитов химического и светового отвердения выявило миграцию мономеров в модельные среды из всех образцов. То есть возможно попадание их в слюну или проникновение в пульпу [1].
Вторая проблема применения композитных пломбировочных материалов -колонизация пломб микроорганизмами. В клинико-лабораторном исследовании Максимовским Ю.М. и др. получены данные по адгезии микробной флоры к используемым композитным пломбировочным материалам, особенностям формирования микробной биопленки и скорости его образования в зависимости от методов полирования пломбы. Установлен высокий уровень колонизации поверхности реставрационного материала «Compolyte+» периодонтопа-тогенными видами бактерий, что может способствовать рецидивам заболеваний периодонта [2].
В каждой стране приняты свои стандарты оценки реставрационных материалов для терапевтической и ортопедической стоматологии, существует также международная оценка по определенным стандартам ISO.
Поскольку из полимерных материалов одновременно мигрирует комплекс химических веществ (компонентов рецептуры и продуктов деструкции), информация о патогенном воздействии отдельных компонентов комплекса может оказаться
недостаточной для принятия решения о допустимости использования этих материалов. Кроме этого, мигрирующий комплекс химических веществ не всегда может быть учтен и охвачен методами са-нитарно-химического анализа. При этом наряду с определением уровня миграции продуктов неполной полимеризации и деструкции материалов рекомендуются токсикологические исследования с использованием теплокровных животных, их клеток и тканей (эритроцитов кролика, спермы быка) [1, 4—6]. Биологическая оценка вытяжек в экспериментах на теплокровных животных длится 10-12 месяцев. Проведение таких опытов - сложная, дорогостоящая и не всегда доступная процедура. В связи с этим внедрение экспрессных биологических методов, позволяющих получить быструю и достоверную информцию, является важным и перспективным направлением в токсикологии и гигиене применения полимерных материалов.
Большую актуальность при токсикологических исследованиях приобретает разработка методологических и теоретических вопросов применения биологических тест-объектов (культур клеток, микроорганизмов, простейших организмов и т.д.), которые позволяют в короткие сроки получить ценную информацию о наличии химических веществ и их токсическом действии.
Учитывая вышеизложенное, оценка биологического действия новых видов стоматологических материалов на тест-объект Tetrahymenapyriformis, как один из этапов их токсиколого-гигие-нической оценки, имеет несомненную актуальность.
Цель исследования - представить метод токсиколого-гигиенической оценки полимерных материалов и оценить биологическое действие новых видов реставрационных стоматологических материалов на тест-объект Те1гаИутепаруп1огт1$.
Материалы и методы
В Республиканском научно-практическом центре гигиены разработан метод токсиколого-гигиенической оценки полимерных материалов с использованием в качестве тест-объекта популяции одноклеточных организмов инфузорий Tetrahymenapyriformis [7-9]. Метод позволяет оценить опасность для живого организма комплекса мигрирующих из полимера веществ даже в количествах, не обнаруживаемых санитарно-химичес-ким анализом.
Приготовление вытяжек из стоматологических материалов. Токсиколого-
гигиеническая оценка новых стоматологических материалов проводится в соответствии с требованиями международного стандарта серии ГОСТ Р иСо-10993-2009 [3]. Вытяжки из реставрационных стоматологических материалов готовятся в соответствии с условиями моделирования, приведенными в Инструкции 1.1.10-12-41-2006 [8].
Метод позволил оценить токсикологические характеристики двух современных групп реставрационных материалов: 1-я группа - стеклокерамика, 2-я - композиты.
1-я серия эксперимента - 3 флакона.
1 - контроль, модельная среда (дистиллированная вода).
2 - модельная среда с образцом № 1 (дисиликатлитиевая стеклокерамика).
3 - модельная среда с образцом № 2 (фторитсто-апатитовая стеклокерамика).
Экспозиция 7 суток при 40 °С.
2-я серия эксперимента - 4 флакона.
1 - контроль, модельная среда (дистиллированная вода).
2 - модельная среда с образцом № 1 (нанокомпозит).
3 - модельная среда с образцом № 2 (микрогибридный композит).
4 - модельная среда с образцом № 3 (гибридный композит).
Экспозиция 7 суток при 40 °С.
Исследуемые образцы реставрационных материалов промывают в течение часа проточной водопроводной водой, затем дистиллированной и просушивают марлевыми салфетками.
В качестве модельной среды используют прокипяченную в течение 15 минут и остуженную до 40 °С дистиллированную воду. Вес изделия (мг) соотносится к объему модельной среды (мл) в пропорции 100:1.
В стерильные стеклянные флаконы с притертыми пробками объемом 100 мл наливают по 100 мл остуженной до 40 °С модельной среды и помещают по 10 г подготовленных изделий, дополнительно сполоснутых кипящей дистиллированной водой. Модельная среда доходит до пробки. Флаконы закрывают стерильными притертыми пробками и инкубируют в термостате в течение 7 суток при 40 °С. В качестве контроля используют ту же модельную среду, помещенную в аналогичный стеклянный флакон с выдерживанием в тех же условиях.
По завершении инкубации вытяжки и контрольный раствор используют для биологической оценки.
Процедура биологической оценки модельных вытяжек из реставрационных
Научные И©©ЛЕД@ВАНИЯ
стоматологических материалов. Биологическую активность модельных вытяжек исследуют в хроническом эксперименте на развивающейся популяции одноклеточных организмов инфузорий Tetrahy-menapyriformis в соответствии с Инструкцией 20-0102-2002 [7] и Методическими рекомендациями [9].
Подготовка среды культивирования. Модельную среду и вытяжки разливют по 10 мл в 50-мл конические стерильные колбочки с ватно-марлевыми пробками. В колбочки с модельной средой и вытяжками вносят по 1 мл питательной среды следующего состава: пептон 2%, глюкоза 0,5%, хлорид натрия 0,1%, дрожжевой экстракт 0,1%. Каждый образец исследуют в шести повторностях.
Колбочки со средой культивирования выдерживают 30 минут при 80 °С. После охлаждения до комнатной температуры в каждую колбочку вносят культуру инфузорий в стационарной фазе роста из расчета 2000 организмов на 1 мл среды культивирования.
Подготовленные пробы 96 часов выдерживают в инкубаторе при температуре 25±0,1 °С.
Оценка роста популяции. Регистрацию состояния инфузорий и подсчет организмов осуществляют на этапах жизненного цикла популяции: через 24 (лаг-фаза), 48 (логарифмическая фаза), 72 (фаза замедленного роста) 96 (стационарная фаза) часов. Для этого из каждой колбочки стерильно отбирают по 1 мл культуры.
В нативном препарате отмечают состояние организмов: характер морфологических и функциональных изменений, наличие погибших особей.
После фиксации 1 каплей 5% раствора йода подсчитывают число организмов в счетной камере Фукса-Розенталя в 10 больших квадратах. Умножая среднее число организмов в 1 квадрате на 5000, получаем число особей в 1 мл культуры.
Закономерности роста популяции можно определить, используя следующие формулы:
N \ I
2000 2000 II
где 2000 - число организмов, внесенное в 1 мл среды культивирования, N - число организмов, выросших в среде культивирования с исследуемым препаратом через время 1; г - мгновенная скорость роста, п - число поколений, д - время генерации.
Изучение адаптогенных свойств. При хроническом воздействии биологически
активных веществ в нетоксичных концентрациях на Те1гаИутепаруг11огт1з отмечается чередование периодов стимуляции и угнетения роста популяции в зависимости «доза - время - эффект». Фазные изменения физиологических эффектов Те1гаИутепаруг11огт1з под влиянием биологически активных веществ являются отражением адаптационных изменений в процессах метаболизма в их организме. Количественная оценка адаптационных колебаний численности популяции на протяжении жизненного цикла ее развития позволяет вывести коэффициент, характеризующий адаптационный потенциал популяции: коэффициент адап-тогенности (Кад). Кад - интегральный показатель, являющийся числовым выражением ответной реакции организма Те1гаИутепаруг11огт1з на химический или физический раздражитель
Кад^ „ :
,+К п+К
д/ + Л/ + А/ + N
" ^ л Т « т 7; т'1 * -л
где Ио- число организмов в опыте, N -число организмов в контроле.
Показатель Кад 1,00±0,05 свидетельствует о равновесии механизмов адаптации (гомеостаз). Показатель Кад менее 1 - адаптационный потенциал снижен, более 1 - свидетельство стимуляции механизмов адаптации.
Мембранотоксическое действие объектов оценивают по резистентности одноклеточных организмов к воздействию раствора серной кислоты.
Метод основан на действии химических веществ на защитный покров инфузорий.
В 10-мл флакончики помещают по 1 мл взвеси инфузорий в стационарной фазе роста. Добавляют порциями 0,01 N раствор серной кислоты. Через 1 мин под микроскопом оценивают движение инфузорий.
Резистентность выражают количеством мл данного раствора, которое нужно добавить к 1 мл взвеси инфузорий для их обездвиживания.
Изучение мутагенной активности объектов на Tetrahymenapyriformis. Для исследования возможной мутагенности объектов используется специальная среда выживания - аллиловый спирт. Tetra-hymenapyriformis, произраставшая в контрольной питательной среде, погибает за 12 часов от концентрации аллилового спирта в 250 мМ, а мутант выживает.
Изучение аллергенного действия объектов. Принцип определения аллергенного действия на Tetrahymenapyriformis основан на реакции «антиген-антитело»,
где в качестве антител используются антитела сыворотки крови белых крыс, иммунизированных культурой инфузорий, а в качестве антигена - сам одноклеточный организм.
Антисыворотку получают путем двухкратного с интервалом в три дня подкожного введения крысе 1 мл маточной культуры инфузорий, отмытой от питательной среды. Антисыворотку разводят дистиллированной водой в пропорциях 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, 1:320. По 0,1 мл антисыворотки каждого разведения соединяют с 0,1 мл культуры инфузорий, выросших на контрольных и опытных образцах исследуемых объектов. Через 1 час инфузории исследуют под микроскопом и оценивают реакцию по разработанной шкале [8].
Полученные эмпирические данные обрабатывают статистически с определением средней арифметической каждого вариационного ряда, стандартной ошибки и установления степени вероятности нулевой гипотезы по сравнению с контролем путем вычисления критерия Стью-дента-Фишера. Оценка аналитической надежности методов исследования осуществляется путем статистического контроля правильности и воспроизводимости. При р<0,05 различие средних арифметических сравниваемых рядов считается статистически достоверными [9, 10].
Результаты и обсуждение
Для оценки качества исследований в среде культивирования Те1гаИутепа-ругАотэ в течение двух недель под-считывается число инфузорий во всех фазах роста в 24 повторностях. Оценку правильности и воспроизводимости осуществляют методом контрольных карт [11] (таблица)
Анализ контрольной карты показал, что 100% аналитических результатов (24 из 24) находятся внутри контрольных пределов Х±25. По три результата располагаются в пределах двух среднеквадратичных отклонений и по 9 результатов в пределах одного среднеквадратичного отклонения, т.е. результаты распределились с одинаковой частотой на каждой стороне от линии средней.
Проведенная оценка свидетельствует о правильности и воспроизводимости метода.
Биологическое действие дисиликатли-тиевой стеклокерамики на тест-объект Те1гаИутепаруг11огт1з проявилось в слабо выраженном ингибирующем воздействии на скорость роста популяции. Максимальный эффект, составивший 14%, был отмечен через 72 часа инкубации. Вытяж-
ённая ©тематошгая n1
Построение контрольной карты результатов подсчета численности Tetrahymenapyrifolmis в логарифмической фазе роста в контрольной среде
культивирования
Х (число инфузорий:1000) Х-Х (Х-Х)2 Статистические параметры
176 0 0 п=24;
180 4 16 Среднее арифметическое Х=176 000;
166 10 100
194 18 324
196 20 400 Сумма квадратов отклонения
192 16 256 от среднего Е-2 588 000 000;
184 8 64 Среднеквадратическое отклонение
186 10 100 Э-10800;
184 8 64 Стандартная ошибка т-2200;
186 10 100
180 4 16
176 0 0 Коэффициент вариации У-6%;
168 8 64
162 14 196 Х+1Б-186800 (9 результатов);
170 6 36 Х+2Б-197600 (3 результата);
172 4 16
166 10 100 Х-1Б-165200 (9 результатов);
158 18 324 Х-2Б-154400 (3 результата)
164 12 144
186 10 100
170 6 36
168 8 64
174 2 4
168 8 64
Х=176 Z=2588
ка из фтористо-апатитовой стеклокерамики оказала фазовое влияние на рост Те1гаИутепаруг11огт1з, с чередованием фаз стимуляции и угнетения.
Анализ адаптационных колебаний численности популяции Те^аИутепару-г11огт1в, культивировавшейся в среде на основе вытяжек из стоматологической стеклокерамики выявил снижение адаптационного потенциала на 9% для диси-ликатлитиевой и 6% для фтористо-апатитовой стеклокерамики (р<0,05).
Среда культивирования на основе вытяжек из композиционного пломбировочного материала (нанокомпозита, микрогибридного композита, гибридного композита) была загрязнена палочкообразной спороносной бактерией.
Преобладание ингибирующих эффектов в характере биологического действия вытяжек из пломбировочных композитов на Те1гаИутепаругИогт18 привело к снижению адаптационного потенциала популяции, культивируемой в среде на основе этих вытяжек. Вытяжка из гибридного композита вызвала 100 % угнетение генеративной функции Те1гаИутепаруг11огт1з, сопровождавшееся гибелью внесенных в среду культивирования организмов. Адаптационный потенциал популяции, произрастающей в среде на основе нанокомпозита, снизился на 28% (р<0,05). Адаптационный потенциал популяции, произрастающей в среде на основе микрогибридного композита, снизился на 41% (р<0,05). Вытяжки
из всех материалов не проявили аллергенной и мутагенной активности при хроническом воздействии на тест-объект. Неблагоприятное воздействие вытяжек из пломбировочных нанокомпозитов на Tetrahymenapyriformis может быть связано не только с миграцией в вытяжки токсичных компонентов рецептуры и продуктов деструкции композитов, но и с бактериальным загрязнением среды культивирования. Для определения доминирующего фактора необходимы дополнительные исследования.
Таким образом, апробация нового метода показала его чувствительность, воспроизводимость, высокую достоверность для оценки стоматологических материалов.
Метод токсиколого-гигиенической оценки полимерных материалов с использованием в качестве тест-объекта популяции одноклеточных организмов инфузорий Tetrahymenapyriformis может быть рекмен-дован для широкого внедрения.
ЛИТЕРАТУРА
1. Сравнительная токсикологическая оценка современных пломбировочных материалов / В.И.Жданов [и др.] // Вестн. гигиены и эпидемиологии. - 2000. - Т. 4, № 2. - С. 245-247.
2. Максимовский, Ю.М. Исследование способности к образованию зубной бляшки на поверхности пломб из материалов «Prisma» и «Compolyte+» / Ю.М.Максимовский, В.М.Гринин, А.И.Илюшина // Стоматолог. - М., 2005. - С. 28-34.
3. Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий: ГОСТ Р ИСО 10993-2009.
4. Акулович, А.В. Клинико-лабораторное исследование применения современных иммобилизационных систем для шинирования в комплексном лечении заболеваний пародонта: автореф. дис. ... канд. мед. наук. - СПб., 2010. - 18 с.
5. Сысова, О.В. Токсиколого-гигиеническая оценка новых стоматологических материалов: дис. ...канд. мед. наук: 14.00.07 / О.В.Сысова. - Минск, 1997. - 124 с.
6. Инструкция по гигиенической оценке химических веществ, многокомпонентных смесей и полимерных материалов на Tetrahymenapyriformis / МЗ РБ: утв. 11.07.2002, № 20-0102; авт.-сост. А.С.Богдан. -Минск, 2002. - 63 с.
7. Гигиеническая оценка изделий медицинского назначения, медицинской техники и материалов, применяемых для их изготовления: Инструкция 1.1.10-12-41-2006; утв. МЗ РБ 22 ноября 2006 г. -Минск, 2006. - 79 с.
8. Богдан, А.С. Комплексная биологическая оценка объектов природного и искусственного происхождения на Tetrahymenapyriformis / А.С.Богдан // Альтернативные методы исследований (экспресс-методы) для токсиколого-гигиенической оценки материалов и объектов. - М., 1999. - С. 30-42.
9. Рокицкий, П.Ф. Биологическая статистика / П.Ф.Рокицкий. - Минск: Высш. школа, 1964. 328 с.
10. Гланц, С. Медико-биологическая статистика / С.Гланц; пер. с англ. - М.: Практика, 1998. - 459 с.
11. Лабораторные методы исследования в клинике: справочник / В.В.Меньшиков [и др.]. - М.: Медицина, 1987. - 368 с.
Поступила 23.01.2012
