CC BY
46
Д. В. ДОНЦОВ, Ю. М. АМБАЛОВ
СПОСОБ ПРОГНОЗА ИНТЕРФЕРОН-РИБАВИРИНИНДУЦИРОВАННОЙ НЕЙТРОПЕНИИ У БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКИМ ГЕПАТИТОМ С
Кафедра инфекционных болезней Ростовского государственного медицинского университета, Россия, 344022, г. Ростов-на-Дону, пер. Нахичеванский, 29, тел. (863) 232 92 09. E-mail: d_dontcov@mail.ru
Применение комбинированной противовирусной терапии позволяет добиться стойкого вирусологического ответа у больных хроническим гепатитом С, однако у некоторых пациентов на фоне лечения развивается выраженная нейтропения. Резкое снижение числа нейтрофилов крови зачастую требует прекращения проводимой терапии. В работе предложен новый способ прогноза нейтропении in vitro у больных хроническим гепатитом С, получающих комбинированную противовирусную терапию.
Ключевые слова: хронический гепатит С, противовирусная терапия, нейтропения, прогноз.
D. V. DONTSOV, Y. M. AMBALOV
METHOD FOR FORECASTING OF INTERFERON WITH RIBAVIRIN INDUCED GRANULOCYTOPENIA IN PATIENTS WITH CHRONIC HEPATITIS C
Department of infectious deceases of Rostov state medical university,
Russia, 344022, Rostov-on-Don, Nahitchevansky, 29, tel. (863) 232 92 09. E-mail: d_dontcov@mail.ru
The patients with chronic hepatitis C, who received combination antivirus therapy, were able to achieve firmness virusological results. Some patients, however, during the treatment developed granulocytopenia. When neutrophils in blood drops sharply, often required to stop the current treatment. In presence, through in-vitro we offer new method for forecasting granulocytopenia in patients with chronic hepatitis C in combination antivirus therapy.
Key words: chronic hepatitis C, antivirus therapy, granulocytopenia, forecast.
Хронический гепатит С (ХГС), являясь одним из наиболее распространенных инфекционных заболеваний печени, характеризуется выраженной склонностью к затяжному течению и развитию в конечном итоге цирроза печени и гепатоцеллюлярной карциномы [7]. В настоящее время применение комбинированной противовирусной терапии (КПТ) препаратами интерферона альфа-2Ь (ИФНа) и рибавирина позволяет добиться стойкого вирусологического ответа и обеспечить предупреждение неблагоприятных исходов у больных ХГС [3, 13, 14]. Однако у некоторых пациентов на фоне комбинированной антивирусной терапии отмечаются снижение количества нейтрофилов и угнетение их фагоцитарной активности, что может приводить к развитию бактериальных осложнений со стороны различных органов и систем [8, 10]. Выраженная интерферон-рибавирининдуцирован-ная нейтропения требует снижения дозы применяемых препаратов или же их полной отмены [1]. Между тем наиболее важным условием достижения стойкого вирусологического ответа является, как известно, сохранение терапевтической дозы КПТ на максимально высоком уровне [6]. Схемы, применяемые для лечения уже развившегося нейтропенического синдрома у больных ХГС, требуют существенных материальных затрат, что в современных условиях нерационально с позиций фармакоэкономики [5], поэтому разработка доступных методов, направленных на как можно раннее выявление и предупреждение развития нейтропении у данной категории лиц, представляется весьма актуальной.
Цель исследования - изучить у больных хроническим гепатитом С, получающих комбинированную проти-
вовирусную терапию, патогенетическую роль апоптоза нейтрофилов в развитии интерферон-рибавирининду-цированной нейтропении и на основании полученных данных разработать способ ее прогноза.
Методы исследования
Для изучения структурных изменений, происходящих в нейтрофильных гранулоцитах у больных ХГС под действием противовирусных препаратов, определялся показатель повреждения нейтрофилов (ППН) по методике, описанной Л. Б. Юшкевичем с соавт. [12]. Тест заключается в оценке амебиоидной активности нейтрофилов крови, которую рассматривают как начальную стадию их апоптоза. При постановке теста учитываются нарушение зернистости цитоплазмы, мелкая фрагментация и расплывчатость ядер нейтрофилов, а также образование, повреждение или распад псевдоподий. Расчет индекса повреждения нейтрофилов проводится по формуле: (Н1-Нк)/100, где Н1 - количество поврежденных клеток в опыте; Нк - количество поврежденных в контроле; 100 -количество сосчитанных клеток. Как правило, относительное число нейтрофильных лейкоцитов, вступивших в спонтанный апоптоз (Нк), не превышает 10%. При добавлении в порцию крови специфического индуктора апоп-тоза у сенсибилизированных к нему лиц амебиоидная активность нейтрофилов заметно усиливается (Н1), что приводит к резкому увеличению ППН, у несенсибилизи-рованных же лиц уровень ППН остается <0,1.
Постановка теста ППН у больных ХГС осуществлялась нами следующим образом. В микропипетку емкостью 0,08 мл набиралась кровь, взятая из пальца
Кубанский научный медицинский вестник № 3 (126) 2011 УДК 616.36-002-036:616.155.394.5-037
Кубанский научный медицинский вестник № 3 (126) 2011
больного, которую вносили в пробирку, содержащую 0,02 мл 5%-ного водного раствора цитрата натрия. Затем в эту же пробирку добавляли 0,02 мл водного раствора индуктора апоптоза нейтрофилов (ИАН), специально разработанного сотрудниками кафедры инфекционных болезней и кафедры биохимии № 1 РостГМУ. В качестве ИАН использовали препараты, применяемые у больных ХГС в качестве КПТ: 80 мг (1/5 разовой дозы) ребетола и 0,6 млн. МЕ (1/5 суточной дозы) альтевира, разведенные в 1,0 л 0,9%-ного раствора натрия хлорида. Такое соотношение компонентов ИАН подобрано с учетом фармакокинетики (абсолютная биодоступность, максимальная концентрация препарата в плазме, объем распределения) и терапевтических доз рибавирина и ИФНа [11].
Одновременно проводился контрольный тест, заключавшийся в том, что в пробирку с 0,08 мл крови того же испытуемого лица добавлялось 0,04 мл 5%-ного раствора цитрата натрия уже без ИАН. Опытная и контрольная пробирки помещались в термостат на 2 часа при температуре 37° С, затем из каждой порции крови готовились мазки с окраской по Романовскому-Гимза. Под иммерсионным увеличением в каждом мазке сосчитывалось 100 нейтрофилов, учитывался процент поврежденных клеток и рассчитывался ППН.
Стандартность условий данного исследования обеспечивалась использованием точно дозированных порций крови, антикоагулянта, ИАН, постоянством термостатной температуры, неизменностью фактора времени. Объективность учета результатов реакции определялась тем, что в опытном мазке крови оценивалось повреждающее действие ИАН при подсчете 100 однородных форменных элементов - нейтрофилов, а неспецифическая реакция нейтрофилов на условия среды учитывалась путем подсчета 100 элементов в контрольном мазке.
Определение ППН было выполнено у 125 больных ХГС (90 женщин, 35 мужчин), находившихся на лечении в гепатологическом центре МЛПУЗ «Городская больница № 1 им. Н. А. Семашко» г. Ростова-на-Дону в период 2008-2010 гг. Критериями включения пациентов в исследование явились: 1) наличие в крови суммарных апйН^, выявленных как минимум двукратно в условиях нескольких независимых лабораторий; 2) положительный результат детекции РНК Н^ в крови; 3) срок наблюдения не менее 1 года; 4) отсутствие ранее проводимой терапии препаратами рибавирина и ИФНа; 5) отсутствие тяжелых сопутствующих соматических заболеваний, в том числе и других вариантов гепатитов; 6) отсутствие аутоиммунной патологии; 7) отсутствие декомпенсации заболевания с развитием цирроза печени. Исследуемые лица были равнозначны по своим исходным клинико-лабораторным данным и не имели противопоказаний к проведению антивирусной терапии. Генотипирование Н^ осуществляли методом праймерспецифической ПЦР с использованием тест-систем «Амплисенс Н^ генотип» фирмы «Интер-лабсервис» (Россия). Генотип 1р HCV регистрировался в 54,4% случаев, 3а - в 25,6%, 2а - в 16,8%. У 4 больных генотип HCV не был идентифицирован. Количество РНК HCV менее 3*105 МЕ/мл было отмечено у 24,0% наблюдавшихся лиц, от 3*105 МЕ/мл до 6*105 МЕ/мл - у 60,8% и более 6*105 МЕ/мл - у 15,2%. Средний возраст обследованных составил 38,2±7,4 года, длительность заболевания - 11,7±5,6 года.
Статистическая обработка данных была проведена пакетом «Microsoft Excel», о достоверности отличий
учитываемых показателей судили по величине t-критерия Стьюдента. Корреляционный анализ проводили по методу квадратов Пирсона.
Результаты исследования
Постановка теста ППН проводилась у больных ХГС перед началом лечебных мероприятий. Среднее значение данного показателя у исследуемых нами пациентов составило 0,11±0,006. Однако следует отметить, что у 15,2% (n=19) всех испытуемых ППН оказался достоверно выше (р<0,001), чем у оставшихся 84,8% (n=106): 0,28±0,001 и 0,08±0,002 соответственно.
После определения ППН всем наблюдаемым лицам проводилась КПТ по схеме: альтевир внутримышечно 3 млн. МЕ 3 раза в неделю и ребетол перорально 8001200 мг в сутки в течение 24-72 недель в зависимости от генотипа HCV, уровня вирусной нагрузки, а также частоты появления быстрого и раннего вирусологического ответа.
В процессе лечения минимум 1 раз в неделю у больных определялся уровень нейтрофилов в крови с помощью гематологического анализатора «MEK-8222» фирмы «Nihon Kohden» (Япония). Среднее значение абсолютного числа нейтрофилов (АЧН) у больных ХГС перед курсом КПТ составило 3,6±0,09*109/L. Динамическое наблюдение за пациентами в течение всего периода КПТ показало, что статистически значимое снижение АЧН отмечалось на 8-10-й неделях лечения, достигнув в среднем 1,9± 0,05*109/L, р<0,001.
Проведя корреляционный анализ, мы констатировали наличие обратной связи между значением ППН и уровнем АЧН на 8-10 неделях КПТ (r=-0,65; р<0,001). Так, у тех пациентов, у которых ППН составил 0,08±0,002, минимальное количество нейтрофилов оставалось в пределах 2,2±0,04*109/L, что не требовало дополнительной коррекции лечения. Значительно более выраженная нейтропения отмечалась у тех больных ХГС, которые имели в начале исследования среднее значение ППН 0,28±0,01, минимальный уровень нейтрофилов в этой группе составил в среднем 0,64±0,04*109/L, что оказалось достоверно ниже (р<0,01), чем у остальных, причем у 2 из них АЧН к 8-10-й неделе лечения снизилось до 0,45*109/L, что привело к отмене проводимой КПТ.
Следует отметить, что у 2 пациентов, несмотря на ППН, равный 0,24, минимальный уровень нейтрофилов в крови, тем не менее, оставался в пределах допустимой нормы, т. е. выше 0,75*109/L [1]. Однако данным лицам параллельно с антивирусным лечением каждые 3 дня проводилось внутривенное введение 20 мл гемолизата аутокрови (ГАК) по методике, описанной Ю. М. Амбаловым с соавт. [2]. Отсутствие у этих больных выраженной нейтропении, возможно, свидетельствует о стимулирующем влиянии ГАК на клетки миелоидного ряда. Выявленный факт представляется весьма интересным с клинической точки зрения и требует дальнейшего исследования, выполнение которого планируется на кафедре инфекционных болезней РостГМУ.
Наличие обратной корреляционной связи позволило нам разработать способ ориентировочного прогноза развития интерферон-рибавирининдуцированной нейтропении у больных ХГС, основанного на постановке теста ППН (И. И. Васильева, Д. В. Донцов, Ю. М. Амбалов, М. А. Пройдаков Способ прогноза развития нейтропении, вызванной комбинированной противовирусной терапией, у больных хроническим гепатитом С. Заявка на изобретение № 2011102090, приоритет от
20.01.2011). Было установлено, что при выявлении у пациентов величины ППН >0,24 с вероятностью более 84% можно судить о высоком риске развития нейтро-пении у данной категории лиц при проведении им в дальнейшем КПТ. Данный способ технически прост и экономичен, обеспечивает быстрое получение результата и не требует для своего проведения специально оборудованной лаборатории.
Исследования иллюстрируются следующими клиническими примерами.
Больной Т., 42 года, наркологический анамнез не отягощен. В сыворотке крови обнаружен 1Ь-генотип НСУ РНК, вирусная нагрузка 6*105 МЕ/мл. Ранее КПТ не получал, периодически принимал силимаринсодер-жащие гепатопротекторы. Уровень ППН перед проведением антивирусной терапии - 0,26. Через 4 недели от начала проведения КПТ у больного стало отмечаться снижение АЧН. Поскольку через 8 недель проведения КПТ нейтропения достигла 0,7*109/-, доза ИФНа была уменьшена на 50%.
Больная N1., 36 лет, страдающая ХГС в течение 7 лет, имеющая За-генотип НОУ, поступила в гепато-логический центр г. Ростова-на-Дону для проведения противовирусной терапии. Самостоятельно принимала эссенциальные фосфолипиды. При биохимическом исследовании крови неоднократно регистрировалась ги-перферментемия. Противопоказаний к противовирусной терапии не выявлено. ППН перед началом лечения составил 0,09, АЧН - 3,9*109/-. На 9-й неделе проведения КПТ количество нейтрофилов в крови снизилось до 1,9*109/-, к 15-й неделе лечения оно восстановилось до 3,6*109/-. Так как АЧН оставалось в пределах нормы, больная в коррекции проводимой терапии не нуждалась.
Обсуждение
Как известно, успех современного лечения ХГС в значительной степени лимитируется рядом факторов, к которым относятся генотип НСУ, уровень вирусной нагрузки, возраст больного в период лечения, различные внепеченочные поражения, темп прогрессирования фиброза печени, наличие вирусного стеатоза и др. [4]. Неблагоприятное фоновое состояние больных ХГС уменьшает результативность лечения, способствуя формированию нежелательных эффектов проводимой терапии, в том числе развитию интерферон-рибави-рининдуцированной нейтропении. В настоящее время большое внимание уделяется такому феномену, как апоптоз нейтрофилов, который, являясь физиологически детерминированным процессом, закодирован в геноме клетки и вызывает серию морфологических изменений, приводящих к ее гибели [9]. Некоторые физические и химические факторы, обладая в малых количествах цитотоксическим эффектом, способны инициировать апоптоз, однако роль этого явления в формировании нейтропении у больных ХГС, получающих КПТ, практически не изучена. Результаты, полученные нами при исследовании 125 больных хронической ИОУ-инфекцией, позволяют сделать следующие выводы.
Индукция апоптоза нейтрофилов препаратами ри-бавирина и ИФНа имеет важное патогенетическое значение в развитии нейтропении у сенсибилизированных к ним больных ХГС.
Значение ППН >0,24 у больных ХГС свидетельствует о высоком риске развития интерферон-
рибавирининдуцированной нейтропении при проведении им в дальнейшем КПТ.
Больным ХГС, имеющим ППН ^0,24, целесообразно проводить внутривенное введение гемолизата аутокрови на всем протяжении КПТ с целью профилактики интерферон-рибавирининдуцированной ней-тропении.
ЛИТЕРАТУРА
1. Авдеева М. Г., Городин В. Н., Редько Е. Н., Стриханов С. Н., Моренец Т. М. Вирусные гепатиты: стратегия и тактика терапии, организация медицинской помощи: Пособие для врачей. - Краснодар, 2009. - С. 112-113.
2. Амбалов Ю. М., Усаткин А. В., Кузнецов В. П., Коваленко А. П. Эффективность гемолизата аутокрови у больных рожей нижних конечностей // Успехи современного естествознания. - М., 2003. -№ 11. - С. 39.
3. Баранова И. П., Афтаева Л. Н., Краснова Л. И., Рыбалкин С. Б. Противовирусная эффективность различных форм интерферона в терапии хронического гепатита С // Инфекционные болезни. -2010. - Т. 8. № 2. - С. 13-16.
4. Блохина Н. П., Никитин И. Г. Особенности фармакологической динамики и кинетики пегилированного альфа-интерферона «Пегасис»: новые возможности терапии хронического гепатита С // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопро-ктологии. - 2002. - Т. 12. № 6. - С. 17-24.
5. Воробьев П. А., Авксентьева М. В., Юрьев А. С., Сура М. В. Клинико-экономический анализ. Оценка, выбор медицинских технологий и управления качеством медицинской помощи. - М., 2004. - 404 с.
6. Исаков В. А. Современная терапия хронического вирусного гепатита С: Какая длительность комбинированной терапии оптимальна и почему? // Клиническая гастроэнтерология и гепатоло-гия. - 2009. - Т. 2. № 1. - С. 9-12.
7. Мамаев С. Н., Рамазанов Ш. Р., Буеверов А. О., Маевская М. В., Абдуллаева А. М., Арбуханова Р. М., Дибиров Д. А., Амирова Х. М. Динамика уровней цитокинов сыворотки крови при противовирусной терапии // Клинические перспективы гастроэнтерологии, гепатологии. - 2008. - № 2. - С. 28-31.
8. Мангушева Я. Р., Фазылов В. Х. Влияние альфа-интер-феронотерапии на фагоцитарные механизмы защиты при хроническом гепатите С // Инфекционные болезни. - 2009. - Т. 7. № 1. - С. 26-32.
9. Маянский Н. А. Внутренний путь апоптоза нейтрофилов и механизмы антиапоптозного эффекта гранулоцитарного колониестимулирующего фактора // Иммунология. - 2004. - Т. 25. № 6. -С. 329-335.
10. Мельник Г. В., Плятс В. И., Городин В. Н., Еремина Г. А.
Опыт комбинированной интерферонотерапии хронического гепатита С // Инфекционные болезни. - 2007. - T. 5. № 2. - С. 75-78.
11. Справочник ВИДАЛЬ. Лекарственные препараты в России. - М., 2010. - 1728 с.
12. Юшкевич Л. Б., Шевырева Н. А. Современные методы клинико-лабораторных исследований в диагностике профессиональных заболеваний. - М., 1973. - С. 53-56.
13. Cheong H. R., Woo H. Y., Heo J, Yoon K. T., Kim D. U., Kim G. H., Kang D. H., Song G. A., Cho M. Clinical efficacy and safety of the combination therapy of peginterferon alpha and ribavirin in cirrhotic patients with HCV infection // Korean j. hepatol. - 2010. - Vol. 16. № 1. - P. 38-48.
14. Wong J. B. Estimating the cost-effectiveness of ribavirin and pegylated interferon alfa-2b for chronic hepatitis // Hepatology. -2000. - Vol. 32. - P. 425A.
Поступила 14.02.2011
Кубанский научный медицинский вестник № 3 (126) 2011
