CC BY
80
Семёнов А.В.
Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН, г. Оренбург
СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ АНТАГОНИСТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ БАКТЕРИЙ
В статье показан способ повышения антагонистической активности бактерий, основанный на активации антагониста компонентами культуры, по отношению к которой добиваются повышения антагонизма. При использовании в качестве индикаторной культуры S. aureus наиболее выраженной способностью повышать антагонизм обладали фрагменты его клеточной стенки, которые можно использовать для усиления антагонистического действия пробиотиков и представителей индигенной флоры организма.
Введение
Одной из функций нормальной флоры организма является препятствие заселению и развитию аллохтонных микроорганизмов. Для восстановления этой функции используют препараты на основе живых бактерий и продуктов их жизнедеятельности [1]. Но большинство из них действует неспецифично, угнетая развитие и представителей автохтонной флоры [2], что может способствовать развитию инфекции. В связи с этим актуальным является создание препаратов и разработка способов, позволяющих стимулировать антагонистическую активность (АА) бактерий-симбионтов макроорганизма, в том числе входящих в состав пробиотиков. Учитывая, что синтез антибиотиков индуцибелен [7, 8], мы предположили, что способом повышения АА бактерий к конкретному патогену может явиться обработка штамма нормофлоры или пробиотика его клеточными компонентами, обладающими стимулирующими антагонизм свойствами. Выяснение этого предположения и определило цель работы.
Цель исследования: изучить влияние экзометаболитов и фрагментов клеточной стенки Staphylococcus aureus на антагонизм микроорганизмов и разработать способ повышения антагонистической активности бактерий.
Материалы и методы
В работе использовали штаммы-антагонисты Enterococcus faecalis - 9 шт., Lactobacillus casei - 3 шт., выделенные из вагинального биотопа, Escherichia coli M-17 («Колибактерин»), L. plantarum («Лактобактерин»), Bifidobacterium longum («Бифиформ») и Bacillus subtilis из коллекции Института клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН.
В качестве индикаторной культуры использовали S. aureus, выделенный из переднего отдела носа.
Идентификацию бактерий проводили общепринятыми методами по морфологическим, тинкториальным, культуральным и биохимическим свойствам [5], с помощью тест-систем Api ID 32 Staph, rapid ID 32 Strep (Bio Meriex, Франция).
Культивирование лактобактерий проводили на МРС среде («HiMedia», Индия), остальных микроорганизмов - на МПБ (НПО «Питательные среды», Махачкала).
Для определения влияния S. aureus на АА бактерий использовали модифицированный метод [6], в котором тестировали культуральную жидкость исследуемых культур, обработанную компонентами S. aureus. В качестве последних использовали экзометаболиты и фрагменты клеточной стенки S. aureus. Для получения экзометаболитов суточную бульонную культуру индикаторного штамма центрифугировали при 3000 об./мин 15 минут, отбирали надосадочную жидкость и обрабатывали хлороформом (на 3 мл супернатанта - 0,1 мл). Клеточные стенки получали путем последовательной обработки биомассы S. aureus смесью этилового спирта и хлороформа, дистиллированной водой, 2М водным раствором гидроксида натрия, дистиллированной водой, буферным раствором трипсина (рН = 2), дистиллированной водой, этиловым спиртом, ацетоном.
Компоненты S. aureus - в опыте и МПБ -в контроле смешивали в соотношении 1:2 с исследуемой культурой антагониста, взвешенной в физиологическом, 0,9% водном растворе хлорида натрия, (ОД = 0,2, при а = 492 нм, что соответствовало 109 кл/мл, в 96-
луночном планшете, объем пробы - 200 мкл), инкубировали смесь 1 час при 370 С, после чего ее разбавляли в 4 раза жидкой питательной средой пригодной, для роста исследуемой культуры, и вновь инкубировали сутки при 370 С, отделяли супернатант центрифугированием при 3000 об./мин 15 минут, обрабатывали его хлороформом из расчета 0,1 мл на 3 мл культуральной жидкости. Далее определяли антимикробную активность культуральной жидкости исследуемой культуры в опыте и контроле по ее способности подавлять выживаемость индикаторного штамма S. aureus. Для этого готовили на физиологическом растворе взвесь индикаторного штамма из суточной агаровой культуры (ОД = 0,15, при а =492 нм, что соответствовало 107 кл/мл, в 96-луночном планшете, объем пробы - 200 мкл). Затем смешивали 0,5 мл взвеси индикаторного штамма с 1 мл культуральной жидкости антагониста, выросшего в отсутствие и присутствии метаболитов индикаторной культуры. В контроле АА вместо метаболитов исследуемой культуры добавляли жидкую питательную среду, в которой культивировали антагонист (МРС - в случае лактобацилл и B. longum, МПБ - в остальных случаях). Смеси инкубировали 1 час при 370 С, добавляли в каждую по 6 мл МПБ и культивировали при 370 С. Производили высев S. aureus на плотную среду, используя метод серийных разведений, сразу и через 8 часов роста, подсчитывали КОЕ и вели расчет антагонистической активности по формулам: АА = (А - В,/ А) * 100%
контроль v 1 /
АА = (А - В / А) * 100%,
опыт v 2 / 7
где А - степень прироста индикаторного штамма, КОЕ 0 / КОЕ8;
В1 - степень прироста индикаторного штамма, КОЕ0/КОЕ8, при действии метаболитов исследуемой культуры, обработанной МПБ (контроль АА);
В2 - степень прироста индикаторного штамма, КОЕ 0 / КОЕ8, при действии метаболитов исследуемой культуры, обработанной компонентами индикаторного штамма (опыт).
Об изменении АА исследуемой культуры судили по изменению выживаемости S. aureus при действии на него метаболитов исследуемой культуры, обработанной компо-
нентами S. aureus, по сравнению с действием метаболитов исследуемой культуры, обработанной МПБ.
Перекрестное антимикробное действие метаболитов исследуемой культуры, обработанной компонентами индикаторного штамма, изучали E. faecalis №42 по отношению к представителям нормальной флоры L. acidophillus, S. epidermidis, C. minutissimum (штаммы из коллекции ИКВС УрО РАН).
Влияние хлороформа на метаболиты исследуемой культуры, используемого в качестве стерилизующего материала, исключали путем сравнительного изучения антимикробной активности супернатантов исследуемой культуры, обеззараженных хлороформом и фильтрованием («Millipore», 0,22 мкм).
Определение рН проводили с помощью прибора «Мультитест» (г. Новосибирск).
Результаты обрабатывали статистически, согласно рекомендациям [4].
Результаты и обсуждение
При изучении влияния компонентов S. aureus на АА исследуемых культур обнаружена их способность регулировать проявление антагонистической активности бактерий различных таксономических групп. Свойством регулировать антагонистическую активность изученных бактерий обладали метаболиты и клеточная стенка S. aureus (рисунки 1, 2).
Выраженное повышение активности наблюдали у E. faecalis и B. subtilis после добавления клеточной стенки S. aureus в среду их культивирования и у E. coli M-17, после обработки ее экзометаболитами стафилококка. Действие культуральной жидкости S. aureus на АА E. faecalis, напротив, носило ингибирующий характер - 2,42+4,82% против 18,6+5,6% в контроле (р < 0,05).
У лактобактерий и B. longum АА была на высоком уровне и не изменялась под действием компонентов S. aureus. Известно, что антимикробная активность лактобацилл складывается из действия различных веществ: бакте-риоцинов, лизоцима, перекиси водорода и кислот [1, 3], а низкое значение рН культуральной жидкости молочнокислых бактерий, внося существенный вклад в антагонизм этих микроорганизмов [9], может вуалировать дей-
S'
:S
и
a
<&
т
в
а
ю
т
с
о
н
н
0
1
а
ы
в
1GG
SG
60
40
20
0
її—ГІ
E.faecalis
(n=9)
L.casei
(n=3)
L. plantarum B.longum B.subtilis E.coli M-17
виды антагонистов
* - p<0,05 при сравнении значений антагонистической активности в опыте и контроле.
Цвет столбцов: белый - действие антагониста, выращенного с МПБ (контроль АА); черный - действие антагониста, выращенного с экзометаболитами S. aureus; серый - действие антагониста, выращенного с клеточной стенкой S. aureus.
Рисунок 1. Выраженность антагонистической активности бактерий к S. aureus, обработанных его метаболитами и фрагментами клеточной стенки
120
100
S0
60
40
о4 69 <
Л
н и
0 я я
О)
1 20
а 3
69
0
-20
-
цельная
нейтрализованная
вид культуральной жидкости L. casei
: - р<0,05 при сравнении значений антагонистической активности в опыте и контроле.
Рисунок 2. Антимикробное действие цельной и нейтрализованной культуральной жидкисти L. casei к S. aureus
ствие остальных антимикробных веществ. Мы изучили стимулирование АА в условиях, исключающих действие кислоты. Опыты проводили на Ь. еа8е1, культуральные жидкости которых нейтрализовали до pH = 6,2 (в среднем 100 мкл 1М раствора гидроксида натрия на 1 мл супернатанта), после чего определяли АА. Как показали результаты (рис. 2), низкие значения рН не позволили выявить эффект регуляции антагонизма, который имел место. Отмечено повышение АА при обработке Ь.
casei фрагментами клеточной стенки S. aureus и понижение, вплоть до появления стимулирующего рост эффекта - при действии экзометаболитов. В связи с этим при изучении регуляции АА у молочнокислых бактерий, вероятно, следует учитывать «скрывающее» действие кислоты.
При использовании потенциальных препаратов на практике необходимо также учитывать перекрестное повышение АА в отношении представителей индигенной флоры.
Я
в
100
50
0
-50
-100
-150
-200
*
* * * ■
S. aureus L. acidophillus C.minutissimum
виды индикаторных культур
S. epidermidis
5 - р<0,05 при сравнении значений антагонистической активности в опыте и контроле.
Рисунок 3. Перекрестное действие E. faecalis №42 на представителей нормофлоры, активированных компонентами S. aureus
На примере E. faecalis .№42 показано, что при использовании для активации антагониста экзометаболитов S. aureus наблюдали появление антагонизма только по отношению к S. epidermidis, а при обработки энтерококка фрагментами клеточной стенки S. aureus отмечено повышение АА ко всем тест-культурам, за исключением C. minutissimum, но наибольшее ее увеличение фиксировали по отношению к S. aureus (рис. 3).
Анализируя вышеизложенное, отметим, что достигнуто повышение АА бактерий путем обработки их компонентами культуры,
по отношению к которой добиваются повышения активности, т.е. индикаторной культуры. При использовании в качестве индикаторного штамма S. aureus, наиболее выраженной способностью повышать антагонизм обладали фрагменты его клеточной стенки. Действие же экзометаболитов приводило как к повышению АА, так и к ее понижению. Не исключено, что обнаруженные свойства компонентов S. aureus можно использовать для усиления антагонистического действия пробиотиков или представителей индигенной флоры при санации бактерионосительства.
*
*
Список использованной литературы:
1. Бухарин О.В., Валышев А.В., Гильмутдинова Ф.Г. и др. Экология микроорганизмов человека. Екатеринбург: УрО РАН, 2006.
2. Глушанова Н.А. О биосовместимости пробиотиков с индигенной микрофлорой хозяина // Сб. материалов конференции «Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания». М., 2004. С. 23.
3. Кира Е.Ф. Бактериальный вагиноз. СПб.: ООО «Нева-Люкс», 2001.
4. Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: Высш. школа, 1990.
5. Определитель бактерий Берджи. В 2 тт. Т.2. Пер. с англ. М.: Мир, 1997.
6. Патент РФ №2175673 от 07.03.2000 / Бухарин О.В., Забирова Т.М., Чертков К.Л., Черкасов С.В., Иванов Ю.Б.
7. Brurberg M. B., Nes I.F., Eijsink V. G. H. // Mol. Microbiol.1997.V.26. Р. 347-360.
8. Kleerebezem M., Quadri L. E. N., Kuipers O. P., de Vos W. M. // Mol. Microbiol.1997.V.24. Р. 895-904.
9. Melis G. B., Ibba M. T., Steri B. et. al. Role of pH as a regulator of vaginal physiological environment // Minerva Ginecol., 2000. V. 34. P. 111-121.
Статья рекомендована к публикации 04.05.07
