CC BY
82
УДК 615.322:581.192:543.544.943.3
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СТАНДАРТА ПАТУЛЕТИНА ИЗ СОЦВЕТИЙ БАРХАТЦЕВ РАСПРОСТЕРТЫХ (TAGETES PATULA L.)
Червонная Н.М., Оганесян Э.Т., Андреева О.А., Сенченко С.П., Боровский Б.В.
Пятигорский медико-фармацевтический институт - филиал ФГБОУ ВО «Волгоградский государственный медицинский университет», г. Пятигорск, Российская Федерация
Аннотация. В статье предложен упрощенный способ выделения патулетина из соцветий бархатцев распростертых (Tagetes patula L.). В соответствии с требованиями к фармацевтическим субстанциям, приведенным в ГФ XIII издания, проведена стандартизация исследуемого вещества по показателям: растворимость, подлинность, температура плавления, удельный показатель поглощения, посторонние примеси, потеря в массе при высушивании, количественное содержание патулетина в исследуемой субстанции. Установлены максимумы поглощения полученного вещества и определен удельный показатель поглощения. Методом ВЭЖХ доказана чистота полученного вещества. Физико-химическими методами (ЯМР^Н- и масс-спектроскопии) установлена структура и определена молярная масса.
Ключевые слова: бархатцы распростертые (Tagetes patula L.), патулетин, ВЭЖХ, ЯМР-1Н, масс-спектроскопия.
Введение. Патулетин (3,5,7,3',4'-пентаокси-6-метоксифлавонол) относится к монометокси-лированным флавонолам и является сугубо специфичным флавоноидом для растений рода Tagetes, и в растениях других семейств встречается крайне редко. Известны способы выделения патулетина из растений, относящихся к роду Aster-aceae: из цветков девясила британского (Inula Britannica) [1], из семян и цветков бархатцев, распростертых (Tagetes patula) [2] и травы Tagetes mendocina [3] - с использованием препаративных хроматографических методов. Самыми существенными недостатками известных методов являются длительность элюирования и низкий выход целевого продукта.
Бархатцы, распростертые являются перспективным источником флавоноидов. Химический состав соцветий представлен в основном флаво-ноидами, из которых доминирующими являются патулетин и патулитрин, а также рутин, кверцетин, лютеолин-7-гликозид и др. [4].
Ранее проведенные фармакологические исследования показали:
• гепатопротекторную, желчегонную активность и гипохолистеринемическое действие для извлечения, полученного экстракцией спиртом этиловым 70% [5];
• ранозаживляющую активность при экспериментальном сахарном диабете для извлечения из соцветий бархатцев распростертых, полученного экстракцией спиртом этиловым 40% [6];
• гипотензивное и диуретическое [7], им-муномодулирующее, противоартритное и анти-оксидантное действие для патулетина в опытах in vivo и in vitro [8].
Целью настоящего исследования является разработка упрощенного способа выделения па-тулетина из соцветий бархатцев распростертых.
Материалы и методы. В качестве объекта исследования нами использованы соцветия бархатцев распростертых сорта «Carmen», собранные в сентябре 2015 года в ботаническом саду на
—--—
базе Пятигорского медико-фармацевтического института-филиала ФГБОУ ВО ВолгГМУ Минздрава России.
Для реализации поставленной цели, измельченные соцветия бархатцев (100 г) экстрагировали в аппарате Сокслета гексаном до обесцвечивания растворителя, после чего дальнейшую экстракцию аналогичным образом проводили хлороформом. Из полученного хлороформного извлечения частично удаляли растворитель до 1/3 от первоначального объема. При охлаждении до комнатной температуры из маточного раствора выпадал желто-зеленый осадок, который отделяли и на фильтре промывали небольшим количеством диэтилового эфира. Полученное вещество дополнительно очищали путем двукратной перекристаллизации из водного ацетона. Получали порошок светло-желто-зеленого цвета.
Методом ТСХ и двумерной БХ в подвижных фазах бутанол - уксусная кислота - вода (4:1:5) и 15% уксусная кислота доказано, что полученное вещество является индивидуальным.
Выход вещества в пересчете на воздушно-сухое сырье составил 2,8%.
С помощью физико-химических методов анализа была доказана структура полученного соединения: ЯМР-:Н, масс спектроскопии.
Масс-спектры регистрировали на квадру-польном масс-спектрометре FГNNЮAN МАТ INCOS 50 методом электронного удара; исследуемое вещество вводилось методом прямого ввода, энергия ионизации составляла 70 эВ.
Согласно требованиям ГФ XIII издания [9], проводили стандартизацию
исследуемого вещества по следующим показателям:
1. Растворимость определяли в соответствии с требованиями ГФ XIII издания [9].
2. Подлинность. Определяли по общим качественным реакциям, характерным для флаво-ноидов и в частности для флавонолов [9,10].
3. Температура плавления является важной характеристикой фармацевтической субстанции. Температуру плавления патулетина определяли
капиллярным методом [9]. В результате проведения 6 испытаний (n=6) определяли среднее значение.
4. Удельный показатель поглощения. Для
1%
определения А!см готовили серию растворов па-тулетина различной концентрации Точную навеску высушенного до постоянной массы вещества (0,025 г) растворяли в мерной колбе вместимостью 100 мл в небольшом количестве спирта этилового 95% и доводили объем до метки тем же растворителем. Разные аликвоты полученного раствора помещали в мерную колбу вместимостью 50 мл и доводили объем растворов до метки спиртом этиловым 95%. Растворы использовали свежеприготовленными. Измерения проводили на спектрофотометре «СФ-2000». Расчет значения удельного показателя поглощения рассчитывали по формуле:
a1%=A*W1* W2 !см a*Va*100,
где: A - оптическая плотность измеряемого раствора; Wi, W2 - объемы мерных колб, использованных для разведения навесок исследуемого вещества соответственно, мл; Va - аликвота измеряемого раствора, мл; а - навеска исследуемого вещества, г.
5. Посторонние примеси. Содержание посторонних примесей определяли методом ТСХ и БХ в подвижных фазах: бутанол - уксусная кислота - вода (4:1:5), 15% уксусная кислота и система Форесталя (30:3:10) [10].
6. Потеря в массе при высушивании. Данный показатель определяли в соответствии с требованиями ГФ XIII [9].
7. Количественное содержание патулетина в исследуемой субстанции определяли методом ВЭЖХ: измерения проводились на жидкостном хроматографе Ultimate 3000 (Dionex). Колонка Phenomenex Luna C-18 150^4,60 мм, диаметр частиц 5 микрон. Температура колонки 30 0С. Детектирование проводилось с помощью УФ-де-тектора при длине волны 254 нм. Градиентный режим: от 5% ацетонитрила до 60% за 40 минут. В качестве второго компонента подвижной фазы
—--—-
использовался 2% раствор кислоты муравьиной. Скорость потока составил 1 мл/мин.
Результаты и их обсуждение. В результате проведенных испытаний по каждому показателю установлено, что:
• полученное вещество представляет собой рассыпчатый, аморфный порошок светло-желто-зеленого цвета, без запаха;
• легко растворим в спирте этиловом 95%, ацетоне, хлороформе; медленнно растворим в водном спирте (50-60%); нерастворим в гексане, воде;
• в результате проведения цианидиновой реакции (проба Шинода) наблюдали появление ярко-красного окрашивания раствора; с реактивом Вильсона - ярко-желтую окраску раствора; с 2 % спиртовым раствором хлорида алюминия -желтое окрашивание;
• Тпл=267-268°С;
• значение удельного показателя поглощения составило 701,7±10,21 нм;
• УФ-спектр 0,000375% патулетина в 95% спирте этиловом (рисунок 1) в области длин волн от 200 до 500 нм содержит максимумы поглощения при 371 нм (I полоса) и 258 нм (II полоса);
• на хроматограммах после проявления хромогенными реагентами присутствует одно пятно желтого цвета;
• потеря в массе при высушивании 3,8%;
• на ВЭЖХ-хроматограмме присутствует единственный доминирующий пик (98,03%), суммарное содержание других пиков не превышает 2% (рисунок 2).
В результате проведения физико-химических испытаний установлено, что исследуемое вещество, полученное по вышеописанной методике, соответствует структуре патулетина. Результаты ЯМР-:Н-, масс-спектроскопии представлены на рисунках 3,4, спектральные характеристики - в таблицах 1,2.
Рисунок 1. УФ-спектр 0,000375% раствора исследуемого вещества в этаноле
2 I
А__
Нйт-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-г-
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 мин
Рисунок 2. ВЭЖХ-хроматограмма 0,0196% раствора исследуемого вещества в этаноле
Из представленной ВЭЖХ-хроматограммы видно, что полученный нами образец патулетина является хроматографически чистым, значение
времени удерживания в данных условиях составляет 22,85 мин (рисунок 2).
Таблица 1
—--—
ЯМР-1Н-спектральные характеристики исследуемого вещества
Положение протонов в структуре молекулы Исследуемое вещество
DMSO-de 400MHz
Н-6' 7.50 (d, J=8.4 Hz, 1H)
Н-8 6.48 (s, 1H)
Н-2' 7.64 (d, 1H)
Н-5' 6,85 (d, 1H)
OH-3 9,58 (s, 1H)
OH-5 12,54 (s, 1H)
OH-7 10,68 (s, 1H)
OH-3' 9,32 (d, 2H)
OH-4' 9,34 (d, 2H)
Таблица 2
Массовые числа (т/е) характеристических ионов в масс-спектре исследуемого вещества_
Ионы Значения m/e Относительная интенсивность в %
M+ 332 100
(M-H)+ 331 4,6
(M-CHs)+ 317 13,5
(M-H2O)+ 414 43
(M-HCO)+ 303 7,2
(M-CH3CO)+ 289 90
(a-CH3-CO) 139 4,5
(л) 137 17
(л-СО) 109 7,5
gagj.61016
I gag 16 1016
1
12.5 13.0 11.5 ! I t: 1 П..-, 10.0 'I,- 0.0 85 8 0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 50 4.5 1.0 35 3.0 3.5
Рисунок 3. ЯМР-1Н -спектр исследуемого вещества
—--—
Рисунок 4. Масс-спектр исследуемого вещества
Выводы:
1. Предложенный способ получения патулетина позволит решить проблему отсутствия доступных образцов сравнения данного флаво-ноида и позволит рационально использовать растительное сырье.
2. Определены следующие показатели: температура плавления (Тпл 267-268°С), удельный показатель поглощения 701,7±10,2 нм, УФ-спектр содержит максимумы поглощения при 258 и 371 нм, методом ВЭЖХ доказана чистота патулетина, физико-химическими и химическими методами доказана структура патулетина, а также определена молярная масса. Количественное содержание патулетина в исследуемой субстанции составляет 98,03%.
3. Представленные результаты по стандартизации патулетина соответствуют требованиям к фармацевтическим субстанциям, приведенным в ГФ XIII издания.
ЛИТЕРАТУРА
1. Park E.J., Kim Y. Kim J. Acylated flavonol glycosides from the flower of Inula Britannica // Journal of Natural Products. 2000. Vol. 63. P. 34-36.
2. Калошина Н.А., Мазулин А.В. О флавоноидах семян растений рода Tagetes // Химия природных соединений. 1983. N 1. С. 104-105.
3. Schmeda-Hirschmann G., Tapiaa A., Theoduloz C., Rodriguez J., Lopez S., Feresin G.,E. Free radical scavengers and antioxidants from Tagetes mendocina // Zeitschrift fur Naturforschung. 2004. Vol. 59. P. 345-353.
4. Подгорная Ж.В. Исследование цветков бархатцев распростертых (Tagetes patula L.) с целью получения биологически активных веществ: дис. ... канд. фарм. наук. - Пятигорск, 2009. - 145 с.
5. Терехов А.Ю. Изучение защитного действия биологически активных веществ из цветков бархатцев распростертых (Tagetes patula L.) при экспериментальных токсических поражениях печени: дис. .канд. фарм. наук.- Пятигорск, 200б.-1б7 с.
6. Ломкина Е.М., Червонная Н.М., Оганесян Э.Т. и др. Влияние экстракта бархатцев на заживление ран при сахарном диабете Фармация. 201б. Т. б5, N 3. С. 37-40.
7. Василенко Ю.К. Гепатозащитные свойства препаратов из бархатцев распростертых // Xnw.-фарм. журн. 1990. Т.24, N 1. С.53-5б.
8. Патент US20150025131 A1Patuletin a potent anti-TNF-a and anti-arthritic compound from Tagetes pat-ula / Muhammed Ahmed Mesaik, Almas Jabeen et al. -USA № US 13/944,387; заявл. 17.07.2013; опубл. 22.01.2015.
9. Государственная фармакопея Российской Федерации 13-е изд. [Электронный ресурс] URL: http://femb.ru/feml.
10. Пеливанова С.Л. Полифенольный состав листьев крыжовника отклоненного и шелковицы черной // Научные ведомости БелГУ. Серия: Медицина. Фармация. Науч. журн. - 2012. - N 22 (141), вып. 20/1 - С. 170-173.
—--—
Журнал включен в Перечень рецензируемых научных изданий ВАК
—--—
A METHOD OF PRODUCING A STANDARD PATULETIN FROM OPEN INFLORESCENCES MARIGOLD (TAGETES PATULA L.)
Chervonnaja N.M., Oganesjan Je.T., Andreeva O.A., Senchenko S.P., BorovskijB. V.
Pyatigorsk medical-pharmaceutical Institute - branch of «Volgograd state medical University», Pyatigorsk, Russian Federation
Annotation. The paper proposed a simplified method for allocating patuletin from open inflorescences marigold (Tagetes patula). In accordance with the requirements of the pharmaceutical substances listed in the global Fund XIII edition, the standardization of the test substance was made in terms of: solubility, authenticity, melting point, specific absorption index, impurities, loss in weight by drying, quantitative determination. Absorption maxima of the received material were installed and the rate of absorption was determined. The purity of the resulting substance was proved by HPLC. Physical - chemical methods (NMR-1H and mass spectroscopy) have determined the structure and the molar mass of the received substance.
Key words: Tagetes patula L., patuletin, HPLC, NMR-1H and mass spectroscopy.
REFERENCE
1. Park E.J., Kim Y., Kim J. Acylated flavonol glycosides from the flower of Inula Britannica // Journal of Natural Products. 2000. Vol. 63. P. 34-36.
2. Kaloshina N.A., Mazulin A.V. O flavonoidah semjan rastenij roda Tagetes // Himija prirodnyh soedi-nenij. 1983. N 1. S. 104-105.
3. Schmeda-Hirschmann G., Tapiaa A., Theoduloz C., Rodriguez J., Lopez S., Feresin G.,E. Free radical scavengers and antioxidants from Tagetes mendocina // Zeitschrift fur Naturforschung. 2004. Vol. 59. P. 345-353.
4. Podgornaja Zh.V. Issledovanie cvetkov barhatcev rasprostertyh (Tagetes patula L.) s cel'ju poluchenija bio-logicheski aktivnyh veshhestv: dis. ... kand. farm. nauk. - Pjatigorsk, 2009. - 145 s.
5. Terehov A.Ju. Izuchenie zashhitnogo dejstvija bi-ologicheski aktivnyh veshhestv iz cvetkov barhatcev rasprostertyh (Tagetes patula L.) pri jeksperimental'nyh toksicheskih porazhenijah pecheni: dis. ... kand. farm. nauk. - Pjatigorsk, 2006. - 167 s.
6. Lomkina E.M., Chervonnaja N.M., Oganesjan Je.T. i dr. Vlijanie jekstrakta barhatcev na zazhivlenie ran pri saharnom diabete Farmacija. 2016. T. 65, N 3. S. 3740.
7. Vasilenko Ju.K. Gepatozashhitnye svojstva pre-paratov iz barhatcev rasprostertyh // Him.-farm. zhurn. 1990. T.24, №1. S.53-56.
8. Patent US20150025131 A1 Patuletin a potent anti-TNF-a and anti-arthritic compound from Tagetes patula / Muhammed Ahmed Mesaik, Almas Jabeen et al. - USA № US 13/944,387; zajavl. 17.07.2013; opubl. 22.01.2015.
9. Gosudarstvennaja farmakopeja Rossijskoj Feder-acii 13-e izd. [Jelektronnyj resurs] URL: http://femb .ru/feml.
10. Pelivanova S.L. Polifenol'nyj sostav list'ev kryzhovnika otklonennogo i shelkovicy chernoj // Nauch-nye vedomosti BelGU. Serija Medicina. Farmacija. Nauch. zhurn. - 2012. - №22 (141), vyp. 20/1 - S. 170173.
