CC BY
298
МИКРОБИОЛОГИЯ
Таблица 3
Частота выявления ВПГ на разных стадиях герпесвирусной инфекции
Метод Частота выявления на стадии инфекции
обострение эпителизация ремиссия
Быстрый культуральный 20/24 (83) 15/23 (65) 7/19 (37)
Иммуноцитохимический 20/24 (83) 13/23 (56,5) 4/19 (21)
Полимеразная цепная 11/24 (46) 13/23 (56,5) 6/19 (32)
реакция Иммуноферментный 3/24(12,5) 4/23 (17) 4/19 (21)
в обеих группах. Можно предположить, что ПЦР, проведенная в сертифицированной лаборатории и использованная для определения ВПГ, нуждается в доработке и повышении чувствительности.
Выявление ЦМВ в биопсийных материалах для выяснения роли ЦМВ-инфекции в детской смертности. Исследовано 88 аутопсийных образцов от 30 плодов, новорожденных и детей, умерших на первом году жизни, у которых при патологоанатомическом исследовании возникло подозрение на врожденную вирусную инфекцию.
Образцы анализировали двумя методами: обычно используемым иммуноцитохимическим - для обнаружения антигена ЦМВ в отпечатках органов и БКМ - для выявления инфекционной активности ЦМВ в аутопсийном материале. Полученные данные (табл. 2) показали, что БКМ позволяет определять вирусную активность в различных органах и обнаруживать в среднем в 2 раза больше инфицированных образцов, чем цитохимический метод исследования отпечатков органов. Это свидетельствует об эффективности использования БКМ для посмертного подтверждения диагноза ЦМВ-инфекции.
БКМ в диагностике генитального герпеса. Эффективность выявления ВПГ изучалась на разных стадиях ГВИ. Обследовано 25 больных рецидивирующим генитальным герпесом в процессе развития рецидива заболевания, каждый пациент был
обследован трижды: на стадиях обострения, эпителизации и ремиссии. Проведено сравнение четырех методов выявления ВПГ в соскобах уретры: иммуноцитохимического метода выявления антигена ВПГ в мазках; БКМ; иммуноферментного метода определения антигена ВПГ и ПЦР. Полученные результаты (табл. 3) показали, что с помощью БКМ обнаруживали ВПГ в инфицированных образцах на всех стадиях заболевания, причем на стадии обострения даже в большем количестве, чем с помощью ПЦР. Как было выяснено в специально проведенных опытах, более низкое выявление ВПГ рутинным методом ПЦР объясняется присутствием в образцах ингибиторов ПЦР и недостаточно полным выделением ДНК ВПГ из урогенитальных образцов. Изменение протокола выделения ДНК и удаление ингибиторов реакции позволили повысить выявляемость ДНК ВПГ в стадии обострения до 80%.
Использование БКМ способствовало повышению эффективности определения ВПГ в урогенитальных материалах методом ПЦР, причем получены столь же высокие результаты, как и с помощью усовершенствованной ПЦР.
Таким образом, внедрение БКМ в практику здравоохранения необходимо для увеличения надежности диагностики герпес-вирусных инфекций как социально значимых заболеваний, передающихся половым путем. Это позволит улучшить здоровье населения, повысить качество жизни инфицированных лиц и увеличить рождаемость здоровых детей.
ЛИТЕРАТУРА
1. Быстрый культуральный метод диагностики герпесвирусных инфекций: Метод. рекомендации. - М., 2008.
2. Герпесвирусная инфекция. Эпидемиология, клиника, диагностика, профилактика и лечение: Метод. рекомендации. - М., 2007.
3. Кострова О. М., Львов Н. Д., Алешкин В. А., Баринский И. Ф. // Вопр. вирусол. - 1991. - № 3.
4. Полимеразная цепная реакция в диагностике урогенитальных инфекций. (Пособие для врачей). - М., 2000.
Поступила 13.02.12
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012 УДК 615.28.076.7
В. В. Шкарин, А. С. Благонравова, О. В. Ковалишена
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ
к дезинфицирующим средствам
ГОУ ВПО Нижегородская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию, Нижний Новгород
Представлена методика оценки чувствительности микроорганизмов - возбудителей инфекций, выделенных от больных-носителей, из внешней среды, к дезинфицирующим средствам. Предлагаемый способ позволяет выявлять состояние устойчивости микроорганизма к дезинфицирующему средству и оценивать его чувствительность. Проведена оценка чувствительности, специфичности, точности, положительного и отрицательного прогностического значения, воспроизводимости разработанной методики.
Ключевые слова: чувствительность микроорганизмов, устойчивость микроорганизмов, дезинфицирующее средство, эпидемиологический надзор за инфекциями
V.V. Shkarin, A.S. Blagonravova, O.V. Kovalishena THE MODE OF DETECTION OF MICROORGANISMS’ SENSITIVITY TO DISINFECTANTS
The article presents the technique to evaluate the sensitivity of microorganisms-causative agents of infections isolated from patients, carriers and environment to the disinfectants. The proposed technique gives a possibility to detect the condition of microorganism resistance to disinfectant and to evaluate the degree of its sensitivity. The evaluation of sensitivity, specificity, accuracy, positive and negative prognostic value, reproducibility of developed technique was made.
Key words: microorganisms ’ sensitivity, microorganisms ’ resistance, disinfectant, epidemiologic infection control
55
КЛИНИЧЕСКАЯ ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА, № 6, 2012
Устойчивость микроорганизмов к применяемым дезинфицирующим средствам (ДС) является одной из актуальных проблем здравоохранения. Значимость проблемы устойчивости показана в ряде работ отечественных и зарубежных исследователей [2, 3, 7-10].
Изучение чувствительности микроорганизмов к ДС является одним из важнейших направлений эпидемиологического надзора за инфекциями в медицинских учреждениях, однако до настоящего времени унифицированные методы ее оценки отсутствуют [1].
Предлагаемая методика имеет целью оценку состояния чувствительности микроорганизмов к различным ДС [5, 6].
Микроорганизмы, используемые при определении чувствительности к ДС. 1. Клинические штаммы микроорганизмов, выделенные из клинического материала от пациентов и персонала, из смывов с объектов внешней среды.
2. Тест-штаммы микроорганизмов. Питательные среды для культивирования микроорганизмов. При проведении исследований по оценке чувствительности микроорганизмов к ДС высев производится на плотные питательные среды общего назначения. Рекомендуется использовать агар Мюллера-Хинтона, если видовые особенности микроорганизма не требуют специальных питательных сред.
Тест-объекты. В качестве тест-объектов используются любые виды поверхностей, в частности металл, клеенка, пластик, керамическая плитка, деревянные поверхности, окрашенные краской, резиновые объекты и др.
Поверхность тест-объекта расчерчивается на квадраты площадью 10 х 10 см2, количество которых зависит от числа испытываемых штаммов. Тест-поверхности должны быть чистыми, неповрежденными, стерильными.
Основные требования, предъявляемые при определении чувствительности микроорганизмов к ДС:
• исследования проводятся в условиях микробиологической лаборатории, имеющей разрешение на работы с патогенными биологическими агентами III-IV группы патогенности;
• температура растворов испытываемых ДС от 18 до 20оС (если по условиям исследования не рекомендована другая температура);
• следует использовать рабочие растворы после полного растворения ДС;
Для корреспонденции:
Шкарин Вячеслав Васильевич, д-р мед. наук, чл.-корр. РАМН, зав.
каф. микробиологии, президент НижГМА
Адрес: 603005, Н. Новгород, пл. Минина, 10/1
Телефон: (831) 439-01-63
E-mail:nnsma@sandy.rn
• приготовление рабочих растворов ДС необходимо производить непосредственно перед проведением исследований;
• использование химических нейтрализаторов дезинфицирующих средств является обязательным;
• кратность постановки экспериментов должна быть не менее трех (при условии получения однотипных результатов); при получении неоднородных результатов - до получения однозначного ответа (3 однотипных результата и более); при необходимости статистической обработки результатов - не менее 8;
• тестируемые ДС до, во время и после испытаний должны храниться в соответствии с требованиями технических условий.
Определение чувствительности микроорганизмов к ДС в растворе (вариант 1)
I. Приготовление бактериальной взвеси
1. Культуры микроорганизмов, выращенные на плотной питательной среде в течение 18-24 ч, смыть стерильным изотоническим раствором натрия хлорида.
2. Микробные взвеси каждого вида довести до 5 единиц (5 • 108 КОЕ/мл) по стандарту мутности для оптической стандартизации бактерий (ГИСК им. Л. А. Тарасевича).
II. Проведение исследования
1. Растворы ДС в рабочей концентрации (0,9 мл) разлить в стерильные пробирки с резиновыми пробками.
2. В пробирки с растворами ДС внести по 0,1 мл микробной взвеси и перемешать пипеткой в течение нескольких секунд.
3. Экспозиция в течение времени, указанного в методических рекомендациях по применению ДС для данной концентрации при требуемом режиме обработки.
4. Внести по 0,5 мл раствора нейтрализатора и перемешать встряхиванием или пипетированием.
5. Посеять на плотную питательную среду по 0,1 мл смеси и поместить чашки с посевами в термостат.
6. Параллельно с проведением опыта поставить контроли:
1) контроль жизнеспособности микроорганизма;
2) контроль стерильности раствора дезинфектанта;
3) контроль полноты нейтрализации ДС;
4) при наличии устойчивости - контроль чувствительности тест-штаммов микроорганизмов к тестируемым ДС в бактерицидном режиме.
III. Учет результатов
По истечении времени, необходимого для культивирования микроорганизмов данного вида, провести учет результатов по количеству выросших на чашке Петри колоний. При отсутствии роста увеличивают сроки культивирования микроорганизмов в 2 раза. Выросшие колонии подвергают микроскопическому исследованию.
интерпретация результатов изучения чувствительности микроорганизмов к дс
Таблица 1
Назначение
Характеристика чувствительности микроорганизмов к ДС обеззараживание поверхностей в помещениях, санитарно-технического оборудования, выделений обеззараживание ИМН, посуды, белья, одежды, обуви, игрушек, предметов ухода за больными
оценка роста микроорганизмов
Устойчивые Рост 300 КОЕ/мл и более Наличие роста (1 КОЕ/мл и более)
Чувствительные От "роста нет" до 299 КОЕ/мл Степени чувствительности * Отсутствие роста ("роста нет")
Полностью чувствительные (полное бактерицидное действие ДС) Роста нет -
Не полностью чувствительные (неполное бактерицидное действие ДС) Рост 1-99 КОЕ/мл -
Не полностью чувствительные (суббактерицидное действие ДС) Рост 100-299 КОЕ/мл -
Нормативные показатели эффективности дезинфекции, % 99,99 100
*Степени чувствительности оцениваются при использовании ДС для обеззараживания поверхностей в помещениях, санитарно-технического оборудования, выделений.
56
МИКРОБИОЛОГИЯ
Таблица 2
Результаты оценки разработанной методики согласно общепринятым стандартам
Показатель Вариант 1 - в растворе Вариант 2 - на поверхности
Чувствительность, % 98,7 ± 1,2 97,6 ± 2,2
Специфичность, % 99,2 ± 0,8 98,3 ± 1,6
Точность теста, % 99 ± 0,9 98 ± 2
Положительное 98,7 ± 1,2 97,6 ± 2,2
прогностическое значение, %
Отрицательное 99,2 ± 0,8 98,3 ± 1,6
прогностическое значение, %
Воспроизводимость, % 95,4 ± 2,4 93,9 ± 3,6
Определение чувствительности микроорганизмов к дезинфицирующим средствам при дезинфекции различных поверхностей (вариант 2)
I. Приготовление бактериальной взвеси проводится так же, как при определении чувствительности микроорганизмов к ДС в растворе (вариант 1).
II. Проведение исследования
1. На стерильную поверхность тест-объекта площадью 10 х 10 см* 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 дозатором нанести микробную взвесь в количестве 0,1 мл и распределить стерильным шпателем по всей площади квадрата.
2. После подсыхания микробной взвеси на поверхность мерно нанести 0,9 мл раствора ДС в рабочей концентрации и распределить по поверхности квадрата стерильным шпателем. ДС следует применять в концентрациях, указанных в методических рекомендациях по использованию средства (или необходимых для исследования).
3. Выдержать в течение времени, указанного в методических рекомендациях по применению ДС для данной концентрации при требуемом режиме обработки (на отдельном столе в лабораторном боксе или в ламинарном боксе класса биологической защиты II A).
4. После воздействия ДС в течение требуемого времени, на тест-объекты дозатором нанести по 0,5 мл раствора нейтрализатора и равномерно растереть по поверхности. Экспозиция нейтрализатора 1-3 с.
5. Смыв произвести сухим стерильным тампоном с поверхности тест-объекта.
6. Высев на чашки с плотной питательной средой произвести немедленно этим же тампоном (по 0,1 мл). Чашки с посевами поместить в термостат.
7. Параллельно с проведением опыта поставить контроли:
1, 2 и 3 - как при определении чувствительности микроорганизмов к ДС в растворе (вариант 1);
4) контроль контаминации тест-объекта;
5) контроль стерильности тест-объекта;
6) при наличии устойчивости - контроль чувствительности тест-штаммов микроорганизмов к тестируемым ДС в бактериальном режиме.
III. Учет результатов проводится так же, как при определении чувствительности микроорганизмов к ДС в растворе (вариант 1).
Интерпретация результатов
Оценка результатов изучения чувствительности микроорганизмов к ДС проводится в зависимости от назначения дезинфектанта (табл. 1).
1. При использовании ДС для обеззараживания поверхностей в помещениях, санитарно-технического оборудования, выделений.
Штамм считать чувствительным при отсутствии роста или при росте не более 300 КОЕ/мл, что соответствует требуемой эффективности ДС (гибель 99,99% микроорганизмов).
При росте менее 300 КОЕ/мл оценивать степень чувствительности.
Штамм считать устойчивым к данному ДС в изучаемом режиме при росте 300 КОЕ/мл и более.
2. При использовании ДС для обеззараживания ИМН, посуды, белья, одежды, обуви, игрушек, предметов ухода за больными.
Штамм считать чувствительным при отсутствии роста микроорганизмов, что соответствует требуемой эффективности ДС (гибель 100% микроорганизмов).
Штамм считать устойчивым к данному дезинфектанту в изучаемом режиме при наличии роста микроорганизмов (1 КОЕ/ мл и более).
Оценка методики. Проведена оценка разработанной методики (вариантов - в растворе и на поверхности) по следующим стандартам: чувствительности, специфичности, точности теста, положительному прогностическому значению, отрицательному прогностическому значению, воспроизводимости.
В качестве методики сравнения (золотого стандарта) использовали Методы определения эффективности дезинфицирующих средств ... [4]. Проведен анализ результатов исследований чувствительности 200 культур микроорганизмов при действии ДС в растворе и на поверхностях.
Для оценки воспроизводимости результатов методики были проанализированы результаты исследований чувствительности 323 культур микроорганизмов к ДС в растворе и 187 культур микроорганизмов к ДС на различных тест-поверхностях.
Таким образом, при проведении исследований, согласно предлагаемой методике, гарантированы достоверные результаты с высокой чувствительностью при опытах в растворе и на поверхности (98,7 ± 1,2 и 97,6 ± 2,2% соответственно), высокой специфичностью (99,2 ± 0,8 и 98,3 ± 1,6% соответственно; табл. 2). Методика характеризуется высокими значениями прогно-стичности (положительное прогностическое значение 98,7 ± 1,2 и 97,6 ± 2,2% соответственно, отрицательное прогностическое значение 99,2 ± 0,8 и 98,3 ± 1,6% соответственно), которые свидетельствуют о высокой вероятности наличия или отсутствия устойчивости у исследуемых культур при положительном или отрицательном результате постановки методики. Методика характеризуется высокими значениями воспроизводимости результатов исследований: воспроизводимость результатов при исследованиях в растворе составляет 95,4 ± 2,4%, при исследованиях на различных тест-поверхностях - 93,9 ± 3,6%.
ЛИТЕРАТУРА
1. Афиногенов Г. Е, Краснова М. В., Афиногенова А. Г. // Дезинфекционное дело. - 2008. - № 4. - С. 40-44.
2. Гудкова Е. И. Распространение и свойства устойчивых к дезинфектантам форм клинических штаммов бактерий: Автореф. дис. ... канд. мед. наук. - Минск, 1990.
3. Ковалишена О. В. // Дезинфекционное дело. - 2005. - № 5. - С. 11-15.
4. Методы испытаний дезинфекционных средств для оценки их безопасности и эффективности. Разраб. НИИ дезинфектологии Минздрава России, утв. Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации. - М., 1998.
5. Пат. на изобретение № 2378363 Российская Федерация. Способ определения чувствительности микроорганизмов к дезинфицирующему средству (варианты): Шкарин В. В., Ковалишена О. В., Благонравова А. С. и др. Заявитель и патентообладатель ГОУ ВПО НижГМА - № 2008123115; Заявлено 10.06.2008; зарег. 10.01.2010; опубл. 10.01.2010 // Бюл. - 2010. - № 1.
6. Способ определения чувствительности микроорганизмов к дезинфицирующим средствам: Метод. рекомендации / Шкарин В. В., Ковалишена О. В., Благонравова А. С. и др. - Н. Новгород, 2010.
7. Chapman J. S. // Int. Biodeteriorat. Biodegradat. - 2003. - Vol. 51, N 2. - P. 133-138.
8. Cloete T. E. // Int. Biodeteriorat. Biodegradat. - 2003. - Vol. 51, N 4. - P. 277-282.
9. Russell A. D. // J. Hosp. Infect. - 2004. - Vol. 57, N 2. - P. 97-104.
10. WhiteD. G., McDermott P. F // Curr. Opin. Microbiol. - 2001. - Vol.
4, N 3. - P. 313-317.
Поступила 10.02.11
