CC BY
65
Republic, 2014. - P.45-49. (in Russian)
9. Kulesh P.N. Combined transosseous osteosynthesis in diaphysial fractures of forearm bones and their consequences (experimental-clinical research): Abstract of dissertation of candidate of medical sciences. - Saint-Petersburg, 2008. - 32 p. (in Russian)
10. Puseva M.E., Tishkov N.V., Vasilyev V.Yu., et al. Treatment of diaphysial fractures and consequences of forearm bone injuries // Mezhdunarodniy congress "Sovremenniye tehnologii v travmatologii I ortopedii". - Moscow, 2004. - P.138-139. (in Russian)
11. SolominL.N. General aspects oftransosseous osteosynthesis by Ilizarov apparatus. - Saint-Petersburg: MORSAR AV, 2005. -544 p. (in Russian)
12. Method of transosseous osteosynthesis of diaphysial
injuries of forearm bones and the apparatus for its performance: Pat. 2328242 Ros. Federatsia: МПКА 61 В 17/66 / Puseva M.E., Grishin M.M., Korzun A.N., Mikhaylov I.N.; applicant and patent holder NCRVH VSNC SO RAMN. - №2005125886/14; appl. 15.08.2005; publ. 10.07.2008, Bul. № 19. - 11p.(in Russian)
13. Fishkin V.P., Lvov S.E., Udaltsov V.E. Regional hemodynamics in bone fractures. - Moscow: Meditsina, 1981. -184 p. (in Russian)
14. Mader К. Computer-assisted application of external fixation devices: feasibility of an anatomical computer database // A.S.A.M.I., 2004: Abstract book. - Istanbul, 2004. - P.253.
15. Stavrev V., StavrevP. Pro and contra the stable osteosynthesis of antebrachial fractures // VI съезд травматологов и ортопедов РФ. - Нижний Новгород, 1997. - С.135.
Информация об авторах:
Пусева Марина Эдуардовна - к.м.н., заведующая травматолого-ортопедическим отделением; доцент кафедры травматологии, ортопедии и нейрохирургии, 664003, г. Иркутск, ул. Борцов Революции, 1, тел. (3952) 290365; Кинаш Ирина Николаевна -к.б.н., врач-лаборант отделения лабораторной диагностики, 664003, г. Иркутск, ул. Борцов Революции, 1,тел. (3952) 290350; Верхозина Татьяна Константиновна - к.м.н., заведующая отделением функциональных методов диагностики и лечения; доцент кафедры рефлексотерапии и косметологии, 664003, г. Иркутск, ул. Борцов Революции, 1, тел. (3952) 290342.
Information About the Authors:
Puseva Marina E. - MD, PhD, Head of the Traumatological and Orthopedic Clinical Unit; Assistant Professor of the Department of traumatology, orthopedics and neurosurgery, 664003, Russia, Irkutsk, Bortsov Revolutsii str., 1, tel. (3952) 290365; Kinash Irina N. -PhD, doctor-laboratory assistant at the Department of Laboratory Diagnostics, tel.: (3952) 290350; Verkhozina Tatyana K. - MD, PhD, Head of the Department of functional methods of diagnostics and treatment, Assistant Professor of the Department of traumatology,
orthopedics and neurosurgery, tel.: (3952) 290342.
©РОДИОНОВА Л.В., ШУРЫГИНА И.А., САМОЙЛОВА Л.Г., ШУРЫГИН М.Г., ДРЕМИНА H.H. - 2015 УДК 616.711.6-007.271
способ моделирования остеорезорбции посредством введения препарата селена в условиях репаративного остеогенеза
Любовь Викторовна Родионова1-2, Ирина Александровна Шурыгина1,3, Лилия Григорьевна Самойлова1, Михаил Геннадьевич Шурыгин1,3, Наталья Николаевна Дремина1 ('Иркутский научный центр хирургии и травматологии, директор - чл.-корр. РАН Е.Г. Григорьев; 2Иркутская
государственная медицинская академия последипломного образования; ректор - д.м.н. проф. В.В. Шпрах; 3Иркутский научный центр Сибирского отделения Российской академии наук, директор - д.х.н. В.А. Иванов)
Резюме. Для решения проблем создания новых эффективных методов профилактики патологического остеогенеза необходима разработка способов воспроизведения соответствующих процессов в эксперименте. Известные способы моделирования остеопороза достаточно трудоемки, требуют ощутимых затрат времени и/или связаны с негуманным обращением с экспериментальными животными. Цель работы: разработка экономичного, воспроизводимого, гуманного и технически выгодного по сравнению с существующими технологиями метода моделирования остеорезорбции. Материалы и методы: Исследование проведено на 60 белых крысах-самцах линии Wistar. Всем крысам проводили внутрибрюшинную инъекцию: опытной группе - раствора селенометионина, контрольной группе - 0,9% NaCl. На следующий день в асептических условиях на хирургической стадии кетаминового наркоза (50 мг/кг массы тела) животным выполняли стандартный перелом верхней трети диафиза бедренной кости с ин-трамедуллярным остеосинтезом стальным штифтом. Далее животных содержали в стандартных условиях вивария в течение 3-35 суток. Выведение из эксперимента осуществляли на 3, 5, 9, 14, 21 и 35 сутки. На морфологических препаратах оценивали выраженность локальной остеорезорбции и остеокластической активности зоны перелома. Во всех 30 случаях в опытной группе получена резорбция в области срастающегося перелома и стимуляция остео-кластической активности. Таким образом, получена модель остеорезорбции за счет введения препарата селена в процессе сращения стандартного перелома бедренной кости у крыс. Воспроизводимость модели составляет 100%. Данный способ, может быть использован в экспериментальной медицине, патофизиологии и биологии как адекватная модель для изучения фундаментальных механизмов развития остеорезорбции и корректных испытаний препаратов для воздействия на костную репарацию.
Ключевые слова: перелом кости, регенерация, моделирование, селен.
OSTEORESORPTION MODELLING BY MEANS OF INTRODuCTION OF SELENIuM PREPARATION
under conditions of reparative osteogenesis
L.V. Rodionova1'2,I.A. Shurygina1,3, L.G. Samoilov1, M.G. Shurygin1,3, N.N. Dremina1 ('Irkutsk Scientific Center of Surgery and Traumatology; 2Irkutsk State Medical Academy of Continuing Education;
3Irkutsk Scientific Center SB RAS, Russia)
Summary. To solve the problems of creation of new effective methods of prevention of pathological osteogenesis is necessary to develop a means of reproduction of the relevant processes in the experiment. Known methods of modeling of osteoporosis are quite time-consuming, require to spend a considerable amount of time and/or associated with inhumane treatment of experimental animals. To solve the problems of creation of new effective methods of prevention of pathological osteogenesis is necessary to develop ways of experimental modelation pathological processes. Objective: develop cost-effective, reproducible, humane and technically advantageous in comparison with existing technologies the modeling method
of osteoresorbtion. Materials and methods: the Study was conducted on 60 white male rats (Wistar line). All rats underwent intraperitoneal injection: experimental group - Selenomethionine solution, control group - with 0,9% NaCl. The next day in aseptic surgery under ketamine anesthesia (50 mg/kg body weight) animals had a standard fracture of the upper third of the diaphysis of the femur with the intramedullary osteosynthesis with a steel pin. Next, animals were kept in standard conditions of vivarium for 3 to 35 days. Deducing from the former experiment was carried out on 3, 5, 9, 14, 21 and 35 days. From fragments of the operated limb morphological and immunohistochemical preparations were prepared and the severity of the local osteoresorbtion and osteoclastic activity in the zone of fracture were estimated. In all 30 cases in the experimental group resorption in the field coalesced fracture and stimulation osteoclastic activity were observed. Thus, the model of osteoresorbtion due to the introduction of the selenium in the process of fusion of a standard femoral fracture in rats was observed. The reproducibility of the model is 100%. This method can be used in experimental medicine, pathophysiology and biology as an adequate model for studying the fundamental mechanisms of development of osteoresorbtion and correct trials of drugs to influence bone repair.
Key words: fracture, regeneration, modeling, selenium.
Создание новых эффективных методов профилактики патологического остеогенеза, а также коррекция нарушения процессов ремоделирования костной ткани является актуальной проблемой современной медицины. Для решения этих проблем необходима разработка способов воспроизведения соответствующих патологических процессов в эксперименте. Использование биологических моделей позволяет изучать неизвестные параметры патогенеза, изменения на клеточном и системном уровнях, что часто невозможно при обследовании пациентов.
Известные технологии изменения минеральной плотности костной ткани связаны либо с воздействием эндогенных или экзогенных глюкокортикоидов [2,6,11], либо с овариэк-томией самок экспериментальных животных и применением ингибиторов протонного насоса [1,9]. Получены также линии крыс, генетически подверженных раннему старению и развитию возрастных изменений, в том числе остеопении и остеопорозу [7,8].
Вышеприведенные способы обладают существенными недостатками, а именно: они достаточно трудоемки, требуют ощутимых затрат времени и/или связаны с негуманным обращением с экспериментальными животными. Дополнительная стимуляция выброса глюкокортикоидов или их экзогенное введение вносят дополнительное системное воздействие не только на костную ткань, но и на организм в целом, в частности на иммунитет, регуляцию функции щитовидной железы и др. Кроме того, стимуляция выброса эндогенных глюкокортикоидов связана с жестоким обращением с экспериментальными животными, а введение экзогенных корти-костероидов может вызвать остеонекроз вместо остеопороза. Гипоэстрогенные модели выполняются только на самках и требуют предварительного оперативного вмешательства, что ограничивает их применение.
На основании вышесказанного была поставлена цель исследования: разработать экономичный, воспроизводимый, гуманный и технически выгодный по сравнению с существующими технологиями метод моделирования остеоре-зорбции.
Материалы и методы
Исследование проведено на 60 белых крысах-самцах линии «Вистар» 6-месячного возраста с массой тела 220-250 г. (30 крыс - опытная группа, 30 - контрольная группа). Животных содержали в условиях вивария, при естественном освещении, на стандартном рационе питания и свободном доступе к воде и пище, что соответствует нормативам ГОСТа «Содержание экспериментальных животных в питомниках НИИ» (виварий I категории, ветеринарное удостоверение 238 №0015220 от 25.03.2009 г., служба ветеринарии Иркутской области). Эксперимент выполняли в соответствии с правилами гуманного обращения с животными, регламентированными «Правилами выполнения работ с использованием экспериментальных животных» и №48 от 23.01.1985 г. «О контроле за проведением работ с использованием экспериментальных животных». Все оперативные вмешательства проводили в стерильных условиях под общей анестезией.
Накануне оперативного вмешательства в условиях операционной крысам опытной группы проводили внутрибрюшинную инъекцию
раствора селенометионина (Sigma S3132 049К1252 Seleno-L-methionine, minimum 98% TLC) концентрацией 2 мкг/мл в дозе 10 мкг/кг веса животного. Контрольной группе аналогичным образом вводили 0,9% раствор NaCl промышленного производства, стерильный. На следующий день в асептических условиях на хирургической стадии кетаминового наркоза (50 мг/кг массы тела) выполняли стандартный перелом верхней трети диафиза бедренной кости с интрамедул-лярным остеосинтезом стальным штифтом. Осуществляли тщательный гемостаз.
В течение 3-35 суток оперированных крыс содержали при естественном освещении на стандартном рационе питания и свободном доступе к пище и воде в условиях вивария.
Животные выводились из эксперимента на 3, 5, 9, 14, 21 и 35 сутки после операции. В асептических условиях после внутрибрюшинного введения кетамина (50 мг/кг веса тела) проводили декапитацию животных и отбирали фрагменты оперированной конечности для морфологического и гистологического исследования. Образцы декальцинировали разработанным нами способом [4]. Препараты окрашивали гематоксилин-эозином и оценивали выраженность локальной остеорезорбции места перелома. Для изучения остео-кластической активности в ходе репаративного процесса выполняли иммуногистохимическую окраску на специфический маркер остеокластов - карбоангидразу II типа (Rabbit Monoclonal Antibody, Epitomics, Cat. N 5204-1, Lot YIO 32313 D, рабочее разведение 1:250) [5].
результаты и обсуждение
В опытной группе получена резорбция в области срастающегося перелома и стимуляция остеокластической активности. Различия между опытной и контрольной группами наблюдались с 9 по 35 сутки с максимумом выраженности на 35 сутки. В сроки от 9 до 35 суток после операции у животных с введением препарата селена отмечалась высокая остео-кластическая активность как в зоне резорбции костных отломков, так и в зоне роста молодой кости, что обусловило к концу наблюдения (35 суток) наличие на препаратах признаков резорбции костных балок и морфологического истончения кости (рис. 1). На рисунке 1А видны хорошо сформированные костные балки, что свидетельствует о полноценном сращении перелома у животных контрольной группы. В аналогичные сроки у крыс опытной группы (рис. 1Б) в зоне перелома видны истонченные костные балки, свидетельствующие о развитии патологической остеорезорбции.
Рис. 1. Зона перелома (35 сутки после операции): А - у крысы контрольной группы, Б - у крысы опытной группы. Окраска гематоксилин-эозином, увеличение 40.
Для изучения остеокластической активности в ходе ре-паративного процесса нами применена окраска на специфический маркер остеокластов - карбоангидразу II типа. Известно, что карбоангидразы участвуют во внеклеточной ацидификации, необходимой для резорбции поверхности кости остеокластами [10], при этом центральную роль в функции остеокласта и ремоделировании кости играет кар-боангидраза II типа. Наряду с рецептором кальцитонина, кислой фосфатазой и металлопротеазой-9, карбоангидразу II считают маркером дифференцировки остеокластов.
' Ж ш :
1 ~
Рис. 2. Иммуногистохимическая окраска зоны перелома на 14 сутки: А - у крысы контрольной группы, единичные остеокласты в зоне перелома, Б - у крысы опытной группы, большое количество остеокластов в зоне перелома. Первичные антитела к карбоангидразе II типа, увеличение 400.
При анализе препаратов контрольной группы установлено, что остеокластическая активность отмечалась в зоне перелома с 9 суток, когда фиксировались единичные восьмиядерные клетки в зоне перелома и перестройки кости. На 14 сутки остеокластическая активность нарастала, достигая максимума, при этом остеокласты располагались в основном в зоне резорбции костных отломков (рис. 2А). К 21 суткам отмечали снижение остеокластической активности в зоне отломков, обнаружены ярко окрашенные одно-четырехядерные клетки в зоне формирования молодой кости, а к 35 суткам в зоне перелома наблюдались только единичные остеокласты. При использовании окраски на карбоангидразу II типа выявляются не только окрашенные вось-миядерные клетки в зоне перелома, которые по морфологическим признакам без труда можно классифицировать как остеокласты, но и положительно окрашенные клетки, которые по морфологическим признакам не являются типичными остеокластами. Так, при изучении области перелома в срок 14 и 21 сутки выявлялись ярко окрашенные одно- четырехядерные клетки в зоне формирования молодой кости. Учитывая яркую специфическую окраску на наличие активности карбо-ангидразы II типа в данных клетках, можно утверждать, что использование окрашивания на наличие в клетках карбо-ангидразы II типа позволило выявить клетки, преддиффе-ренцированные в остеокластическом направлении, еще до формирования типичной морфологической картины, характерной для остеокластов.
В группе с введением препарата селена выявлена ярко выраженная остеокластическая активность в сроки от 9 до 35 суток. На 9 сутки у животных этой группы отмечалось большое количество остеокластов в зоне резорбции кости
в области перелома. К 14 суткам наряду с большим количеством остеокластов в области отломков обнаруживалось большое количество остеокластов в зоне формирования молодой костной ткани (рис. 2Б). Высокая остеокластическая активность сохранялась на 21 и 35 дни наблюдения, что, по-видимому, приводило к концу наблюдения к истончению костных балок.
На рисунке 3А приведены морфологические фотографии зоны перелома на 35 сутки, где видно отсутствие остеокластов в зоне перелома и толстые костные балки у крысы контрольной группы и большое количество остеокластов в зоне репарации и истончение костных балок у крысы с предварительной инъекцией препарата селена (рис. 3Б).
Таким образом, предлагаемый способ позволяет получить модель остеорезорбции за счет введения препарата селена в процессе сращения стандартного перелома бедренной кости у крыс. При этом наблюдается снижение интенсивности осси-фикации формирующейся костной мозоли [3].
Воспроизводимость модели составляет 100%. Данный способ может быть использован в экспериментальной медицине, патофизиологии и биологии как адекватная модель для изучения фундаментальных механизмов развития остео-резорбции и корректных испытаний препаратов для воздействия на костную репарацию.
Предлагаемый способ хорошо воспроизводим, требует общедоступных условий и мате-
А Б
Рис. 3. Иммуногистохимическая окраска зоны перелома на 35 сутки: А - у крысы контрольной группы, остеокласты отсутствуют, Б - у крысы опытной группы, истончение костных балок, большое количество остеокластов. Первичные антитела к карбоангидразе II типа, увеличение 400.
риалов, обеспечивает возможность получения локальной резорбции костной ткани при репаративном остеогенезе и может быть использован при экспериментальной разработке новых методов лечения и профилактики нарушений метаболизма костной ткани в процессе репаративной регенерации.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Прозрачность исследования. Исследование не имело спонсорской поддержки. Исследователи несут полную ответственность за предоставление окончательной версии рукописи в печать.
Декларация о финансовых и иных взаимодействиях. Все авторы принимали участие в разработке концепции и дизайна исследования и в написании рукописи. Окончательная версия рукописи была одобрена всеми авторами. Работа поступила в редакцию: 26.05.2015 г.
литература
1. ЛазебникЛ.Б., Лычкова А.Э., Петраков А.В. Способ моделирования остеопороза. Патент на изобретение № 2384894. - 2008.
2. Подковкин В.Г., Иванов Д.Г. Способ стимуляции костной резорбции у лабораторных животных. Патент на изобретение № 2384891. - 2008.
3. Шурыгина И.А., Родионова Л.В., Шурыгин М.Г. и др. Конфокальная микроскопия в изучении влияния оригинальных про-ферментных наногликоконъюгатов элементного селена на регенерацию опорных тканей // Известия Российской академии наук. Серия физическая. - 2015. - Т. 79.
№2. - С.280-282.
4. Шурыгина И.А., Шурыгин М.Г. Способ приготовления препарата костной ткани и набор для его осуществления. Патент на изобретение 2500104. - 2012.
5. Шурыгина И.А., Шурыгин М.Г., Родионова Л.В. и др. Карбоангидраза как маркер активности остеокластов при репарации зоны перелома длинной кости // Бюллетень ВсНЦ СО РАМН. - 2012. - №5-2 (87). - С.120-122.
6. Якупов Р.Р., Рахматуллин С.И., Ибатуллина Р.Б. и др. Способ изменения структуры костной ткани при экспериментальном стероидном остеопорозе. Патент на изобрете-
Hue № 2371189. - 2009.
7. Chen H., Emura S., Isono H., Shoumura S. Effects of traditional Chinese medicine on bone loss in SAMP6: a murine model for senile osteoporosis // Biol. Pharm. Bull. - 2005. - Vol. 28. №5. - P.865-869.
8. Frost H.M., Jee WS. On the rat model of human osteopenias and osteoporoses // Bone Miner. - 1992. - Vol. 18. №3. - P.227-236.
9. Jiang G., Matsumoto H., Yamane J., et al. Prevention of
trabecular bone loss in the mandible of ovariectomized rats // J.Oral Sci. - 2004. - Vol. 46. №2. - P.75-85.
10. Oksala N., Levula M., Pelto-Huikko M., et al. Carbonic anhydrases II and XII are up-regulated in osteoclast-like cells in advanced human atherosclerotic plaques - Tampere Vascular Study // Ann. Med. - 2010. - Vol. 42. №5. - P.360-370.
11. Wang G., Cui Q., Balian G. The patogenesis and prevention of steroid induced osteonecrosis // Clin.Orthop. - 2000. - №370. - P.295-310.
REFERENCES
1. Lazebnik L.B., Lychkova A.E., Petrakov A.V. Method of modeling osteoporosis. Patent No. 2384894. - 2008. (in Russian)
2. Podkovkin V.G., Ivanov D.G. A Method of stimulating bone resorption in laboratory animals. Patent No. 2384891. - 2008. (in Russian)
3. Shurygina I.A., Rodionova, L.V., Shurygin M.G., et al. Confocal microscopy to investigate the influence of the original Pro-enzyme neoglycoconjugates of elemention of selenium in supporting tissue regeneration // Izvestiya Rossiyskoy akademii nauk. Seriya phisicheskaya. - 2015. - Vol. 79. №2. - P.280-282. (in Russian)
4. Shurygina I.A., Shurygin M.G. Method of the preparation of bone tissue and its implementation. Patent 500104. - 2012. (in Russian)
5. Shurygina I.A., Shurygin M.G., Rodionova, L.V., et al. Carbonic anhydrase as a marker of the activity of osteoclasts at repair zone of fractures of long bones // Bulleten VSNC SO RAMN. - 2012. - №5-2 (87). - S.120-122. (in Russian)
6. Yakupov R.R. Rakhmatullin, S.I., Ibatullin R.B., et al. Method
of changing the structure of the bone tissue in the experimental steroid osteoporosis. Patent No. 2371189. - 2009. (in Russian)
7. Chen H., Emura S., Isono H., Shoumura S. Effects of traditional Chinese medicine on bone loss in SAMP6: a murine model for senile osteoporosis // Biol. Pharm. Bull. - 2005. - Vol. 28. №5. - P.865-869.
8. Frost H.M., Jee WS. On the rat model of human osteopenias and osteoporoses // Bone Miner. - 1992. - Vol. 18. №3. - P.227-236.
9. Jiang G., Matsumoto H., Yamane J., et al. Prevention of trabecular bone loss in the mandible of ovariectomized rats // J.Oral Sci. - 2004. - Vol. 46. №2. - P.75-85.
10. Oksala N., Levula M., Pelto-Huikko M., et al. Carbonic anhydrases II and XII are up-regulated in osteoclast-like cells in advanced human atherosclerotic plaques - Tampere Vascular Study // Ann. Med. - 2010. - Vol. 42. №5. - P.360-370.
11. Wang G., Cui Q., Balian G. The patogenesis and prevention of steroid induced osteonecrosis // Clin.Orthop. - 2000. - №370. - P.295-310.
Информация об авторах:
Родионова Любовь Викторовна - заведующая лабораторией клеточной патофизиологии и биохимии, ассистент кафедры клинической лабораторной диагностики, к.б.н.; 664003, Иркутск, ул. Борцов Революции, 1, ИНЦХТ, тел. (3952) 290350, e-mail: greidmacho@yandex.ru; Шурыгина Ирина Александровна - заместитель директора по научной и инновационной деятельности, заведующая лабораторией патофизиологии тканей и функциональной морфологии, д.м.н., тел. (3952) 290369;
Самойлова Лилия Григорьевна - младший научный сотрудник лаборатории клеточной патофизиологии и биохимии; Шурыгин Михаил Геннадьевич - заведующий научно-лабораторным отделом, д.м.н.; Дремина Наталья Николаевна - старший научный сотрудник лаборатории патофизиологии тканей и функциональной морфологии, к.б.н.
Information About the Authors:
Rodionova L.V. - PhD (Biology), Head of the Laboratory of cellular pathophysiology and biochemistry of Irkutsk Scientific Center of Surgery and Traumatology, assistant Professor of Department Clinical laboratory diagnostics, Irkutsk Scientific Center of Surgery and Traumatology, Bortsov Revolutsii str., 1, Irkutsk, Russia, 664003, phone (3952) 290350; e-mail: greidmacho@yandex.ru; Shurygina I.A. - MD, PhD, DSc, Deputy Director for research and innovation Affairs, Head of laboratory of pathophysiology of tissue and functional morphology of Irkutsk Scientific Center of Surgery and Traumatology, phone (3952) 290369; Samoilova L.G. - Junior researcher of the Laboratory of cellular pathophysiology and biochemistry of Irkutsk Scientific Center of Surgery and Traumatology; Shurygin M.G. - MD, PhD, DSc, Head of the research and laboratory Department of Irkutsk Scientific Center of Surgery and Traumatology Irkutsk Scientific Center of Surgery and Traumatology; Dremina N.N. - PhD (Biology), Senior researcher of the laboratory of
pathophysiology of tissues and functional morphology.
© ЛЕБЕДИНСКИЙ В.Ю., ПУСЕВА М.Э., НЕТЕСИН Е.С., МИХАЙЛОВ И.Н. - 2015 УДК 616.717.5/.6-092.9
динамика количественных параметров регенерации в эксперименте
Владислав Юрьевич Лебединский1, Марина Эдуардовна Пусева2,3, Евгений Станиславович Нетесин3, Иван Николаевич Михайлов2 ('Иркутский национальный исследовательский технический университет, ректор - д.ф.-м.н. А.Д. Афанасьев; 2Иркутский научный центр хирургии и травматологии, директор - д.м.н., проф. В.А. Сороковиков; 3Иркутская государственная медицинская академия последипломного образования; ректор - д.м.н., проф. В.В. Шпрах)
Резюме. В литературе по изучению структуры костного регенерата в основном описаны качественные характеристики его изменений, а количественные параметры оценки регенераторных процессов при заживлении переломов костей предплечья отсутствуют. Цель исследования: разработка и проведение количественной оценки регенераторного процесса при удлинении конечности с использованием морфометрических методов исследования в эксперименте. В выполненном исследовании проведена не только качественная, но и количественная оценка структуры при перестройке дистракционного регенерата костей предплечья кролика с использованием морфометрии. Динамика процесса формирования и ремоделирования дистракционного костного регенерата в эксперименте ещё полностью не завершается в сроки проведенного эксперимента - к 20-м суткам фиксации. Так относительный объем сосудов в регенерате увеличивается на 70%, а количество клеток возрастает на 60%, при этом относительный объем тканевых структур ниже, чем в интактной кости, по этим показателям можно ссудить о незавершившемся процессе костеобразования в зоне регенерата.
Ключевые слова: костный дистракционный регенерат, морфология.
DYNAMICS OF QuANTITATIVE PARAMETERS OF REGENERATION IN THE ExPERIMENT
V.Yu. Lebedinskiy1, M.E. Puseva2,3, E.S. Netesin3, l.N.Mikhaylov2 (Irkutsk National Research Technical University; 2Irkutsk Scientific Center of Surgery and Traumatology;
3Irkutsk State Medical Academy of Continuing Education; Russia)
Summary. Literature data devoted to bone regenerate structure describe mainly qualitative characteristics of bone changes, whereas there are not enough information about quantitative parameters of evaluation of forearm fractures regeneration process. Aim of the study: working out and conducting quantitative evaluation of regeneration process in experimental limb lengthening with application of morphometric research methods. The performed research included not only qualitative, but also quantitative evaluation of rabbit's distractive brachium bone graft with morphometric methods. The process of formation and remodeling of distractive bone graft has not been entirely complete within the terms of conducted experiment - by the 20th day of fixation. So, for example relative vascular volume in the bone graft increases by 75%, and cell number grows by 60%; with that lower relative volume of tissue structures than in intact bone. These figures can be indicative of incomplete process of bone formation in the graft area.
Key words: distractive bone graft, morphology.
В современной литературе по изучению структуры костного регенерата в основном описаны качественные характеристики его изменений [5,6,7,8,15]. В то же время количественные параметры оценки регенераторных процессов при заживлении переломов костей предплечья в доступной литературе практически отсутствуют, что не позволяет объективно оценить особенности их течения.
В связи с этим целью выполненной работы явилось проведение преимущественно количественной оценки регенераторного процесса при заживлении переломов костей предплечья с использованием морфометрических методов исследования.
Материалы и методы
Содержание животных, оперативные вмешательства и их эвтаназию осуществляли согласно требованиям приказа Минздрава СССР №755 от 12.08.1977 г., а также руководствуясь требованиями, изложенными в «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях» с соблюдением этических норм и гуманного отношения к объектам изучения.
Критериями включения животных (кролики -Oryctoiaguscuniculis; класс млекопитающих - Mammalia; отряд грызунов - Rodentia; семейство заячьих - Leporidae; порода -Шиншилла) в эксперимент были их стандартизация: по полу (мужской), возрасту (6-7 мес.), весу - 3,0 (2,895-3,000) кг и длине костей предплечья - 7,15 (7,0-7,2) см. Из особенностей строения костей предплечья у кроликов следует отметить то, что лучевая и локтевая кости у них между собой соединены межкостной мембраной, которая по плотности близка к костному веществу, а их движений относительно друг друга в сочленениях нет [9].
Прооперировано 14 животных по методу Г. А. Илизарова. Дистракцию начинали выполнять на 5 сутки со дня операции с темпом 1 мм в сутки, (дискретно во времени 0,25 мм х 4 раза в сутки). Продолжительность дистракции составляла 10 суток.
Всем животным были выполнены на разных сроках эксперимента (до операции, после операции, 10 сутки дистракции, 10 и 20 суток фиксации в АВФ) рентгенографическое исследование передней конечности кролика, мультиспи-ральная компьютерная томография (МСКТ), гаммасцинтиграфия. Анализ полученных при этом результатов проведен и обсужден в более ранних публикациях [10,11,12,13,14].
Также на материале от всех экспериментальных животных проводили морфологическое исследование костного регенерата с использованием количественных методов оценки его морфофункционально-го состояния. Сроки изучения регенерата 10 и 20 суток выбраны в соответствии с данными литературы [3,4,6].
После эвтаназии, из оперированной конечности кроликов выпиливался участок кости высотой 1,5 см, в центре
которого находился дистракционный регенерат размером 1 см. После фиксации и проводки из него изготовлялись срезы толщиной 10-12 мкм - окраска которых производилась гематоксилин-эозином. Изготовление и окраска срезов проводилась по общепринятой методике [1].
Морфометрические исследование выполняли с использованием окулярной сетки и системы анализа изображений [1,2]. В регенерате определялся относительный объем сосудов и тканевых структур. В последних выявляли количество клеток и межклеточного вещества. Кроме того в межклеточном веществе были определены оссифицированные и неос-сифицированные структуры.
При анализе полученного морфологического материала в регенерате рассчитывались три группы индексов: сосудисто-тканевые отношения, клеточно-тканевые взаимоотношения, индекс оссификации, который определяли путем деления количества оссифицированных элементов на количество неос-сифицированных структур.
Сосудисто-тканевые отношения и клеточно-тканевые взаимоотношения рассчитывались путем деления относительного объема сосудов и клеток на количество соответствующих тканевых структур.
Статистический анализ полученных результатов выполнен с помощью программы 81а18оЙ:8 и Ехсе1. Оценка нормальности распределения критерием Шапиро-Уилка Ш. Во всех выборках показаны низкие значения Ш статистики, что говорит об отсутствие нормальности распределения, поэтому для дальнейшего статистического анализа решено остановиться на непараметрических критериях, не требующих нормальности распределения вариант. Сравнение изменений исследуемых признаков между выборками выполнено критерием Манна-Уитни и. Различия сравниваемых величин считали статистически значимыми при р<0,05.
Результаты и обсуждение
На основании полученных результатов можно отметить, что относительный объем сосудов в интактной кости в среднем составил 7,2±0,4%, а количество тканевых структур было равно 92,8±2,6%. Среди них в интактной кости 10,4±1,6% их относительного объема занимали клетки, а 89,6±2,8% - межклеточное вещество (табл. 1).
На основании полученных результатов, можно отметить, что относительный объем сосудов в интактной кости в среднем составил 7,2±0,4%, а количество тканевых структур было равно 92,8±2,6%. Среди них в интактной кости 10,4±1,6% относительного объема занимали клетки, а 89,6±4,8% - межклеточное вещество.
Таблица 1
Количественная характеристика структурных элементов костного регенерата (%)
Сроки Сосуды Тканые Тканевые структуры Межклеточное вещество
наблюдения структуры Количество
клеток межклеточного вещества оссифицированных структур не оссифицированных структур
10 суток 11,0±1,1 89±3,2 12,4±0,8 87,6±2,4 28,0±1,5 56,0±4,4
20 суток 12,5±1,4 87,5±4,1 16,4±1,6 83,6±4,9 32,1±2,2 51,5±5,7
Интактная кость 7,2±0,4 92,8±2,6 10,4±1,6 89,6±4,8 - -
