CC BY
63
КОРОТКІ ПОВІДОМЛЕННЯ
УДК 577.151.042: 577.152.311
СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ БУТИРИЛХОЛИНЭСТЕРАЗЫ ИЗ СЫВОРОТКИ КРОВИ ЛОШАДИ
Учреждение Российской Академии наук «Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И. М. Сеченова РАН», Санкт-Петербург
E-mail: lpkuz@iephb.ru
При промышленном производстве холинэстераз и в лабораторной практике иногда возникает необходимость в идентификации этих энзимов. Это может быть связано с нарушениями маркировки в процессе производства энзимов, а также при контроле и хранении готовой продукции.
Предложен способ идентификации, позволяющий отличить бутирилхолинэстеразу из сыворотки крови лошади от холинэстераз из других биологических источников: ацетилхолинэстераз — из электрического органа электрического ската и угря, из эритроцитов верблюда, лошади и человека; бутирилхолинэстераз — из сыворотки крови и из мозговой ткани голубя; пропионилхолинэстераз — из сыворотки крови и из мозговой ткани. Способ основан на различной чувствительности холинэсте-разного домена (каталитического центра) этих энзимов к двум обратимым фосфониевым ингибиторам: (С6Н5)3 Р+- СН31- (1) и (С6Н5)3 Р+- СН2СН2СН3Вг(2). Для каждого энзима определяют концентрацию ингибитора (С1 для ингибитора-1 и С2 для ингибитора-2), которая уменьшает энзиматическую активность в 2 раза, затем вычисляют величину отношения С1/С2. Если эта величина больше, чем 4, можно сделать вывод о том, что идентифицируемым энзимом является бутирилхолинэстераза из сыворотки крови лошади.
Ключевые слова: ацетилхолинэстераза, бутирилхолинэстераза, пропионилхолинэстераза, фосфониевые ингибиторы.
Ю. Г. Жуковский В. А. Жуковская Л. П. Кузнецова Е. Р. Никитина Е. Е. Сочилина
При промышленном производстве холинэстераз и в лабораторной практике иногда возникает необходимость в идентификации этих энзимов. Это может быть связано с нарушениями маркировки в процессе производства энзимов, а также при контроле и хранении готовой продукции.
Широко известна возможность идентификации типов холинэстераз путем сравнительной оценки их способности гидролизовать при оптимальных условиях холиновые эфиры «стандартного набора»: ацетилхо-лин, пропионилхолин, бутирилхолин и аце-тил-в-метилхолин. Так, ацетилхолинэстера-зы с наибольшей скоростью гидролизуют субстрат ацетилхолин, пропионилхолинэс-теразы — субстрат пропионилхолин, бути-рилхолинэстеразы — субстрат бутирилхо-лин, ацетил-в-метилхолинэстеразы — субстрат ацетил-в-метилхолин [1]. Этот спо-
соб позволяет идентифицировать типы хо-линэстераз, но не пригоден для надежной идентификации индивидуальной холинэсте-разы внутри одного типа. Это прежде всего связано с недостаточно выраженной субстратной внутритиповой специфичностью холинэстераз.
Известен способ определения различий между ацетилхолинэстеразами и бутирил-холинэстеразами путем сравнения чувствительности идентифицируемого энзима к различным ингибиторам [2]. Он дает возможность, например, отличить ацетилхоли-нэстеразу эритроцитов лошади от бутирил-холинэстеразы сыворотки крови лошади: первый энзим намного более чувствителен к параоксону, чем к изопестоксу, а второй, наоборот, имеет большую чувствительность к изопестоксу, чем к параоксону. Существует также способ идентификации индивидуальной
ацетилхолинэстеразы среди энзимов этого же класса [3], позволяющий отличить аце-тилхолинэстеразу из электрических рыб от ацетилхолинэстеразы эритроцитов человека, лошади и верблюда. Он основан на различиях в чувствительности этих энзимов к обратимому ингибирующему действию пяти фосфониевых соединений.
Особенности каталитических свойств активного центра холинэстераз по отношению к различным ингибиторам, в том числе и к обратимым фосфониевым, активно изучаются [4, 5]. Накоплен значительный экспериментальный материал, анализ которого дает возможность приблизиться к решению вопроса об идентификации некоторых энзимов.
В настоящей работе описан способ, дающий возможность отличить бутирилхоли-нэстеразу из сыворотки крови лошади от хо-линэстераз, выпускаемых промышленным способом из других биологических источников (бутирилхолинэстераза, пропионилхо-линэстераза). Способ основан на сравнении чувствительности холинэстераз к обратимому ингибирующему действию двух фосфо-ниевых соединений: (С6Н5)3Р+- СН31-
и (СбН5)зР+-СН2СН2СНз Вг-.
В работе в качестве субстратов применяли ацетилхолин, бутирилхолин и ацетилтио-холин йодистые (Chemapol, Чехия).
Как обратимые ингибиторы использовали два фосфониевых соединения, синтез которых описан в работах [6, 7]:
(С6Н5)3Р+- СН3Г (ингибитор 1);
(С6Н5)3Р+- СН2СН2СН3Вг- (ингибитор 2).
Использовали частично очищенные лио-филизированные препараты ацилхолинэсте-раз (НФ 3.1.1.8): бутирилхолинэстеразы из сыворотки крови лошади (БуХЭЛ) и голубя (БуХЭГ) с удельной активностью 9,6 Е/мг и 12 Е/мг соответственно, бутирилхолинэсте-разу из мозговой ткани (БуХЭБг) — 18 Е/мг; пропионилхолинэстеразы (НФ 3.1.1.8) из мозговой ткани (ПХЭ № 1) и из сыворотки крови (ПХЭ № 2) — 53 Е/мг и 0,7 Е/мг соответственно; ацетилхолинэстеразы (НФ 3.1.1.7) из электрического органа электрического ската Torpedo marmorata (АХЭС) — 1000 Е/мг и электрического угря Electrophorus electri-cus (АХЭУ) — 1 000 Е/мг (Sigma, США), из эритроцитов верблюда (АХЭВ) — 0,02 Е/мг, лошади (АХЭЛ) — 1,2 Е/мг и человека (АХЭЧ) — 6,1 Е/мг. Препараты холинэстераз изготовлены в Пермском НИИВС.
Удельную активность энзимов определяли методом потенциометрического титрова-
ния с использованием в качестве субстрата 2 мМ ацетилхолина для ацетилхолинэсте-раз и 2 мМ бутирилхолина для ацилхоли-нэстераз (25 °С, 0,1 М хлорид калия, рН 7,5).
Скорость холинэстеразного гидролиза ацетилтиохолина в отсутствие и в присутствии ингибитора устанавливали фотометрическим методом Эллмана [8] при температуре 25 °С, рН 7,5. Реакционная смесь состояла из 1 мл 1 мМ раствора 5,5'-дитио-бис-(2-нитробензойной кислоты) в 100 мМ фосфатном буфере (рН 7,5), 1 мл раствора энзима (0,2 E/мл), 1 мл 0,5 М раствора хлорида калия, 1 мл воды в контрольной пробе или 1 мл раствора ингибитора в опытной пробе и 1 мл 2,5 мМ раствора ацетилтио-холина.
С помощью фотоэлектроколориметра ФЭК-56 (светофильтр № 3) измеряли время в секундах, за которое оптическая плотность реакционной смеси возрастает на величину
0,1 (tR — в контрольном опыте без ингибитора, tQn — в опыте с ингибитором). Подбирали такую концентрацию ингибитора, при которой энзиматическая активность уменьшится вдвое, т. е. tQn / tR = 2.
С целью идентификации БуХЭЛ была исследована чувствительность холинэстераз, полученных промышленным способом, к фос-фониевым соединениям, из которых выбраны два — ингибитор 1 и ингибитор 2. В таблице приведены их концентрации, уменьшающие холинэстеразную активность в два раза (С1 — для ингибитора 1 и С2 — для ингибитора 2). Из данных таблицы следует, что наименьшую чувствительность к обоим ингибиторам проявляет только БуХЭБг (С1 = С2 = 1 200мкМ), а наибольшую—АХЭЧ (52 и 120 мкМ). Значения С1 и С2 для БуХЭЛ не выделяются среди таковых для других холинэстераз. БуХЭЛ проявляет примерно одинаковую чувствительность к ингибитору 1 наряду с БуХЭГ, ПХЭ №1, ПХЭ №2, АХЭЛ и АХЭС (300-430 мкМ), и все они уступают в чувствительности АХЭВ, АХЭЧ и АХЭУ (120-200 мкМ). Что касается ингибитора 2, то БуХЭЛ, наряду с АХЭЧ и АХЭВ, наиболее чувствительны к нему (40-82 мкМ) и существенно отличаются по этому показателю от остальных хо-линэстераз (150-600 мкМ). Из вышесказанного следует, что концентрации С1 и С2 не позволяют надежно отличить БуХЭЛ от других холинэстераз. Однако, если сравнить действие ингибиторов 1 и 2 на каждый энзим, отчетливо видно, что только у БуХЭЛ наблюдается особенно большая разница в их действии: величина С1 превышает С2 в 9,5
раза (С1/С2 = 9,5). Для остальных холинэстераз величины С1/С2 колеблются от 0,7 до 2,5. Выявленная особенность в чувствительности БуХЭЛ к ингибиторам 1 и 2 позволяет надежно отличить этот энзим от холинэсте-раз, производимых из других биологических источников.
Принимая во внимание вышеизложенное, идентификацию БуХЭЛ предлагается
осуществлять таким образом. Подбирают такую концентрацию ингибитора [С1 — для (С6Н5)3Р+-СН31- и С2 — для ингибитора (с6Н5)3Р+-СН2СН2СН3Вг], которая уменьшает холинэстеразную активность в два раза, затем вычисляют величину отношения С1/С2 и в том случае, если эта величина больше, чем 4, делают вывод, что идентифицируемым энзимом является БуХЭЛ.
Концентрации ингибиторов 1 (С]_) и 2 (С2), при которых холинэстеразная активность уменьшается в 2 раза, и величины их отношения (Сг/С2)
(Погрешность 10%; п = 5; Р = 0,95)
Энзим Сі, мкМ С2, мкМ Сі/С2
БуХЭЛ 380 40 9,5
БуХЭГ 430 280 1,5
БуХЭБг 1200 1200 1,0
ПХЭ №1 430 600 0,7
ПХЭ №2 380 280 1,4
AXЭВ 200 80 2,5
AXЭЛ 380 150 2,5
AXЭЧ 120 52 2,3
AXЭС 300 360 0,8
AXЭУ 180 210 0,9
ЛИТЕРАТУРА
1. Usdin E. Anticholinesterase agents. Intern. Encyclopedia Pharmac. Ther. — Pergamon Press, 1970. — V. 1. — Р. 133.
2. Aldridge W. N. The differentiation of true and pseudo cholinesterase by organophosphorus compounds // Biochem. J. — 1953. — V. 53, N 1. — P. 62-67.
3. Жуковский Ю. Г., Кузнецова Л. П., Сочили-на Е. Е., Никитина Е. Р. Способ идентификации ацетилхолинэстераз из различных биологических источников // Бмтехнолопя. — 2010. — Т. 3, № 1. — С. 58-61.
4. Бресткин А. П., Кузнецова Л. П., Мора-лёв С. Н., Розенгарт Е. В., Эпштейн Л. М. Холинэстеразы наземных животных и гид-
робионтов. — Владивосток: TИНРО-центр, 1997. — 466 с.
5. Басова Н. Е., Розенгарт Е. В., Суворов А. А Фосфониевые обратимые ингибиторы холинэстераз разных животных // Докл. акад. наук. — 2010. — T. 434, № 3. — С. 407-411.
6. Houben-Weyl: Methoden der Organischen Chemie. — 1958. — Bd. XII/I. — P. 75-82.
7. Органикум. Практикум по органической химии / Пер. с нем. Потапова В. M., Пономарёва С. В. — M.: Mир, 1979. — T. 1. — С. 277-278.
8. Ellman G. L., Courtney K. D., Andres V. Jr., Featherstone R. M. A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity // Biochem. Pharmacol. — 1961. — V. 7, N 1. — P. 88-95.
СПОСІБ ІДЕНТИФІКАЦІЇ БУТИРИЛХОЛІНЕСТЕРАЗИ ІЗ СИРОВАТКИ КРОВІ КОНЯ
Ю. Г. Жуковський В. А. Жуковська Л. П. Кузнєцова О. Р. Нікітіна О. О. Сочиліна
Установа Російської Академії наук «Інститут еволюційної фізіології і біохімії ім. І. М. Сєченова РАН», Санкт-Петербург
E-mail: lpkuz@iephb.ru
Під час промислового виробництва холін-естераз в лабораторній практиці іноді виникає необхідність в ідентифікації цих ензимів. Це може бути пов’язано з порушеннями маркування в процесі виробництва ензимів, а також контролю та зберігання готової продукції.
Запропоновано спосіб ідентифікації, що дозволяє відрізнити бутирилхолінестеразу із сироватки крові коня від холінестераз з інших біологічних джерел: ацетилхолінестераз — із електричного органа електричного ската і вугра, з еритроцитів верблюда, коня і людини; бутирилхолінестераз — із сироватки крові та мозкової тканини голуба; пропіонілхолінес-тераз — із сироватки крові та мозкової тканини. Спосіб ґрунтується на різній чутливості холінестеразного домена (каталітичного центру) цих ензимів до двох оборотних фосфоніє-вих інгібіторів: (С6Н5)3Р+- СН3-Г (1) і
(С6Н5)3Р+- СН2СН2СН3Вг- (2). Для кожного ензиму визначають концентрацію інгібітора (С1 для інгібітора-1 і С2 для інгібітора-2), яка зменшує ензиматичну активність у 2 рази, потім обчислюють величину відношення С1/С2. Якщо ця величина більша за 4, можна зробити висновок про те, що ідентифікованим ензимом є бутирилхолінестераза із сироватки крові коня.
Ключові слова: ацетилхолінестераза, бути-рилхолінестераза, пропіонілхолінестераза, фосфонієві інгібітори.
THE METHOD FOR IDENTIFICATION OF HORSE SERUM BUTYRYLCHOLINESTERASE
Yu. G. Zhukovskii V. A. Zhukovskaya L. P. Kuznetsova O. R. Nikitina O. O. Sochilina
Sechenov Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry of the Russian Academy of Sciences, St. Petersburg
E-mail: lpkuz@iephb.ru
In the industrial production of cholinesterase and in laboratory practice, sometimes it needs to identificate these enzymes. It might be due to violations of labeling in enzyme production and control and storage of the readymade products as well.
A method for identification of horse serum butyrylcholinesterase out of cholinesterases from other biological sources such as acetylcholinesterases of the electric eel and numbfish electric tissues, out of the human, horse and camel erythrocytes; butyrylcholinesterases — of the pigeon blood serum and pigeon brain tissue; propionylcholinesterases — out of the serum and the brain tissue was suggested. The method is based on different sensitivity of cholinesterase domen (catalytic centre) of there enzymes to the two reversible phosphonium inhibitors: (C6H5)3P+- CH3 I- (1) and (C6H5)3P+- CH2CH2CH3 Br- (2). For this purpose inhibitor concentration (C for inhibitor 1 and C2 for inhibitor 2) decreasing enzymatic cleavage of each cholinesterase twofold was determined and then the value of relation C1/C2 was calculated. The identified cholinesterase was horse serum butyrylcholinesterase if the value C1/C2 was higher than 4.
Key words: acetylcholinesterase, butyrylcholinesterase, propionylcholinesterase, phosphonium inhibitors.
