CC BY
232
УДК 619.15
О. В. Федорова, З. С. Юнусова, А. И. Назмиева, Р. Т. Валеева
СПОРООБРАЗУЮЩИЕ ПРОБИОТИЧЕСКИЕ МИКРОБНЫЕ КУЛЬТУРЫ И ПРЕПАРАТЫ НА ИХ ОСНОВЕ
Ключевые слова: споры, споровые микроорганизмы.
Спорообразующие пробиотические препараты одни из производимых препаратов, как на мировом рынке, так и в Российской Федерации в последние годы. В работе проведен обзор литературных источников, посвященных вопросам спорообразования, спорообразующим бактериям, описаны механизмы их действия, сферы их применения.
Key words: spores, bacteria spore.
Spore-forming probiotic preparations produced some of the drugs on the world market and in the Russian Federation in recent years. In this paper a review of the literature devoted to the issues of sporulation, spore-forming bacteria, describes their mechanisms of action, the scope of their application.
Для современной биотехнологии аэробные спорообразующие бактерии, как продуценты биологически активных веществ, являются перспективной группой микроорганизмов и составляют довольно обширную группу [1].
Все чаще в качестве пробиотических культур большой интерес у микробиологов вызывают спорообразующих бактерии рода Bacillus [2-5]. Данная культура относится к уникальной группе грамположительных аэробных бактерий семейства Bacillaceae по причине повсеместного распространения представителей этого рода бактерий, цикла развития, необычной устойчивости их спор к химическим и физическим агентам и патогенности [6]. Основными признаками этого рода являются: образование эндоспор, наличие каталазы, в большинстве случаев положительная окраска по Граму [7].
Эндоспоры бактерий это особый тип покоящихся клеток, в основном грамположительных бактерий, которые формируются эндогенно, т.е. внутри материнской клетки, которая называется спорангием.
Бактерии рода Bacillus можно разделить на три группы, различающиеся по структуре и внутриклеточной локализации эндоспор:
- споры овальные, расположение их в материнской клетке центральное, растяжение клетки спорой не происходит. Это споры у большинства Bacillus: B. subtilis, B. cereus, B. megaterium, B. anthracis, B. thuringiensis;
- споры овальные, имеющие толстую оболочку с выростами, расположение их в материнской клетке центральное. Они «растягивают» клетки изнутри в ходе споруляции. Это споры у Bacillus polymyxa, Bacillus stearothermophilus;
- споры сферические, расположение их в материнской клетке полярное. Эндоспоры «растягивают» клетку в ходе споруляции. Это споры у Bacillus pasteurii [8, 9].
Споровые микроорганизмы относятся к транзитным (проходящим с кормовыми массами) просветным микроорганизмам, большая часть является аэробами, растут и размножаются при
доступе молекулярного кислорода [10]. Споровые микроорганизмы являются типичными
представителями гнилостной микрофлоры за счет ярко выраженных протеолитических свойств [10]. Они обладают набором свойств: антагонистическая активность, способность к адгезии на эпителиоцитах кишечника, определенный уровень резистентности к соляной кислоте, желчи, позволяющие конкурировать с патогенными и условно-патогенными микроорганизмами [11].
Спорообразующие бактерии относятся к гетеротрофам, к микроорганизмам, нуждающимся в готовых органических соединениях. Для огромного большинства спорообразующих бактерий лучшими источниками азотного питания являются белки и аминокислоты сложных органических соединений. На средах с минеральными соединениями азота большинство этих бактерий развивается слабо [12].
Переход бактерий к спорообразованию -споруляции наблюдается обычно при истощении питательного субстрата, недостатке источников углерода, азота, фосфора, изменении рН. Процесс спорообразования энергозависим, поэтому от источника поступления энергии споруляцию разделяют на эндотрофную и экзотрофную. Эндотрофная споруляция осуществляется за счет внутреннего запаса энергии клетки и не нуждается в дополнительных веществах. Экзотрофная споруляция осуществляется за счет экзогенной энергий поступающей извне. Способность к образованию спор детерминируется генами spo, так по данным Г. Халворсена у бактерий Bacillus subtilis их более 100. Каждый из spo-генов отвечает за те или иные стадии споруляции [8, 13].
Работами многими советскими учеными, такими как А.Е. Крисс, С.И. Кузнецов [14] установлено участие спорообразующих бактерий во многих биологических процессах среды своего обитания: в водоемах, морях и океанах, включая их глубокие слои и арктические воды [15]. Широкой распространенности бактерий рода Badllus способствует их разнообразная биологическая активность - комплекс свойств, благодаря которым
они играют существенную роль в процессах круговорота веществ в природе [11] это:
- высокая приспособляемость и устойчивость к внешним воздействиям среды [15];
- существование при наличии или отсутствии воздуха;
- использование в качестве источников питания различных органических и неорганических соединений [16];
- выдерживание отсутствие влаги и воздуха [15];
- рост и развитие в значительном диапазоне температур, выдерживание резких колебании температуры, так бактерии Bacillus putrificus и Bacillus sporogenes хорошо развиваются и проявляют биохимическую активность при 10-15 С и их развитие не прекращается даже и при температуре 0-5 "С [17].
С учетом способности спорообразующих бактерий оказывать пробиотическое действие все больше разрабатываются препараты, отнесенные к поколению «самоэлиминирующихся антагонистов», которые удаляются из организма после лечения. На сегодняшний день, как за рубежом, так и в Российской Федерации создано более полусотни таких препаратов, которые полностью или частично составлены на основе спороформирующих бактерий [4, 18]. Это зарубежные препараты: Бактисубтил -Франция, Флонивин БС - Югославия, Bio-vita, Miyarisan Vita, Miyarisan-FG - Южная Корея, Glogen-8 - США, Lactipan plus - Италия, Цереобиоген - Китай [19, 20]. И российские препараты: Бактиспорин, Биоспорин, Ветом 1.1., Ветом 3.3., Споробактерин, Субалин, Субтилис, Целлобактерин, Эндобактерин [4, 19, 20].
Ряд спорообразующих бактерий Bacillus, Brevibacillus, Clostridium, Sporolacto bacillus подавляют кишечные расстройства даже в большей степени, чем классические пробиотические препараты на основе лакто- и бифидобактерий [21]. Однако спорообразующие бактерии в качестве пробиотических препаратов применяют пока значительно реже и с большими ограничениями, чем традиционные пробиотические препараты, это связано, с их родством с патогенными и токсигенными видами: Bacillus anthracis, Clostridium perfringens, Clostridium botulinum и с их чужеродностью к нормальной микрофлоре кишечника [22]. Однако в последнее время у исследователей наблюдается повышенное внимание к данным видам бактерий. С использованием этих бактерий в промышленности освоено и продолжают осваиваться производство ценных ферментов, антибиотиков, органических кислот и других соединений. Образуя единственные в своем роде покоящиеся формы организмов - споры, эти бактерии служат объектом многочисленных исследований для выяснения природы ана- и парабиотического состояния живой материи [1].
При производственном культивировании спорообразующих микроорганизмов большое значение имеют вопросы, связанные с определением критериев оценки готовности нативной культуры, т.е. когда споры, являются конечным продуктом,
особое внимание необходимо обращать на степень зрелости спор [23]. Спорообразование начинается вслед за экспоненциальной фазой роста, затем споры проходят различные фазы созревания до состояния полной зрелости. Технологический контроль процессов роста - микроскопирование мазков, окрашенных по Цилю-Нильсену, позволяет наблюдать эти переходы и определять состояние зрелости спор. Данный метод является основным экспресс-тестом при определении
продолжительности культивирования
спорообразующих бактерий. О готовности культуры можно судить, наблюдая за изменением в процессе роста культур таких показателей, как рН, оптическая плотность [24, 25] и количеством жизнеспособных клеток в нативной культуре, а также количеством терморезистентных спор.
Споры - высоко преломляющие структуры, образованные внутри вегетативных клеток [6]. Известно, что споры, в сравнении с вегетативными клетками, обладают значительной более высокой терморезистентностью и сохраняют свою жизнеспособность при температурах, значительно более высоких, чем 60°С, при которых вегетативные клетки большинства спорообразующих бактерий погибают [26, 27].
Споры аэробных бактерий обладают различной термоустойчивостью, что обусловлено как видовыми особенностями, так и условиями их образования. Установлено, что споры, образующиеся при высокой температуре, а также полученные на питательных средах с высоким содержанием кальция, парааминобензойной кислоты и некоторых жирных кислот, более жароустойчивы [28]. Споры более устойчивы, чем вегетативные клетки, от которых они образовались, к воздействию проникающей радиации, ультразвука, гидростатического давления, замораживания, разрежения. Устойчивость спор к кислотам и щелочам во многом зависит от их принадлежности к различным видам бактерий. Споры некоторых культур бактерий остаются жизнеспособными даже при кипячении в концентрированной соляной кислоте в течение 20 мин. При этом резистентность спор во много раз повышается при их обезвоживании [28].
Спорообразующие пробиотические препараты применяют и при производстве гранулированных и экспандированных кормов [29]. Некоторые штаммы спорообразующих аэробных бактерий Bacillus индуцируют в организме животных продукцию эндогенного интерферона не только при парентеральном, но и при пероральном их введении, который обладает как антивирусным, так и антибактериальным действием [19]. Включение споровых пробиотических препаратов в качестве кормов способствует повышению эффективности использованных кормов и продуктивности сельскохозяйственных животных [30].
Возможно использование спорообразующих бактерий и для создания средств защиты растений. Из аэробных спорообразующих бактерий наибольшее значение как основа биопрепаратов
против болезней растений имеет Bacillus subtilis. Бактерии Bacillus subtilis являются наиболее продуктивными из рода Bacillus по синтезу антибиотиков, которые подавляют рост фитопатогенных микроорганизмов. С каждым днем спрос на биопрепараты возрастает взамен распространенным химическим препаратам защиты растений. Так ряд российских авторов выделели разные штаммы культуры Bacillus, подавляющие фитопатогенные микроорганизмы, что привело к созданию широкого ассортимента биопрепаратов на основе Bacillus subtilis [31].
Спорообразующим бактериям принадлежит важная роль в превращениях фосфора. Культуры различных видов спороносных бактерий активно переводят нерастворимые фосфорные соединения в растворимые. Еще в Советском Союзе с применением культуры спорообразующих бактерий, активно минерализующей сложные органические соединения фосфора, было налажено промышленное производство бактериального удобрения - фосфобактерина. Этот препарат широко и успешно применялся для повышения урожайности многих сельскохозяйственных культур [28].
Способность споровых пробиотических препаратов к синтезу комплексов ферментов обусловливает возможность их культивирования с использованием растительных субстратов, и обогащением их белком, витаминами и другими биологически активными веществами [19]. Спорообразующие бактерии рода Bacillus являются и хорошими продуцентами широкого спектра липопептидных и других антибиотиков, спектр которых зависит от географического происхождения изолятов [32-34], так с помощью продуцентов бактерии Bacillus licheniformis созданы антибиотики - бацитрацин, лихениформин и протицин [35].
В.В. Смирнов с другими соавторами проанализировали механизм действия
пробиотических препаратов на основе бактерий рода Bacillus [36] и предположили, что их лечебно-профилактическая эффективность обеспечивается несколькими взаимосвязанными процессами:
- подавление роста патогенных и условно-патогенных микроорганизмов синтезом веществ, обладающих антибиотическими свойствами (антибиотики, лизоцим, пептиды с антибиотическими свойствами), снижение рН среды, высокая конкурентная способность в процессе размножения;
- нормализация пищеварения синтезом пектолитических, протеолитических ферментов, липаз;
- стимуляция неспецифической резистентности макроорганизма стимуляцией лимфоцитов, макрофагов, индукцией эндогенного а- и у-интерферонов, увеличением содержания гамма-глобулиновой фракции крови;
- антитоксическое действие дезинтеграцией высокомолекулярных белков и способностью связывать тяжелые металлы;
- антиаллергическое действие расщеплением аллергенов на биологически инертные субъединицы;
- восстановление эндогенной микрофлоры, коррекция микробиоценоза филогенетической общностью представителей нормальной симбионтной микрофлоры;
- синтез заменимых и незаменимых аминокислот и витаминов экзоцеллюлярными продукциями треонина, глутаминовой кислоты, аланина, валина,
тирозина, гистидина, орнитина;
- выведение тяжелых металлов и радионуклидов способностью к повышенной сорбции тяжелых металлов и радионуклидов в сочетании с быстрой элиминацией;
- противоопухолевая и антиметастатическая активность стимуляцией естественных киллерных клеток и т-лимфоцитов, стимуляция макрофагов.
Перечисленные эффекты применения пробиотических препаратов на основе спорообразующих бактерий обеспечивают, в целом, оздоровление организма-хозяина за счет суммирования различных видов активности [3].
Литература
1. А.И. Федоров, Жизнь растений. Просвещение, Москва, 1970. 248 с.
2. В.М. Бондаренко, А.А. Воробьев, Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии 1, 84-92, (2004).
3. Л.Ф. Бакулина, И.В. Тимофеев, Н.Г. Перминова, А.Ф. Полушкина, Н.И. Печоркина, Биотехнология 2, 48-56,
(2001).
4. В.Д. Похиленко, В.В. Перелыгин, Химическая и биологическая безопасность 2, 32-33, (2007).
5. С.С. Семенов, А.А. Былгаева, Международный научно-исследовательский журнал 36(5), 100-102, (2015).
6. М.Ю. Суслова, В.В. Парфенова, Изучение бактерий рода Bacillus: количество, распределение, видовой состав. Микроорганизмы в экосистемах озер, рек и водохранилищ. Материалы международного байкальского симпозиума по микробиологии, Иркутск, 2003. 172 с.
7. G. John, P. Holt, Bergey's manual of determinative bacteriology. Williams and Wilkins co, Baltimore, 1993. 1258 с.
8. И.И. Концевая, УО «ГГУ им. Ф. Скорины», Гомель, 2011, 126 с.
9. Л.Б. Борисов, Б.Н. Козьмин-Соколов, И.С. Фрейдлин, 3.Ф. Федорова, Медицина, Москва, 1984, 256 с.
10. В.В.Субботин, Н.В.Данилевская, Биотехнологическая фирма КОМПОНЕНТ, 1-5, (2013).
11. А.Л. Лазовская, Н.В. Гришина, З.Г. Воробьева, К.Н. Слинииа, М.А. Кульчицкая, Е.А. Васильева, Вестник Российского университета дружбы народов. Серия: Медицина 1, 18-24, (2010).
12. В.Д. Тимаков, В.С. Левашев, Л.Б. Борисов, Микробиология. Медицина, Москва, 1983. 517 с.
13. С.А. Павлович, Вышейшая школа, Минск, 2008, 799 с.
14. А.Е. Крисс, Морская микробиология. Академии наук СССР, Москва, 1959. 456 с.
15. Э.Г. Африкян, Автореферат дисс. докт. биол. наук, МГУ, Москва, 1970. 38 с.
16. А.Л. Лазовская, З.Г. Воробьева, К.Н. Слинина, Проблемы туберкулеза и болезней легких 7, 25-27, (2007).
17. И.С. Бадылькес, Холодильная техника. Госторгиздат, Москва, 1962. 543 с.
18. Л.Н. Мазанкова, Е.А. Лыкова, Детские инфекции 1, 1823, (2004).
19. Г.Г. Соколенко, Б.П. Лазарев, С.В. Миньченко, Технологии пищевой и перерабатывающей промышленности АПК - продукты здорового питания 1, 72-78, (2015).
20. А.Н. Васильев. Автореферат дисс. докт. биол. наук, Центр военно-технических проблем биологической защиты НИИ микробиологии МО РФ Институт новых технологий Российской академии медицинских наук,
Москва, 2000. 24 с.
21. H.A. Hong, L.H. Duc, S.M. Cutting, FEMS Microbiol. Rev. 29(4), 813-835, (2005).
22. И.Н. Скрыпник, А.С. Маслова, Сучасна гастроентерология 47(3), 81-90, (2009).
23. А.П. Лиморенко, дисс. канд. биол. наук, Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина, Москва, 2002. 149 с.
24. Методические указания по применению физико-химических методов контроля питательных сред: М., 1977.
25. Опытно-промышленный регламент. Биоспорин сухой / ИМВ им. Д.К. Заболотного НАН Украины,
Днепрпетровский хим-фармзавод.-1989. Арх. ГИСКа им. JI.A. Тарасевича.
26. Лабораторный регламент/ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ.-1993.-Арх. ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ-Инв. №373/3.
27. В.А. Мирзоева, АН СССР, Москва, 1959, 176 с.
28. А.В. Садунова, Мос. Университет, Москва, 1976, 307 с.
29. И.В. Червонова, Н.В. Абрамкова, Главный зоотехник 7, 3-6, (2014).
30. В.В. Смирнов, Н.К. Коваленко, В.С. Подгорский, И.Б. Сорокулова, Микробиологический журнал 64(4), 62-78, (2002).
31. М.В. Штерншис, Вестник Томского государственного университета. Биология. 18(2), 92-100, (2012).
32. N.P.J. Price, A.P. Rooney, FEMS Microbiology Letters 271, 83-89, (2007).
33. N.P. Balaban, A.M. Mardanova, L.A. Malikova, Annals Microbiology 58(4), 697-704, (2008).
34. А.А. Леляк, М.В. Штерншис, Вестник Томского государственного университета 25(1), 42-55, (2014).
35. А.В. Широков, О.Н. Логинов, А.И. Мелентьев, Г.Э. Актуганов, Прикладная биохимия и микробиология 38(2), 161-165, (2002).
36. В.В. Смирнов, С.Р. Резник, В.А Вьюницкая, Микробиологический журнал 4, 92-108, (1993).
© О. В. Федорова, магистр гр. 615-М9 каф. химической кибернетики КНИТУ; З. С. Юнусова, магистр той же кафедры; А. И. Назмиева, магистр той же кафедры; Р. Т. Валеева, канд. техн. наук доцент той же кафедры, уа1г12008@гатЫег.га.
© О-V. Fedоrоvа mаster, Depаrtment оf Chem^l СуЬегпейс8, KNRTU; Z. S. Уunusоvа mаster, Depаrtment оf Chem^l СуЬегпейс8, KNRTU; A. I. Nazmieva master, Department of Chemical Cybernetics, KNRTU; R. T. Vаleevа cаndidаte оf chem^l science, аssоciаte Prоfessоr Depаrtment оf Chem^l Cуbernetics, KNRTU, vа1rt2008@rаmb ler.ru.
