CC BY
89
ЦИТОКИНЫ
5. Cheknev S.B., Efremova I.E., Piskovskaya L.S., Mezdrokhina A.S., Yushkovets E.N., Babajanz A.A. Russiyskiy Immunologicheskiy Jurnal. 2012; 6(15), 2: 147-54 (in Russian).
6. Cheknev S.B., Efremova I.E., Piskovskaya L.S., Yushkovets E.N., Babajanz А.А. Byulleten’ Experimental’noy biologii i Klin-icheskoy Meditsiny. 2013; 154 (3): 343-5 (in Russian).
7. Cheknev S.B., Efremova I.E., Mezdrokhina A.S., Babajanz А.А. Meditsinskaya Immunologiya. 2012; 14 (6): 483-8 (in Russian).
8. Cheknev S.B., Efremova I.E., Apresova М.А., Babajanz А.А. Bulleten’ Experimental’noy biologii i Klinicheskoy Meditsiny. 2012; 154 (12): 726-9 (in Russian).
9. Winchurch R.A. Activation of thymocyte responses to interleukin-1 by zinc. Clin. Immunol. Immunopathol. 1988; 47: 174-80.
10. Mazzatti D.J., Uciechowski P., Hebel S., Engelhardt G., White A.J., Powell J.R. et al. Effects of long-term zinc supplementation and deprivation on gene expression in human THP-1 mononuclear cells. J. Trace Elem. Med. Biol. 2008; 22: 325-36.
11. Leite-de-Moraes M.C., Diem S., Michel M.-L., Ohtsu H., Thurmond R.L., Schneider E. et al. Histamine receptor H4 activation positively regulates in vivo IL-4 and IFN-y production by invariant NKT cells. J. Immunol. 2009; 182 (3): 1233-6.
12. Cope A., Le Friec G., Cardone J., Kemper C. The Th1 life cycle: molecular control of IFN-y to IL-10 switching. Trends Immunol. 2011; 32 (6): 278-86.
13. Trinchieri G. Interleukin-10 production by effector T cells: Th1 cells show self control. J. Exp. Med. 2007; 204 (2): 239-43.
14. Cyktor J.C., Turner J. Interleukin-10 and immunity against prokaryotic and eukaryotic intracellular pathogens. Infect. and Immun. 2011; 79 (8): 2964-73.
15. Liu X.S., Leerberg J., MacDonald K., Leggatt G.R., Frazer I.H. IFN-y promotes generation of IL-10 secreeting CD4+ T cells that suppress generation of CD8 responses in an antigen-experienced host. J. Immunol. 2009; 183 (1): 51-8.
16. Gallo P., Gongalves R., MosserD.M. The influence of IgG density and macrophage Fc (gamma) receptor cross-linking on phagocytosis and IL-10 production. Immunol. Letts. 2010; 133 (2): 70-7.
17. Thomas B.N., Buxbaum L.U. FcyRIII mediates immunoglobulin G-induced interleukin-10 and is required for chronic Leishmania mexicana lesions. Infect. and Immun. 2008; 76 (2): 623-31.
18. Rubino S.J., Geddes K., Girardin S.E. Innate IL-17 and IL-22
responses to enteric bacterial pathogens. Trends Immunol. 2012; 33 (3): 112-8.
19. Axtell R.C., Raman C., Steinman L. Interferon-P exacerbates Th17-mediated inflammatory disease. Trends Immunol. 2011; 32
(6) : 272-7.
20. Zielinski C.E., Mele F., Aschenbrenner D., Jarrossay D., Ronchi
F. , Gattorno M. et al. Pathogen-induced human TH17 cells produce IFN-y or IL-10 and are regulated by IL-1p. Nature. 2012; 484: 514-51.
21. Ruth J.H., Park C.C., Amin M.A., Lesch C., Marotte H., Shah-rara S. et al. Interleukin-18 as an in vivo mediator of monocyte recruitment in rodent models of rheumatoid arthritis. Arthr. Res. and Ther. 2010; 12 (3): R118.
22. Pitt J.M., Stavropoulos E., Redford P.S., Beebe A.M., Bancroft
G. J., Young D.B. et al. Blockade of IL-10 signaling during Bacillus Calmette-Guerin vaccination enhances and sustains Th1, Th17 and innate lymphoid IFN-y and IL-17 responses and increases protection to Mycobacterium tuberculosis infection. J. Immunol. 2012; 189 (8): 4079-87.
23. Hunter C.A. New IL-12-family members: IL-23 and IL-27, cytokines with divergent functions. Nature. Rev. Immunol. 2005; 5
(7) : 521-31.
24. Kidd P Th1/Th2 balance: the hypothesis, its limitations, and implications for health and disease. Altern. Med. Rev. 2003; 8 (3): 223-46.
25. Long K.Z., Nanthakumar N. Energetic and nutritional regulation of the adaptive immune response and trade-offs in ecological immunology. Am. J. Hum. Biol. 2004; 16: 499-507.
26. Cairo G., Recalcati S., Mantovani A., Locati M. Iron trafficking and metabolism in macrophages: contribution to the polarized phenotype. Trends Immunol. 2011; 32 (6): 241-47.
27. Darrah P.A., Hegde S.T., Patel D.T., Lindsay R.W.B., Chen L., Roederer M. et al. IL-10 production differentially influences the magnitude, quality, and protective capacity of Th1 responses depending on the vaccine platform. J. Exp. Med. 2010; 207 (7): 1421-33.
28. Maglione P.J., Xu J., CasadevallA., Chan J. Fcy receptors regulate immune activation and susceptibility during Mycobacterium tuberculosis infection. J. Immunol. 2008; 180 (5): 3329-38.
Поступила 06.02.13
ЦИТОКИНЫ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013 УДК 618.2-092:612.017.1]-078.33
И. А. Газиева, Г Н. Чистякова, И. И. Ремизова, М. Н. Тарасова
СПОНТАННАЯ И МИТОГЕНИНДУЦИРОВАННАЯ ПРОДУКЦИЯ ЦИТОКИНОВ В
ранние сроки беременности в зависимости ОТ ее исходов
Отделение иммунологии и микробиологии ФГБУ Уральский НИИ охраны материнства и младенчества Мин-здравсоцразвития России (620028, г. Екатеринбург, ул. Репина, д. 1)
Проведена оценка спонтанной и митогениндуцированной продукции цитокинов клетками цельной крови в ранние сроки беременности в зависимости от ее исходов. Установлено, что патологически протекающая беременность ассоциируется с избыточной митогениндуцированной продукцией интерферона (IFN)-y. С повышением степени тяжести осложнений гестации в патологический процесс вовлекается все большее количество нарушений на уровне продукции отдельных цитокинов. Наиболее значимые нарушения фетопротективных механизмов имеют место в ранние сроки беременности, закончившейся спонтанным выкидышем: снижение спонтанной продукции интерлейкина (IL)-2, IL-8, фактора некроза опухоли а и IL-10 и усиление индуцированного синтеза IL-2, IL-8 и IFN-y. Как снижение, так и повышение способности иммунокомпетентных клеток синтезировать цитокины могут отражать нарушение иммунологической регуляции, обусловливающее в дальнейшем развитие осложнений.
Ключевые слова: цитокины, беременность, выкидыш
- 193 -
ИММУНОЛОГИЯ № 4, 2013
I.A.Gazieva, G.N.Chistyakova, I.I.Remizova., M.N.Tarasova
SPONTANEOUS AND MITOGENINDUCTIBLE PRODUCTION OF CYTOKINES IN EARLY PREGNANCY DEPENDING ON ITS OUTCOME
The estimation of spontaneous and mitogeninductible production of cytokines by whole blood cells in the early stages of pregnancy, depending on its outcome. It is established, that pathologically flowing pregnancy is associated with excess mitogeninductible production of interferon (IFN)-y. With the increase of the degree of severity of the complications of gestation in the pathological process involved a growing number of violations at the level of production of certain cytokines. The most significant violations of phetoprotective mechanisms are in place in early terms of pregnancy ended in a spontaneous miscarriage: a reduction of the spontaneous production of interleukin (IL) -2, IL-8 and tumor necrosis factor a and IL-10 and the strengthening of the induced synthesis of IL-2, IL-8, IFN-y. As the decline, and to improve the ability of immunocompetent cells synthesize cytokines may reflect a violation of immune regulation, resulting in further development of complications.
Key words: cytokines, pregnancy, miscarriage
Понимание тонких механизмов регуляции, обусловливающих успешное прогрессирование беременности, и роли факторов, которые запускают в ряде случаев необратимые события, связанные с репродуктивными потерями, в настоящее время невозможно без комплексных мультидисциплинарных исследований и современного лабораторного инструментария. Согласно сложившимся представлениям, этапы имплантации, плацентации и развития эмбриона/пло-да являются цитокинзависимыми процессами и контролируются иммунной системой [5, 7]. В последние годы в научных исследованиях проводятся параллели между различными патологическими состояниями, обусловливающими формирование перинатальной патологии, и синдромом системного воспалительного ответа [3, 10, 12]. Беременность представляет собой особое состояние, при котором воздействие дополнительных, нередко и физиологических, стимулов может спровоцировать чрезмерную активацию клеток, опосредующих поддержание определенного баланса растворимых регуляторных факторов. В свою очередь воспалительные изменения в организме ведут к ослаблению барьерных функций эпителия слизистых оболочек и транслокации микроорганизмов из традиционных биотопов в стерильные ткани, а также активации условно-патогенных микроорганизмов с развитием инфекций урогенитального тракта и дисбиотических процессов во влагалище. Кроме того, поскольку процессы воспаления и коагуляции являются звеньями одной цепи, в результате неконтролируемой продукции провоспалительных цитокинов (интерлейкин (IL)-ip, IL-2, IL-6, фактор некроза опухоли а (TNF-а)) происходит активация процессов коагуляции. Системная коагулопатия, являющаяся неотъемлемой частью воспалительного ответа, также может нарушить процессы имплантации и привести в дальнейшем к развитию плацентарной недостаточности или прерыванию беременности [8, 13].
Цитокины, являющиеся продуктами активированных клеток иммунной системы, осуществляют регуляцию межклеточных взаимодействий в ходе развития иммунного ответа. Однако оценка концентрации цитокинов в сыворотке крови на доклинической стадии патологического процесса не всегда бывает информативной, поскольку нарушение локальных процессов взаимодействия в системе мать-плацента-плод в ряде случаев не сопровождается системной цитокинемией. Образование и высвобождение этих биологически активных молекул строго контролируются включением механизмов down-регуляции, после выхода цитокинов в циркуляцию они связываются со специфическими рецепторами на мембране клеток-мишеней, запуская реакцию изменения активности регулируемых ими генов.
В связи с этими особенностями биосинтеза и регуляции IL они не всегда присутствуют в циркуляции в достаточном для определения количестве. Кроме того, уровень цитокинов
Газиева Ирина Александровна - канд. биол. наук, ст. науч. сотр., тел. 8(343)371-52-74, e-mail: uchsek@niiomm.ru
в кровеносном русле отражает текущее функциональное состояние иммунной системы в целом, тогда как в ситуациях, сопряженных с действием неблагоприятных факторов или нарушением фетопротекторных механизмов, необходимо оценить способность клеток - непосредственных участников и эффекторов иммунного ответа - к секреции регуляторных пептидов. Определение продукции цитокинов клетками цельной крови позволяет охарактеризовать секреторную активность иммуноцитов и выявить дефекты биосинтеза ряда основных медиаторов межклеточного взаимодействия. При этом спонтанная продукция цитокинов иммунокомпетентным клетками свидетельствует о том, насколько эти клетки активированы in vivo, а митогениндуцированная позволяет оценить потенциальную способность клеток к выработке сигнальных молекул в ответ на дополнительный стимул, иными словами, выявить функциональный резерв иммунной системы, что важно для оценки иммунологической реактивности. Использование цельной крови упрощает проведение анализа и устраняет вероятность нежелательной активации или гибели мононуклеаров. К тому же культивирование происходит в условиях естественного микроокружения, при сохранении баланса всех гуморальных факторов, действующих in vivo [6].
Цель данной работы состоит в оценке спонтанной и ми-тогениндуцированной продукции цитокинов в ранние сроки беременности в зависимости от ее исходов.
Материалы и методы. Проведено иммунологическое обследование 64 женщин, наблюдавшихся в клиникодиагностическом отделении ФГБУ Уральский НИИ Минз-дравсоцразвития России с I триместра беременности (4-12 нед). В 1-ю группу вошли 20 женщин, беременность которых протекала впоследствии на фоне компенсированной плацентарной недостаточности (ПН) и закончилась срочными родами, во 2-ю - 15 женщин, беременность которых впоследствии осложнилась задержкой внутриутробного роста плода (ЗВРП) с исходом в преждевременные роды в сроки 32-37 нед, в 3-ю - 11 женщин, беременность которых закончилась самопроизвольным выкидышем в сроки 10-20 нед. Наличие ПН констатировали на основании данных комплексного динамического наблюдения, основными критериями при постановке диагноза являлись изменение толщины и структуры плаценты, количества и качества околоплодных вод, снижение фето- и маточно-плацентарного кровотока по показателям допплерометрии. Группу сравнения составили 18 женщин с неосложненным течением гестации, родивших здоровых доношенных детей. Группы не различались по возрасту и паритету. Информированное согласие на использование биологического материала было получено у всех беременных женщин, проведение исследования одобрено локальным этическим комитетом.
Для оценки спонтанной и митогениндуцированной продукции цитокинов клетками цельной крови ex vivo использовали набор реагентов «ЦИТОКИН-СТИМУЛ-БЕСТ». Цельную кровь после забора в асептических условиях из кубитальной вены добавляли во флакон (№ 1) со стериль-
- 194 -
ЦИТОКИНЫ
ной питательной средой DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium), содержащей 2,5 Ед/мл гепарина и 100 мкг/мл гентамицина, для разбавления в соотношении 1:4. Для митогенной активации клеток крови 1 мл разбавленной крови из флакона № 1 переносили во флакон № 2 со стерильным митогеном (4 мкг фитогемагглютинина, 4 мкг конканавалина A и 2 мкг липополисахарида). Оба флакона инкубировали при температуре 37°С в сутки, в течение 1-го часа тщательно перемешивали переворачиванием (3 раза через каждые 20 мин). После окончания инкубации образцы переносили в микроцентрифужные пробирки и осаждали клетки центрифугированием при 10 000 g в течение 3 мин. Отбирали надосадоч-ную жидкость, аликвотировали и замораживали при -20°С до проведения анализа. Полученные супернатанты использовали для определения спонтанной (флакон № 1) и митогенин-дуцированной (флакон № 2) продукции цитокинов методом иммуноферментного анализа с помощью тест-систем Bender Medsystems (Австрия) и Invitrogen (США) в соответствии с рекомендациями фирм-производителей.
Статистическую обработку полученных результатов осу-
ществляли с помощью стандартных методов описательной статистики с использованием программ Microsoft Excel (2007) и Statistica 6.0 («StatSoft», США). Проверку гипотезы о соответствии совокупности количественных признаков закону нормального распределения проводили с использованием критерия Шапиро-Уилкса. Поскольку в ряде случаев нулевую гипотезу о соответствии распределения признака закону нормального распределения отвергали и принимали альтернативную, данные представляли в виде медианы (Me) и нижнего и верхнего квартилей (25-го и 75-го процентилей, LQ и UQ). Статистические гипотезы об отсутствии межгрупповых различий проверяли с помощью непараметрического ^-критерия Манна-Уитни. Критический уровень значимости различий р, при котором нулевую гипотезу об отсутствии различий отвергали и принимали альтернативную, был равен 0,05.
Результаты и обсуждение. При оценке цито-кинового профиля в ранние сроки гестации в зависимости от исхода беременности установили тенденцию к снижению спонтанной продукции ГЬ-ф иммунокомпетентными клетками во всех трех группах, при этом наиболее низкие показате-
Показатели спонтанной и митогениндуцированной продукции цитокинов в I триместре беременности в зависимости от ее исходов, Me (LQ-uQ)
Пока- затель, пг/мл Продукция цитокинов Беременные женщины (п = 64)
физиологическая беременность (п = 18) беременность, осложненная компенсированной ПН (п = 20) беременность, осложненная ЗВРП (п = 15) беременность, закончившаяся выкидышами (п = 11)
IL-1P Спонтанная 62,24 (36,32-108,1) 24,87 (11,1-55,31) 11,15 (10,24-52,72) 30,21 (21,55-40,39)
Индуцированная 208,03 (42,69-287,01) 1439 (643,23-1799)** 52,58 (15,18-206,24) 627 (313,5-1027,5)
КС 2,05 20,0* 5,14 8,17
IL-1Ra Спонтанная 930,4 (572,25-1140,2) 262,4 (182,7-381,1) 295,7 (206,85-404,3) 470,9 (321,15-795,45)
Индуцированная 1782 (1662,5-1872) 1878 (1445-1938)* 1855(1821-1880)* 1780 (1741-1866,5)
КС 2,14 6,1* 6,27* 3,78
IL-2 Спонтанная 16,32 (13,23-17,74) 11,69 (10,12-13,52)* 13,58 (12,39-17,79) 11,95 (11,51-12,96)*
Индуцированная 39,8 (20,95-67,96) 61,135 (27,93-96,15) 23,0 (20,35-27,8) 150,73 (49,74-347,28)*
КС 2,07 4,72 1,86 13,45*
IL-4 Спонтанная 5,4 (0-8,13) 0,12 (0-6,95) 9,48 (5,4-13,6) 3,64 (0-7,5)
Индуцированная 8,73 (5,01-12,31) 9,88 (8,73-18,14) 10,8 (7,46-21,1) 14,854 (11,4-23,6)
КС 1,18 1,84 0,79 1,36
IL-6 Спонтанная 312,0 (83,23-1078,45) 183,68 (16,79-919,25) 53,3 (37,08-1357) 133,96 (42,4-412,69)
Индуцированная 4822,5 (114,09-17 505) 15882,5 (9665,34-24 250) 8092,5 (118,5-24072,5) 19405 (7432,4-33 811,7)
КС 13,3 5,51 5,44 5,28
IL-8 Спонтанная 630 (489,78-3201,5) 812,5 (316,14-4192,38) 1254,5 (300,35-6665) 3672,75 (1593,18-6107,5)*
Индуцированная 16 195 (3161,5-39 576,3) 16 300 (2336,75-44 871,3) 21 560,5 (1986-43 012,5 34 855 (18 508,3-68 677,5)*
КС 8,84 1,82 6,17 12,84*
IL-10 Спонтанная 5,95 (1,1-27,95) 2,39 (0-6,05) 4,75 (0,16-5,78) 2,24* (0,07-4,5)*
Индуцированная 481,8 (228,46-668,55) 378,2 (291,53-464,0) 521,57 (430,55-614,3) 464,0 (410,6-470,4)
КС 43,61 43,05 74,39 88,92
TNF-a Спонтанная 26,46 (10,67-57,7) 15,24 (0,05-40,56) 1,82 (0,26-4,42)* 2,51 (0,54-8,403)*
Индуцированная 1186 (1032,35-1428,2) 1369 (1095,5-1446,2) 1035 (970,9-1334) 1243,5 (1145,9-1318,25)
КС 42,42 77,26 484,06* 304,37*
ifn-y Спонтанная 0,0 (0-0,05) 0,01 (0-0,03) 0 (0-0,1) 0,02 (0-0,04)
Индуцированная 164,36 (79,72-198,74) 227,2 (201,15-241,5)* 244 (223,05-250,75)* 233,8 (224,85-240,15)*
КС 2020,79 6578,13 1498,06 5234,38
Примечание. * - р < 0,05; ** - р < 0,01 по сравнению с показателями у здоровых беременных женщин; КС - коэффициент стимуляции.
- 195 -
ИММУНОЛОГИЯ № 4, 2013
ли выработки данного провоспалительного цитокина выявили у женщин, беременность которых осложнилась во второй половине ЗВРП (см. таблицу). Митогениндуцированный синтез IL-ip также был самым низким у данных женщин. В то же время при беременности, протекавшей впоследствии на фоне компенсированной ПН, индуцированная продукция IL-ip оказалась значительно выше, чем в группе сравнения, коэффициент стимуляции, рассчитанный как отношение уровня стимулированной продукции цитокина к спонтанной, также статистически значимо превышал аналогичный показатель при физиологической беременности.
При определении продукции рецепторного антагониста IL-1 (IL-1Ra) установили, что его спонтанная выработка несколько снижена во всех трех группах, минимальный уровень наблюдали при беременности, осложнившейся впоследствии ПН - как ее компенсированной формой, так и с исходом в ЗВРП. Способность к индуцированной продукции IL-1Ra, а также коэффициент стимуляции оказались статистически значимо выше в этих же группах. Роль IL-1Ra заключается в регулировании эффектов IL-ip в клеточном микроокружении, механизм его действия основан на конкуренции с этим провоспалительным цитокином за связывание с клеточным рецептором без передачи сигнала внутрь клетки. Активация выработки IL-1Ra в ответ на усиление продукции IL-ip, как это наблюдали при беременности, протекавшей впоследствии на фоне компенсированной ПН, свидетельствует о сохранении баланса цитокина, играющего ключевую роль в воспалительном ответе, и регулятора его биологического эффекта. В то же время при ПН с исходом в ЗВРП стимуляция иммунокомпетентных клеток митогеном приводит к сниженной продукции IL-ip на фоне повышенной выработки IL-1Ra. В этом случае имеет место нарушение баланса IL-ip/IL-iRa в ответ на действие активирующих иммунную систему факторов, что может вызывать нарушение иммунологической регуляции уже с ранних сроков беременности.
Кроме того, ряд провоспалительных цитокинов, в том числе и IL-ip, являются ангиогенными факторами, необходимыми для успешного прогрессирования беременности и формирования полноценной васкуляризации плаценты в соответствии с возрастающими потребностями эмбриона/ плода. В то же время в ряде исследований установлено, что концентрация IL-iRa коррелирует со степенью гемодинамических нарушений при сердечно-сосудистой патологии [9, i4]. Увеличение синтеза IL-iRa, обусловливающее блокирование передачи сигнала IL-i посредством конкурентного связывания с клеточным рецептором, может сдерживать развитие гемодинамической системы фетоплацентарного комплекса, обеспечивающей доставку питательных веществ и кислорода, и в итоге способствовать задержке роста плода. Необходимо отметить, что при беременности, завершившейся репродуктивной потерей, индуцированная продукция IL-ip существенно, хотя и без достоверных отличий, превосходила таковую при неосложненной беременности, однако выраженность митогенного ответа в отношении IL-iRa оставалась практически на уровне показателя в группе сравнения, что также может служить ранним индикатором последующих осложнений гестационного процесса.
Спонтанная продукция клетками цельной крови IL-2 у женщин, беременность которых протекала на фоне компенсированной ПН, а также закончилась спонтанным выкидышем, была статистически значимо снижена по сравнению с данным показателем при неосложненной беременности. Основными эндогенными продуцентами IL-2 являются активированные T-лимфоциты; IL-2 запускает иммунный ответ и активирует факторы, участвующие в противоинфекционной защите, играет ключевую роль в апоптозе CD4+-клеток в ответ на антигенную рестимуляцию, что способствует элиминации аутореактивных T-клеток, дающих неблагоприятный эффект в отношении сохранения беременности. Нарушения, связанные с продукцией IL-2, могут приводить как к сни-
жению пролиферации T-лимфоцитов, так и к увеличению численности аутореактивных клонов, обусловливающих развитие клеточно-опосредованных реакций материнского организма в отношении плода. Результаты проведенных исследований показали, что митогениндуцированная продукция IL-2, а также коэффициент стимуляции при беременности, закончившейся выкидышем, были значительно выше аналогичных показателей в группе сравнения. Логично предположить, что при действии любого стрессового фактора во время беременности в этой группе женщин может иметь место гиперактивация T-лимфоцитов, определяющая усиленное высвобождение IL-2. Этот ростовой фактор T-клеток в свою очередь обладает способностью стимулировать пролиферацию и активацию натуральных киллеров и цитотоксических лимфоцитов, повышать цитолитическую функцию T-киллеров и NK-клеток, увеличивая продукцию ими перфоринов и интерферона (IFN)-y, а также активировать моноцитарно-макрофагальное звено с последующей стимуляцией выработки TNF-a, IL-ip, IL-8 и колониестимулирующих факторов, оказывающих провоспалительное действие. Таким образом, гиперпродукция IL-2 может являться одним из ключевых факторов, опосредующих включение иммунологических механизмов отторжения плода.
Клеточная продукция IL-4 вне стимуляции в зависимости от исходов беременности была разнонаправленной: несколько сниженной в i-й и 3-й группах и обнаруживающей тенденцию к повышению при беременности, осложнившейся во второй половине ЗВРП. В то же время индуцированный синтез данного гликопротеина был незначительно повышен во всех трех группах, максимальная продукция IL-4 установлена у женщин с репродуктивными потерями.
Показатели спонтанной выработки IL-6, одного из основных регуляторов иммунного и острофазного ответа, во всех трех группах обнаруживали тенденцию к снижению, наиболее выраженному при беременности, которая протекала с синдромом ЗВРП. Стимуляция клеток митогенным комплексом приводила к некоторому повышению синтеза IL-6 вне зависимости от исхода беременности, максимальную выработку данного гликопротеина зарегистрировали при беременности, закончившейся спонтанным выкидышем. Особенности как спонтанной, так и индуцированной продукции IL-6 в зависимости от исхода беременности оказались сходными с особенностями выработки IL-i (снижение спонтанной продукции и повышение митогенстимулированной), за исключением индуцированного синтеза этих цитокинов при беременности, осложнившейся впоследствии ЗВРП. Это подтверждает регулирующую роль IL-6, выработка которого повышается вслед за усилением продукции классических цитокинов, запускающих каскад провоспалительных реакций, ингибируя посредством механизмов down-регуляции транскрипцию генов ключевых медиаторов воспаления.
При сопоставлении показателей продукции IL-8 установили их повышение во всех трех группах как вне активации, так и в условиях стимуляции митогеном, статистически значимые отличия выявили при беременности с исходом в спонтанный выкидыш. IL-8 является мощным хемотаксическим и активирующим фактором для лейкоцитов и синтезируется многими клетками в ответ на различные стимулы, в том числе провоспалительные цитокины IL-ip и TNF-a. Наряду с другими цитокинами данный хемокин участвует в процессах стимуляции и дегрануляции лейкоцитов, способствует миграции фагоцитов в очаг воспаления и вызывает синтез молекул адгезии и других продуктов клеточной активации. Есть основания полагать, что активация клеток иммунной системы беременной женщины под действием дополнительных физиологических или патологических стимулов (например, при активации условно-патогенной флоры либо вирусной инфекции, присоединении респираторной инфекции и т. п.) может приводить к избыточному синтезу провоспалительных соединений, оказывающих хемоаттрактивное действие,
- 196 -
ЦИТОКИНЫ
что способствует поддержанию активированного состояния иммунокомпетентных клеток и провоспалительной трансформации микроциркуляции в целом. Гиперпродукция IL-8 при ее выявлении в ранние сроки беременности, закончившейся спонтанным выкидышем, является прогностическим индикатором нарушения иммунологической регуляции, которое может реализоваться как в формировании экстремальных условий существования плода (задержка роста), так и в запуске механизмов отторжения в наиболее уязвимые периоды его развития.
Продукция одного из ключевых регуляторов иммунного ответа IL-10 вне стимуляции во всех трех группах была несколько сниженной, наиболее низкие значения зарегистрировали при беременности, протекавшей впоследствии на фоне ПН, и в группе с репродуктивными потерями. При беременности, закончившейся спонтанным выкидышем, снижение спонтанного уровня IL-10 оказалось статистически значимым. В то же время показатели митогениндуциро-ванной выработки данного цитокина в трех группах оставались на уровне таковых в группе сравнения. IL-10 отличается мощным противовоспалительным, иммуномодулирующим действием, ему принадлежит основная роль в подавлении избыточной продукции провоспалительных медиаторов межклеточного взаимодействия активированными макрофагами и Thl-клетками. В связи с этим сниженная продукция толерогенной молекулы IL-10 in vivo может снижать эффективность фетопротекторных механизмов, направленных на защиту плода от фетодеструктивных факторов материнского организма при гиперактивации клеток ее иммунной системы, и приводить к необратимым последствиям.
Спонтанная продукция одного из классических провоспалительных цитокинов TNF-a при беременности с исходом в ЗВРП и спонтанный выкидыш была существенно сниженной (в обоих случаях выявили статистически значимые различия). Показатели митогениндуцированного ответа иммунокомпетентных клеток во всех трех группах были на уровне таковых в группе сравнения, в связи с чем коэффициенты стимуляции при беременности, осложнившейся впоследствии ЗВРП или закончившейся спонтанным выкидышем, оказались статистически значимо повышены. Особенности спонтанной продукции данного цитокина в зависимости от исходов беременности обнаруживали определенное сходство с особенностями выработки IL-1 и IL-6, однако снижение уровня TNF-a во 2-й и 3-й группах было более выраженным, чем снижение содержания вышеуказанных провоспалительных цитокинов. Выявленные изменения могут свидетельствовать о сниженной функциональной активности моноцитарно-макрофагального звена в ранние сроки беременности, протекавшей впоследствии с серьезными осложнениями или закончившейся спонтанным выкидышем. Кроме того, TNF-a является проангиогенным фактором, поскольку воспалительные процессы тесно связаны с ангиогенезом, и его изначально сниженная продукция, по-видимому, вносит свой вклад в нарушение васкуляризации ворсин хориона, что обусловливает в дальнейшем отставание плода в развитии и в ряде случаев его гибель.
При определении концентрации IFN-y в клеточных супернатантах вне стимуляции выявили низкие значения этого гликопротеина во всех группах. В то же время обращал внимание тот факт, что митогениндуцированная продукция IFN-y была значительно выше, чем в группе сравнения, вне зависимости от исхода беременности. Благодаря широкому спектру биологических эффектов на различные клетки IFN-y играет центральную роль в развитии врожденного и адаптивного иммунного ответа. Одной из концепций, описывающих изменения регуляторных процессов во время беременности, является гипотеза о переключении иммунного ответа, опосредованного T-хелперами 1-го порядка, на иммунный ответ, опосредованный T-хелперами 2-го порядка. IFN-y, продуцируемый T-лимфоцитами, NK-клетками и макрофагами,
способствует дифференцировке Th0 в Th1 и препятствует формированию №2-фенотипа. По данным литературы, IFN-y является ингибитором ангиогенеза, угнетая секрецию факторов, необходимых для роста и дифференцировки трофобласта [1, 2]. Высокая концентрация IFN-y инициирует агрегацию тромбоцитов, активируя продукцию тромбоксанов и повышая риск развития тромботических осложнений. Усиленная индуцированная продукция IFN при патологически протекающей беременности на фоне отсутствия выраженных изменений стимулированного синтеза регуляторных IL-4 и IL-10 свидетельствует об активации материнских Th1, опосредующих наиболее опасный для плода клеточный иммунный ответ, и повышает коагуляционный потенциал крови, который в свою очередь способствует реализации акушерских осложнений или прерыванию беременности.
Из приведенных данных следует, что нарушение синтеза продуктов активации иммунокомпетентных клеток играет одну из ключевых ролей в развитии иммунопатологических состояний. В связи с этим большое значение имеет не только оценка уровня цитокинов в сыворотке крови, но и непосредственное тестирование клеток-эффекторов иммунного ответа на способность к выработке регуляторных пептидов. Оценка клеточного потенциала в отношении полноценности синтеза цитокинов позволяет охарактеризовать функциональный резерв иммунной системы и смоделировать влияние на организм беременной женщины различных неблагоприятных факторов как инфекционной, так и неинфекционной природы.
Результаты проведенных исследований показали, что с повышением степени тяжести осложнений гестации в патологический процесс уже с ранних сроков беременности вовлекается все большее количество нарушений на уровне продукции отдельных цитокинов. Как снижение, так и повышение способности иммунокомпетентных клеток синтезировать цитокины могут отражать нарушение иммунологической регуляции, обусловливающее в дальнейшем развитие патологических состояний. Активация клеток врожденного иммунитета является неотъемлемой частью важнейших гестационных событий, поскольку эти клетки являются основными продуцентами цитокинов, не только оказывающих цитотоксическое действие, но и активирующих процессы ангиогенеза (IL-ф, IFN-y, IL-6 и IL-8). Сниженная базальная продукция этих медиаторов ассоциируется с нарушениями развития сосудистой сети и формирования плаценты, которое является универсальным пусковым механизмом для большинства отклонений в нормальном течении гестации [4, 7]. Обобщая полученные данные, можно констатировать, что патогенез ПН - от компенсированной ее формы до декомпенсированной с исходом в прерывание беременности - связан с индуцированным Thl-зависимым иммунным ответом, сопровождающимся гиперпродукцией провоспалительных медиаторов. Ранние сроки беременности вне зависимости от изученных исходов характеризуются повышенным синтезом IFN-y, который обладает выраженными ангиостатическими свойствами и оказывает как прямое, так и опосредованное неблагоприятное воздействие на плод. В физиологических условиях усиленная выработка IFN-y регулируется цитокинами, продуцируемыми №2-лимфоцитами, главным образом IL-10. В случае нарушения баланса между клетками этих двух типов чрезмерная выработка IFN с участием факторов врожденного звена иммунитета может приводить не только к формированию перинатальной патологии, но и к репродуктивным потерям.
Наиболее значимые нарушения фетопротективных механизмов имеют место в ранние сроки беременности, закончившейся спонтанным выкидышем: снижение спонтанной продукции факторов, оказывающих наряду с провоспалительным ангиогенное действие (IL-2, IL-8 и IFN-a), а также регуляторного IL-10 и усиление индуцированного синтеза IFN-y, сопровождающееся гиперпродукцией провоспалительных IL-2 и
- 197 -
ИММУНОЛОГИЯ № 4, 2013
IL-8. Нарушенная цитокинпродуцирующая активность иммунокомпетентных клеток может играть ключевую роль в гиперактивации эндотелия, которая обусловливает тромботические осложнения, реализующиеся в прерывание беременности. В связи с этим перспективным направлением исследований является изучение иммунологической реактивности ex vivo при беременности, протекающей на фоне генетической предрасположенности к тромбофилии или индуцированной вспомогательными репродуктивными технологиями, с целью выявления наиболее ранних предикторов возможных осложнений.
ЛИТЕРАТУРА
1. Амчиславский Е. И., Соколов Д. И., Старикова Э. А., Фрейд-лин И. С. Цитокиновый контроль процесса ангиогенеза // Мед. иммунол. - 2003. - Т. 5, № 5-6. - С. 493-506.
2. Бурлев В. А., Дубинская Е. Д., Ильясова Н. А. Антиангиогенная терапия в гинекологии: настоящее и будущее // Пробл. репрод. - 2005. - № 6. - С. 14-20.
3. Гусев Е. Ю., Черешнев В. А., Юрченко Л. Н. Системное воспаление с позиции теории типового патологического процесса // Цитокины и воспаление. - 2007. - Т. 6, № 4. - С. 9-21.
4. Орлов В. И., Авруцкая В. В., Крымшокалова З. С., Крукиер И. И. Продукция факторов роста и вазоактивных веществ при синдроме задержки роста плода // Журн. акуш. и жен. бол. -2008. - Т 57, вып. 2. - С. 84-89.
5. Павлов О. В., Сельков С. А. Продукция IL-10 и IL-11 in vitro как проявление «альтернативной активации» макрофагов плаценты // Иммунология. - 2011. - № 6. - С. 301-306.
6. Рыжикова С. Л., Дружинина Ю. Г., Рябичева Т. Г., Вараксин
Н. А. Стандартизация методики определения продукции цитокинов клетками крови ex vivo // Клин. лаб. диагн. - 2011.
- № 11. - С. 49-53.
7. Сароян Т. Т., Корнеева И. Е. Тактика ведения индуцированной беременности, наступившей на фоне тяжелого течения синдрома гиперстимуляции яичников // Акуш. и гин. - 2011.
- № 8. - С. 107-111.
8. Сухих Г. Т., Вихляева Е. М., Ванько Л. В. и др. Эндотелиальная дисфункция в генезе перинатальной патологии // Акуш. и гин. - 2008. - № 5. - С. 3-7.
9. Bujak M., Frangogiannis N. G. The role of Interleukin-1 in the pathogenesis of heart disease // Arch. Immunol. Ther. Exp. (War-sz.). - 2009. - Vol. 57, N 3. - P. 165-176.
10. Christiansen O. B., Nielsen H. S., Kolte A. M. Inflammation and miscarriage // Semin. Fetal Neonatal Med. - 2006. - Vol. 11, N 5. - P. 302-308.
11. DemirR., Seval Y., HuppertzB. Vasculogenesis and angiogenesis in the early human placenta // Acta Histochem. - 2007. - Vol. 109. - P. 257-265.
12. Smith G. C. First-trimester determination of complications of late pregnancy // J.A.M.A. - 2010. - Vol. 303, N 6. - P. 561-562.
13. WangX., Athayde N., Trudinger B. A proinflammatory cytokine response is present in the fetal placental vasculature in placental insufficiency // Am. J. Obstetr. Gynecol. - 2003. - Vol. 189, N 5. - P. 1445-1451.
14. Westphal E., Rohrbach S., Buerke M. et al. Altered interleukin-1 receptor antagonist and interleukin-18 mRNA expression in myocardial tissues of patients with dilatated cardiomyopathy // Mol. Med. - 2008. - Vol. 14, N 1-2. - P. 55-63.
Поступила 29.03.12
ИММУНООНКОЛОГИЯ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013 УДК 615.373.03:616-006.441.04].076.9
И.В. Холоденко, И.И. Доронин, П.А. Вишнякова, Е.Л. Болховитина, И.М. Молотковская,
Р.В. Холоденко
ПРОТИВООПУХОЛЕВАЯ АКТИВНОСТЬ GD2-CПЕЦИФИЧHЫХ АНТИТЕЛ И ИХ FAB-ФРАГМЕНТОВ В МЫШИнОЙ МОЦЕлИ РАКА
ФГБУН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997, г. Москва
Ранее нами было показано эффективное цитотоксическое действие антител (АТ), специфичных к опухолеассоциированному ганглиозиду GD2, на клетках мышиной лимфомы EL-4 [1]. Подобные цитотоксические эффекты обусловлены прямым взаимодействием АТ с опухолеспецифичным антигеном и запуском программы гибели раковых клеток. Fab-фрагменты GD2-специфичных АТ сохраняют в модели in vitro цитотоксические свойства [2]. Данные результаты открывают перспективный подход использования фрагментов антител в терапии GD2-позитивных опухолей, поскольку Fc-фрагменты полноразмерных АТ вызывают ряд нежелательных побочных эффектов при их использовании в противоопухолевой терапии. В связи с этим представлялось важным в модели in vivo определить вклад прямого цитотоксического действия в общие противоопухолевые эффекты GD2-специфичных АТ и оценить перспективность их Fab-фрагментов использования в терапии GD2-позитивных опухолей. Для этого нами была создана мышиная модель перевиваемой опухоли, на которой мы показали, что GD2-специфичные АТ и их Fab-фрагменты дают заметные противоопухолеве эффекты. Однако в зависимости от стадии развития опухоли эффективность действия АТ и их фрагментов различается. В случае сформированной метастазирующей GD2-позитивной опухоли Fab-фрагменты в отличие от полноразмерных АТ не способны полностью элиминировать опухоль, они только замедляют ее рост. Таким образом, использование Fab-фрагментов является перспективным, но требует улучшения их противоопухолевых свойств, возможно, за счет увеличения времени полужизни в организме и повышения аффинности путем создания рекомбинантных форм.
Ключевые слова: GD2-сnецuфuчные антитела, Fab-фрагменты, лимфома EL-4, перевиваемая опухоль, противоопухолевая терапия
- 198 -
