CC BY
122
материалы конференции «отечественные противоопухолевые препараты»
51
М.Е. Неганова, А.В. Семаков, Е.Ф. Шевцова, С.Г. Клочков СИНТЕЗ И ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ АНАЛОГОВ ПРИРОДНЫХ АЛАНТОЛАКТОНОВ С ТРАНСФОРМИРОВАННЫМ УГЛЕРОДНЫМ СКЕЛЕТОМ С ЦЕЛЬЮ ПОИСКА ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ АГЕНТОВ ФГБУНИФАВ РАН, Черноголовка, Московская область, Россия
Введение. По данным ВОЗ, с каждым годом увеличивается смертность от онкологических заболеваний. Сложность подбора способов адекватного лечения в данном случае определяется большим разнообразием патогенеза и этиологии опухолей, их развитием и симптоматикой. Поэтому в настоящее время поиск новых эффективных лекарственных препаратов для фармакологической коррекции онкологических заболеваний остается особо актуальной проблемой. Окислительный стресс и активация перекисного окисления играют важную роль в механизме элиминации опухолевых клеток, инициируя их гибель по механизму апоптоза. Для сесквитерпеновых лактонов характерен широкий спектр биологической активности, в том числе способность модулировать окислительно-восстановительные процессы в клетке.
Цель исследования. Синтез и изучение биологической активности аналогов природных алантолактонов с трансформированным углеродным скелетом, включая исследование влияния тестируемых соединений на процесс пере-кисного окисления липидов (ПОЛ) гомогената мозга крыс, с целью поиска потенциальных противоопухолевых агентов с проапоптотическим механизмом действия.
Материалы и методы. В качестве исходных сесквитер-пеновых лактонов для синтеза их аналогов использовали аланто- и изоалантолактоны, выделенные из растения девясил высокий (Inula helenium L.). Применяли методы кислотной изомеризации, перелактонизации, введения новых функциональных групп. Для приготовления гомогената мозга крыс в биологических экспериментах использовали самцов нелинейных беспородных крыс с массой тела 200— 220 г. Все манипуляции с животными проводились в соответствии с решениями комиссии по биоэтике ИФАВ РАН. Работа выполнялась на оборудовании Центра коллективного пользования ИФАВ РАН. Для оценки действия исследуемых веществ на ПОЛ гомогената мозга крыс, спонтанное и инициируемое ионами Fe (II), был применен модифицированный вариант ТБК-теста в плашечном формате. Измерения оптической плотности проводили на плашечном ридере Victor 3 (Perkin Elmer, Германия) при 540 нм.
Результаты. В ходе данной работы был синтезирован ряд аналогов природных алантолактонов с трансформированным углеродным скелетом (>30 соединений), включая соединения с диеноновой системой, перегруппированные эремофиланолиды и другие. При изучении влияния тестируемых соединений на ПОЛ гомогената мозга крыс, инициируемое ионами Fe (II), было показано, что лактоны SL-1, SL-7, SL-33 и SL-56a проявляют прооксидантный эффект, стимулируя ПОЛ более чем на 20 % относительно контроля. Схожая картина наблюдалась и при спонтанном ПОЛ. Активация окислительных процессов может рассматриваться как один
из механизмов цитотоксического действия эффективных онколитиков.
Заключение. Таким образом, исследованные сесквитер-пеновые лактоны, проявляющие прооксидантную, про-апоптотическую активность, могут быть использованы в качестве основы для создания потенциальных противоопухолевых препаратов.
Работа выполнена
при финансовой поддержке гранта РНФ№ 17-73-10461.
М.В. Нехорошев, Р.Г. Геворгиз, С.Н. Железнова СПИРУЛИНА - ПЕРСПЕКТИВНЫЙ ИСТОЧНИК ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ СОЕДИНЕНИЙ
ФГБУНИМБИ, Севастополь, Крым, Россия
Введение. Спирулина — один из самых распространенных объектов современной альготехнологии. Ежегодно в различных странах мира получают урожай спирулины, исчисляемый тоннами. Особый интерес биомасса спирулины представляет как источник ряда биологически активных соединений. Так, показано, что при ежедневном употреблении 1 г сухой спирулины в течение 12 мес у больных раком гортани наблюдалась 45 % регрессия опухоли. Высокий терапевтический эффект, вероятно, связан с наличием таких соединений, как фикобилипротеины и кароти-ноиды.
Цель исследования. Разработка технологии получения порошка с высоким содержанием фикобилипротеинов, а также комплекса каротиноидов, состоящего из миксок-сантофилла и осцилоксантина.
Материалы и методы. Цианобактерии Arthrospira (Spi-rulina) platensis культивировали в интенсивном квазинепрерывном режиме на питательной среде Заррука. Спирулину выращивали в фотобиореакторе типа «бассейн», глубина суспензии 10—12 см, рабочий объем суспензии 550 л. Источник освещения — лампы ДРЛ700, которые на поверхности суспензии давали 7 клк (28 Вт/м2). Для извлечения фикобилипротеинов использовали метод горячей экстракции. Для получения комплекса каротиноидов липидный экстракт разбавляли водой и выдерживали 3 сут при t = 5 °C. После образования комплекса каротиноидов на границе фаз полученный комплекс фильтровали и промывали хлороформом. Каротиноиды идентифицировали методами HPLC, NMR и масс-спектрометрии.
Результаты. По результатам наших экспериментов была получена биомасса спирулины с 15 % содержанием фи-кобилипротеинов. При извлечении фикобилипротеинов был получен порошок синего цвета, содержащий 18 % С-фикоцианина. Выделенный нами каротиноидный комплекс состоял только из миксоксантофилла, осцилоксанти-на и белка. В комплексе миксоксантофилл и осцилоксантин находятся в соотношении 7 : 3. По данным японских исследователей, из 55 видов природных каротиноидов мик-соксантофилл и осцилоксантин входят в лидирующую группу каротиноидов с высокой цитотоксичностью по отношению к клеткам Raji.
Заключение. Разработанные нами методы позволяют в промышленных масштабах на базе существующих предприятий по производству спирулины получать продукты с высоким содержанием соединений, обладающих
52
материалы конференции «отечественные противоопухолевые препараты»
противоопухолевым действием: фикоцианин и комплекс миксоксантофилла и осцилоксантина.
Л.Н. Николаевич1, И.В. Руденкова1, В.А. Гайдукевич2, В.А. Книжников2
оценка цитотоксических эффектов
ЦИКЛОДИПЕПТИДА PRO-PHE
на экспериментальной модели клоногенных опухолевых клеток in vitro
Институт физиологии НАН Беларуси, Минск, Беларусь; 2ИФОХНАН Беларуси, Минск, Беларусь
Введение. Клоногенные клетки опухоли обладают неограниченной пролиферативной способностью и высокой степенью выживаемости, за счет чего возможно повторное развитие опухоли. Поэтому исследование ответа клоногенных клеток на противоопухолевые препараты является перспективным направлением в поиске новых способов лечения онкологических заболеваний.
Цель исследования. Изучение цитотоксического действия циклодипептида Pro—Phe на клоногенные опухолевые клетки in vitro.
Материалы и методы. Исследования выполнены на клеточных линиях С6 (глиома крысы), HeLa (карцинома шейки матки человека), К562 (хроническая миелоидная лейкемия) и диплоидных клетках FL (амнион человека). Изучены цитотоксические эффекты цикло Pro—Phe в дозах 5, 50, 500, 1000, 5000 мкг методом МТТ-теста. Ингибиру-ющую активность субстанции циклодипептида Pro—Phe проверяли на экспериментальной модели опухолевых и диплоидных клеток перевиваемых линий С6 и FL в дозах 50, 500, 5000 мкг/мл, а также на клоногенных опухолевых клетках С6к/к и FLк/к в аналогичных дозах. Цикло-Pro-Phe вводили в монослойную культуру клеток на 24 ч. После инкубации подсчитывали количество клеток в камере Го-ряева. Ингибирующую активность рассчитывали по формуле: ИА = (К - О) / К х 100 %.
Результаты. Результаты исследований показали, что циклодипептид Pro-Phe характеризуется низкой степенью цитотоксичности. Индекс токсичности составляет 20-25 % при дозе 1000 мкг/мл. Обнаружено, что циклоди-пептид Pro-Phe не оказывает цитотоксического действия на диплоидные клетки амниона человека линии FL. На модели клоногенных клеток линии С6к/к показано, что ци-тотоксический эффект циклодипептида Pro-Phe наиболее выражен в дозе 1000 мкг/мл. Наибольшую чувствительность проявили клоногенные клетки С6к/к. Выживаемость клоногенных и неклоногенных клеток линии С6 составила 40 и 50 % соответственно.
Заключение. Результаты исследований показали, что по мере увеличения дозы цикло-Pro-Phe наблюдается подавление пролиферации опухолевых клоногенных клеток и увеличение частоты их гибели по механизму апоптоза. Модель клоногенных клеток может использоваться в качестве тест-системы in vitro для оценки цитотоксических, ингибирующих, антипролиферативных и апоптотических эффектов циклодипептидов на опухолевые клоногенные клетки.
С.И. Никулицкий, Е.Г. Тырсина ВОЗМОЖНОСТЬ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ VEGF-R1 В КАЧЕСТВЕ МИШЕНИ ДЛЯ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ ТЕРАПИИ
ФГБУ«НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России, Москва, Россия
Введение. Преимуществом таргетной противоопухолевой терапии является избирательность токсического действия на злокачественные клетки с минимальным повреждением нормальных клеток, что предопределяет поиск новых различий между ними. Одним из кандидатов на эту роль может служить рецептор фактора роста эндотелия сосудов I типа (VEGF-R1), который присутствует в большинстве опухолевых клеток, но не представлен в нормальных. Причем, как выяснилось, активация VEGF-R1 усиливает такие проявления злокачественности, как инвазия, миграция, метастазирование и выживаемость опухолевых клеток.
Цель исследования. В свете вышеизложенного мы решили проверить следующие положения: действительно ли экспрессия VEGF-R1 характерна исключительно для опухолевых клеток; присутствует ли рецептор в клеточном ядре, что свидетельствовало бы о его функциональной активности; и, наконец, имеется ли связь между количеством VEGF-R1 и степенью агрессивности неопластических клеток. Для ответа на эти вопросы мы оценили содержание рецептора в нормальных и опухолевых клетках человека, а также при помощи разработанного нами подхода к им-мунофлуоресцентной детекции белков в нативных клеточных ядрах на проточном цитометре определили уровень VEGF-R1 в ядрах клеток, различающихся по степени злокачественности.
Материалы и методы. Исследования проводили на 2 линиях опухолевых клеток — А431 (карцинома вульвы) и BRO (высокозлокачественная меланома). Контролем служила линия нормальных постнатальных фибробластов человека (ПФЧ). Локализацию и оценку содержания рецептора определяли при помощи иммуноцитохимического окрашивания (ИЦХ) и проточной цитофлуориметрии ^С). В ходе FC уровень VEGF-R1 в клетках и ядрах оценивали по величине ДMFI — разности средней интенсивности флуоресценции между опытными и контрольными образцами.
Результаты. По данным иммуноцитохимического исследования VEGF-R1 визуализировался внутриклеточно и в опухолевых, и в нормальных клетках, однако интенсивность окраски в обеих злокачественных линиях была выше. Для выявления рецептора в ядре препараты перед фиксацией обрабатывали 0,05 % раствором тритона Х-100, что значительно уменьшало долю цитозольного VEGF-R1. В результате было выявлено наличие рецептора в ядрах исключительно опухолевых клеток. Результаты ИЦХ были подтверждены и дополнены количественными данными FC. Эксперименты с интактными клетками показали практически полное отсутствие VEGF-R1 на цитоплазматиче-ской мембране как в опухолевых клетках А431 (ДМИ = 21,4) и BRO (ДMFI = 14,4), так и в нормальных ПФЧ (ДМИ = 15,8). В пермеабилизованных клетках рецептор регистрировали во всех 3 линиях, но в нормальных внутриклеточное
