CC BY
13
2. S2 SARS rep UniProt (https://www. uniprot.org/uniprot/P0C6X7 - SARS rep UniProt, P0C6X7. Дата обращения 17 апреля 2020).
3. Altschul S.F. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs / S.F. Altschul, T.L. Madden, A.A. Schäffer, J. Zhang, Z. Zhang, W. Miller, D.J. Lipman // Nucleic Acids Res. 1997 - Sep 1;25(17):3389-402.
4. Edgar RC. MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput. Nucleic Acids Res. 2004 Mar 19;32(5):1792-7.
5. Tamura K. MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.0 / K. Tamura, G. Stecher, D. Peterson, A. Filipski, S. Kumar // Mol. Biol. Evol. 2013. V. 30. P. 2725-2729.
6. Jones D.T., Taylor W.R., and Thornton J.M. The rapid generation of mutation data matrices from protein sequences / Jones D.T., Taylor W.R., and Thornton J.M. // Computer Applications in the Biosciences. 1992. 8: 275282.
7. Felsenstein J. Confidence limits on phy-logenies: An approach using the bootstrap / J. Felsenstein // Evolution. 1985. 39:783-791.
D01:10.34617/05jd-vj11 УДК 574.24:591
СПЕЦИФИЧНАЯ КЛАСТЕРИЗАЦИЯ ОКЕАНИЧЕСКИХ БЕЛКОВ DENV С БЕЛКАМИ
БАКТЕРИЙ НАЗЕМНЫХ ЖИВОТНЫХ
Карманова Александра Николаевна12 Зимин Андрей Антонович1, канд. биол. наук
1Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН -обособленное подразделение ФИЦ
«Пущинский научный центр биологических исследований РАН», г. Пущино, Российская Федерация
2Вятский государственный университет, г. Киров, Российская Федерация
В данной работе исследовано эволюционное сходство гомологов DenV из микро-биоты пелагики океана и микробиоты наземных животных, в том числе и той, которая является обычным компонентом сточных вод животноводческих предприятий. Филогения данного набора аминокислотных последовательностей гомологов DenV позволяет сделать предположения о различиях и сходствах в резистентности к УФ-излучению у бактерий этих двух экологических ниш. Это открывает фундаментальные возможности прогнозирования в области очистки сточных вод ферм УФ-светом и возможности самоочистки морских вод за счет природной инсоляции от бактериальной составляющей сельскохозяйственной контаминации.
Ключевые слова: устойчивость к ультрафиолету; DenV; очистка сточных вод ферм; микробиота пелагики океана; микробиота наземных животных
SPECIFIC CLUSTERING OF THE OCEAN DENV PROTEINS WITH PROTEINS OF TERRESTRIAL
ANIMAL BACTERIA
Karmanova Aleksandra Nikolaevna12
Zimin Andrei Antonovich1, PhD Biol. Sci.
1Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms named after G. K. Scriabin RAS - a separate subdivision of the Federal Research Center «Pushchino Scientific Centre for Biological Research of the Russian Academy of Sciences», Pushchino, Russian Federation 2 Vyatka State University, Kirov, Russian Federation
In this paper, we studied the evolutionary similarity of DenV homologs from the microbiota of the ocean pelagic and microbiota of terrestrial animals, including one that is a common component of sewage of livestock farms. Phylogeny of this set of amino acid sequences DenV homologues allow us to make assumptions about differences and similarities in resistance to UV radiation in bacteria of these two ecological niches. As a consequence, it opens the fundamental forecasting possibilities in the field of farm wastewater treatment with UV light and self-cleaning capabilities seawater due to natural insolation from the bacterial component of agricultural contamination.
Key words: resistance to UV radiation; DenV; farm wastewater treatment; microbiota of the ocean pelagic; microbiota of terrestrial animals
Ультрафиолетовое излучение является одним из методов инактивации для широкого спектра бактерий, вирусов и паразитов. Инактивация микроорганизмов с помощью УФ-излучения в сточных водах животноводческих предприятий и ферм обусловлена появлением модификаций их геномной ДНК, из которых наиболее распространенным повреждением является появление тиминовых ди-меров. Принимая во внимание, что эти модификации ингибируют полимеризацию ДНК in vivo, а в их репарации ведущую роль играет ДНК-гликозилаза пири-мидиновых димеров, продукт гена denV [6, 7], который очень широко распространен в природе, мы предприняли широкий сравнительный филогенетический анализ гомологов этого белка из метагеномных океанических проб с родственными белками различных бактерий, в том числе с теми, которые могут быть встречены в сточных водах животноводческих предприятий. Дополнительной актуальностью этой работы является наличие таких ферм по разведению сельскохозяйственных животных в различных прибрежных районах Российской Федерации в том числе и в Краснодарском и Приморском краях. Горизонтальный перенос генетической информации между бактериями весьма эффективен. В случае попадания бактерий, устойчивых к ультрафиолету из сточных вод животноводства в море мо-
жет происходить перенос генов этих бактерий в геномы морских бактерий и наоборот локализация мест животноводства в прибрежных морских районах может приводить к переносу генов устойчивости к ультрафиолету от морских бактерий к различным бактериальным возбудителям инфекций у сельскохозяйственных животных, таких как коровы, свиньи, производственная птица. Для понимания потенциала генов, устойчивости к УФ-излучению в двух этих бактериальных мирах - океане и животноводстве мы предприняли филогенетический анализ набора характерных бактериальных маркеров DenV- белков наземных бактерий и белков, последовательности которых мы извлекли ранее из метагенома поверхностных вод мирового океана из БД экспедиции Крега Вентера «Сорсер» и «Сор-сер2».
Мы использовали для анализа эволюционных связей этих белков два метода: максимальной экономии (Maximum Parsimony) и наибольшего правдоподобия (Maximum Likelihood). Оба рассматриваемых нами метода относятся к дискретным. В данном типе методов сравниваются не расстояния между выровненными последовательностями, а отдельные сайты в них [3]. Также они позволяют проводить анализ всех возможных топологий дерева и выбора наиболее подходящего.
Maximum Parsimony - это критерий оптимальности, при котором строится филогенетическое дерево, минимизирующее общее количество изменений - мутаций того или иного белка. В этом методе такое дерево является предпочтительным. Согласно критерию максимальной экономии, оптимальное дерево минимизирует количество гомоплазии (то есть минимизирует конвергентную эволюцию, параллельную эволюцию или реверсии гена). Другими словами, согласно этому критерию, кратчайшее дерево, которое объясняет сходство между последовательностями в имеющемся наборе данных, считается наилучшим. Из-за того, что метод использует все возможные топологи дерева - его сложно использовать при достаточно большом количестве таксонов, ввиду слишком большого времени вычислений. В Maximum parsimony эта проблема решается путем рассмотрения только информативных сайтов в сравниваемых последовательностях, т.е. имеющих не менее двух разных типов нуклео-тидов и каждый присутствует как минимум в двух последовательностях. Плюсы данного метода заключаются в том, что он не уменьшает объем исходной информации, исследует все возможные топологии дерева, пытается предсказать последовательности предков. К недостаткам можно отнести низкую скорость работы, использование только информативных сайтов, а не полных сиквенсов, отсутствие информации о длине ветвей, обладание высокой чувствительности к смещению в исходных данных, невозможность коррекций множественных мутаций [1].
В методе Maximum likelihood анализируются все сайты в сравниваемых последовательностях. В основе метода лежит максимизация критерия выбора правдоподобия на основе выбранной модели - все полученные топологии деревьев оцениваются по правдоподобию и выбирается именно то, которое имеет наибольшее значение критерия, аналогичного Maximum parsimony - варианта с
минимальным количеством мутаций. Проблема с большим количеством вычислений моет быть решена путем построения деревьев только по некоторым частям сайтов. Плюсы метода - одновременно с построением дерева дается оценка его правдоподобия, возможность задавать различные скорости мутаций, а также использовать различные модели эволюции. Данный метод позволяет обнаруживать сходство даже для эволюционно удаленных последовательностей. Основной недостаток - это большое количество вычислений, и как следствие низкая скорость работы [1].
При построении нами деревьев также использовался алгоритм бутстрэп, служащий для статистического подтверждения корректности результатов [1]. Метод основан на построении серии данных путем создания многочисленных последовательностей из случайных выборок исходной последовательности. Он позволяет проверить наличие статистических ошибок и смещения в исходных данных. Если данные не содержат смещения и других стохастических искажений, то все деревья, построенные на основе бутстрэп данных, будут иметь практически одинаковую топологию [1].
Методика исследований. Для сравнения а.к. последовательностей эндо-нуклеазы DenV бактериофага Т4 с базами данных белковых последовательностей использовался алгоритм PSI-BLAST [2]. Уровень достоверности результатов Е-value < 3e-29. Полученный файл с а.к. последовательностями гомологов DenV Т4 в формате FASTA объединили в один файл и использовали для обработки в пакете программ MEGA6 [8]. Выравнивание осуществляли при помощи алгоритма MUSCLE [3]. В анализе приняли участие 65 аминокислотных последовательностей. Все позиции, содержащие пробелы и пропущенные данные, были исключены. Всего в итоговом наборе данных было 6 позиций. Эволюционный анализ был проведен в MEGA6 [8]. Эволюционная история
была выведена с использованием нескольких методов.
Первый используемый метод -Maximal likelihood, основанный на матричной модели JTT [5]. Начальное дерево консенсуса выведено из 1000 повторов с использованием бутсрепа. Исходные деревья для эвристического поиска были получены автоматически с использованием метода Maximum Parsimony к матрице попарных расстояний, оцененной с использованием модели JTT. В итоге полу-чилили дерево с наибольшим логарифмическим правдоподобием (-264,3223) -представлено на рисунке 1 А.
Второй используемый метод -Maximum Parsimony. Эволюционная история была выведена с использованием метода максимальной экономии. Начальное дерево консенсуса, выведенное из 1000 повторов, используется для представления эволюционной истории анализируемых таксонов [4]. Ветви, соответствующие разделам, воспроизведенным менее чем в 50% копий начальной загрузки, свернуты. В итоге получили дерево, представленное на рисунке 1 Б.
Результаты исследований и их обсуждение. В дереве, полученным методом Maximum likelihood (рисунок 1 А), можно выделить две ветви гомологов. В первую вошли эндонуклеазы всех используемых фагов, а также бактерии-возбудители острых кишечных инфекций и обитатели кишечной микрофлоры. Ветвь кажется не сильно однородной, разделение наблюдается скорее ступенчатое.
Большинство использованных нами эндонуклеаз морского метагенома и циа-нобактерий образовали вторую крупную ветвь гомологов. Помимо этого, в нее попали последовательности Brucella suis и Verrucomicrobiaceae bacterium - распространенной почвенной бактерии. Остальные гликозилазы метагеномов оказались объединены в небольшие подветви. Интересно расположение последовательности из морской бактерии Alteromonas sp,
попавшей в одну подветвь с патогенными бактериями и бактериями микрофлоры носоглотки.
Также интересен тот факт, что эндонуклеазы бруцелл схожи с различными последовательностями метагеномов, а не между собой и бактериями почвы. Это может говорить о наличие горизонтального переноса между бруцеллами и пико-планктоном, ввиду попадания сточных вод животноводства в океаны или из-за близкого нахождения животноводческих ферм к прибрежным морским водам, где и могут данные микроорганизмы пересекаться.
Гликозилаза Escherichia virus T4 имеет больше всего сходств с последовательностью Cellulomonas oligotrophica -почвенной бактерией-целлюлозолити-ком, образуя с ней отдельную ветвь. Ближайшая к ней ветвь объединила в себе белки Clostridioides difficile и Escherichia phage vB EcoM-UFV13.
Судя по дереву, эти две ветви занимают промежуточное положение между ветвями фагов и крупной ветвью последовательностей из цианобактерий и ме-тагенома. Можно предположить, что эндонуклеазы цианобактерий и метагенома достаточно схожи с таковой у фагов эше-рихии и почвенными бактериями. Вполне возможно, что когда-то между ними произошел горизонтальный перенос, но нужно проводить дальнейшие исследования для окончательного вывода.
На дереве Maximum parsionomy (рисунок 1 Б) получили интересное распределение выбранным нами объектов по небольшим группам, тенденции сходны с распределением на дереве, полученным методом Maximum likelihood, но прослеживаются не так четко. В целом, по всему дереву можно сказать, что гликозилазы большей части выбранных нами фагов схожи между собой и чаще объединены в мелкие клады по парам, ступенчатое распределение заметно в меньшей степени. Наиболее близкой большей части вирусов оказались эндонуклеазы Salmonella
enterica, серовары которой могут быть патогенными для человека и животных, и,
ожидаемо, Escherichia coli.
Ii
I Sj/nioiifí/j enterics
> Escheric hi* phage vB EcoM G2S40
> Escherichia phage ImeOO
> Esehe ric hia phage DSSOS
> Escherichia phag* HY01
> Escherichia phage slurl* * Escherichia phage slur07
> Entero bacteria phage OiZh
> Escherichia phage EcqM Ol 0*00
> Shigella phage Ж23
> YeniiH* phage phipl I Shigella phage Stil
> Enterobacter!* phage Kh*5h
> Shigella phage pSs-1
> Enterobact+ria phage ЯВ5 1
> Bacillus certus
I Escherichia colt
I Salmonella enteric a iubip enteric* l Escherichia toll II b Cellulomonas oligotrophies
'Escherichia vnusT4
ь С los Iridio i des difficile
> Eichbichl* phage rB EcoM-UFV 13 I Brucella suj's
ICOS $723096
I Prochforococeut sp. MIT 1303 I Prochlorococcv* sp ШТ 1306 I Protfitonxrocti/i marinus sir MIT 1312 I COS 1602796 I GOÍ 3443193 I OOS 3*^9615
i Verrucomlcrobiaceae bacterium I OOS 8318699 I SOS 165J6S6
i cos jeesoii \ COS 474660* I COS 91 JSJtJJ I COS 2666136 I OOS 266*698
> MUL TISPECIES unclassified PrOChktrocOCCuS ICOS 7731572
I COS 4BOÍ32Q
\ Brucella melitensls bv. 1 str. 7biW I SOS Si437
LI
i Kin yella kingae I COS 7829903
I Brucella abortus I COS 79Й771В i Slfimlij/oMmi americanum I COS 1794792 ь Aggregatlbactet if jnj» lOOSetííS/í)
I Haemophilus parainfluenza* l Дуулту«НиеНГ I MA Iteromonas sp I Avibacterium volantlum I A/4«10()J!0ÍHJ4 ri.lSQITfjf b Xenúrftíbdi/i Гтогрт^СА^ I OOS 6617130 I COS J0162 I COS 9129B49 I COS ÍS6JTT1 I Helsseriaceae bacterium I COS
I Candidatos Mamumicrobia bacterium
is
s
Salmonella enteric* J-J
Escherichia phage Inie09
Escherichia phage HYOi
Escherichia phage slur07
Escherichia phage vB EcoM G10400
Yersinia phage phipi
Enterobacter^ phage Kh*5h
Enterobacter!» phage RB" f
Escherichia phage 05MS
Shigella phage SI21
Escherichia coll
Shigella phage pSs-1
Shigella phage JK23
Enterobacter!* phage GiZh
Bacillus ceretis
Escherichia phas^ KurM
COS tfliiflii
Ul/LTlSPEClES. unclassified Prochiorococcus
OOS 9235302
GOS 2666OSS
COS 47*6664
Brucella abortus
BOS 7829903
OOS 7937718
Kingella kingae
COS *Jf№9S>
COS 3*3$* 9
Candida tus Marinimtcrobla bacterium Salmonella enteric* svbtp enteric* Clostridial^** difficile Escherichia coli ¡1 Escherichia phage VB EcoM-UFVi3 Aggregatibacter aphrophllus Ctlhiiomonas oligotrophia Escherichia virus T* VimjdomlemöfieM*' bacterium Brucella suis MAlteromonas sp. Aggregatibacter SegnlS Haemophilia p*r*infltttm*e GOS 8122ST0 COS 7731572
Brucella melitensls bv 1 sir. 16M GOS 4605320
Sinorhtiobitim americanum
COS 179479i
COS «WJHT
COS 8443193
GOS 2664698
COS «Si 13«
GOS 349961S
Escherichia phage vS EcoM C iü0 Avlbacterlum vpiantium Xenorhabdui homlnlckli Artenophonut nasonta* Nelsseriaceae bacterium COS 6617130 COS 3030162 GOS 9129849 COS 1603795
Prochiorococcus sp. MIT 1303 Prochlortxocciis matii'ui tu. MIT i3l2 GOS 87230M
Prochiorococcus sp. MIT 1306 GOS 91*37
Рисунок 1 - Два филогенетических дерева эволюционного сходства белков гомологов DenV - эндонуклеазы фага Escherichia virus T4 - отмечена черным ромбом и более крупным шрифтом. Под буквой А - филогенетическое дерево, построенное методом Maximum likelihood с учетом бустрепов, Б - методом Maximum parsionomy с учетом бустрепов. Последовательности из метагенома океана обозначены черными кружочками, белыми - из морских бактерий родов Prochiorococcus sp., Malteromonas sp., Candidatus Marinimicrobia bacterim sp. Эндонуклеазы бактериофагов бактерий родов Enterobacteria sp., Shigella sp., Yersinia sp., Escherichia sp., обозначены черными ромбами, последовательности из наземных бактерий - белыми квадратами и треугольниками
Интересно, что наиболее близкими к последней оказались фаги шигелл, а не ее собственные. Как и в предыдущем дереве, гликозилаза бактериофага Т4 оказалась сильно схожей с Cellulomonas Oligotrophica. Отличие состоит в том, что к данной ветви прибавилась последовательность из Aggregatibacter aphrophilus - бактерии, которая в норме может быть представителем микрофлоры носоглотки человека.
Последовательности из морских бактерий распределились в небольшие группы вместе с эндонуклеазами метагенома. Самой разнородной получилась группа, которая наиболее близка с вышеописанной ветвью с последовательностью из Т4. В нее вошли как и последовательности метагенома и морской Alteromonas sp., так и белки из почвенных бактерий, бактерий микрофлоры человека, патогенных Haemophilus parainfluenzae и Brucella suis. Последняя образует отдельную ветвь с Verrucomicrobiaceae bacterium - широко распространенной почвенной бактерии. Расположение остальных эндо-нуклеаз представителей рода бруцелл схоже с расположением на первом дереве, они также оказались близки к последовательностям метагенома. Также, в отдельную ветвь, как и в дереве Maximum likelihood выделилась большая часть белков из цианобактерий, в нее же вошли несколько эндонуклеаз метагенома. Последовательность из Multispecies: unclassified Prochlorococcus вошла в отдельную ветвь, но также имеет больше всего сходств с гликозилазами метагенома.
В целом, по этому дереву можно сказать, что есть выраженное сходство между последовательностями метагенома и морскими бактериями, а также между эндо-нуклеазами фагов. Общее сходство между двумя этими группами выделить сложнее.
Выводы. 1. В ходе исследования получили два филогенетических дерева построенных разными методами, но относящихся к общему типу и построенных на относительно общих признаках.
2. На каждом из филогенетических деревьев наблюдается тенденция объединения эндонуклеаз фагов и последовательностей из океанического метаге-нома, цианобактерий и морских бактерий в собственные ветви.
3. Более логичные и наглядные результаты дало филогенетическое дерево, построенное методом Maximum likelihood. Вышеописанные тенденции там проявляются лучше. Данный метод подходит для выявления филогенетических связей между последовательностями, имеющими мало общего между собой, поэтому именно на данные результаты стоит обращать больше внимания.
4. Гликозилаза Escherichia virus T4 и самая близкая к ней гликозилаза Cellulomonas Oligotrophica в обоих случаях занимала промежуточное положение между этими ветвями, но все же они имели больше сходств с фаговыми последовательностями. Согласно этому, можно предположить, что когда-то между фагами эшерихии, почвенными бактериями и морскими бактериями произошел горизонтальный гена данной эндонуклеазы, но нужно проводить дальнейшие исследования для окончательного вывода и прослеживания данной цепочки событий.
5. На обоих эволюционных деревьях мы получили интересное распределение последовательностей из бактерий, патогенных для человека и животных, в частности, они часто оказывались близки с эндонуклеазами океанического метаге-нома. Это говорит в пользу наличия горизонтального переноса гена, который влияет на устойчивость к УФ-излучению, между группами морских бактерий и бактерий наземных, в том числе и сельскохозяйственных животных.
6. Для подтверждения данных предположений стоит проводить больше подобных исследований.
7. Открытые нами зависимости между наличием белка, участвующего в репарации после повреждения ДНК УФ-излучением у разных групп микроорга-
низмов стоит учитывать при выборе способов обеззараживания сточных вод и прочих жидких отходов животноводства.
Благодарности. Исследование было частично поддержано грантом РФФИ №20-54-53018 ГФЕН_а для Зимина А.А. и выполнено им в рамках этого проекта.
Список литературы
1. Волков Ю.П. Анализ эффективности некоторых методов построения филогенетических деревьев, используемых при оценке эволюционного родства микроорганизмов / Ю.П. Волков, Г.А. Ерошенко // «Проблемы особо опасных инфекций». 2009. Вып.99. С.35-41.
2. Altschul S.F. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs / S.F. Altschul, T.L. Madden, A.A. Schaffer, J. Zhang, Z. Zhang, W. Miller, D.J. Lipman // Nucleic Acids Res. 1997. 25: 33893402.
3. Edgar R.C. MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high
throughput / R.C. Edgar //Nucleic Acids Res. 2004. 32: 1792-1797.
4. Felsenstein J. Confidence limits on phy-logenies: An approach using the bootstrap / J. Felsenstein //Evolution. 1985. 39: 783-791.
5. Jones D.T. The rapid generation of mutation data matrices from protein sequences / D.T. Jones, W.R. Taylor, J.M. Thornton // Comput Appl Biosci. 1992. 8: 275-282.
6. McMillan S. Den V gene of bacteriophage T4 codes for both pyrimidine dimer-DNA gly-cosylase and apyrimidinic endonuclease activities / S. McMillan,.J. Edenberg, E.H. Ra-dany, R.C. Friedberg, E.C. Friedberg //J Virol. 1981. 40: 211-223.
7. Rubin J.S. The molecular genetics of the incision step in the DNA excision repair process / J.S Rubin //Int J Radiat Biol. 1988. 54:309-365.
8. Tamura K. MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.0. / K. Tamura, G. Stecher, D. Peterson, A. Filipski, S. Kumar // Molecular Biology and Evolution. 2013. 30: 2725-2729.
Б01:
УДК 636.237.21.082
ЭФФЕКТИВНОСТЬ РАЗВЕДЕНИЯ МОЛОЧНОГО СКОТА ЧЕРНО-ПЕСТРОЙ
ПОРОДЫ ПО ЛИНИЯМ
Ковалева Галина Петровна, канд. с-х. наук, доцент
ФГБНУ «Северо-Кавказский федеральный научный аграрный центр»,
г. Михайловск, Российская Федерация
В статье приведены исследования по влиянию линейной принадлежности на продуктивность животного и качественные показатели молока и промеров животных. Работа проводилась в СПК колхозе-племзаводе «Казьминский» Кочубеевского района Ставропольского края на поголовье скота черно-пестрой породы. Установлено влияние линии на хозяйственно-полезные качества коров.
Ключевые слова: крова; линия; молочная продуктивность; содержание жира и белка в молоке
