CC BY
103
СПЕЦИФИЧЕСКИЙ ИММУННЫЙ ОТВЕТ В ДИАГНОСТИКЕ ЦЕЛИАКИИ ПРИ ХРОНИЧЕСКОЙ ДИАРЕЕ
Гудкова Р. Б., Крумс Л. М., Потапова В. Б., Сабельникова Е. А., Чикунова Б. З., Парфёнов А. И
ГУ Центральный научно-исследовательский институт гастроэнтерологии ДЗ г. Москва
Гудкова Раиса Борисовна
111123, Москва, ш.. Энтузиастов д.86
Тел.: 8 (495) 3043026
E-mail: [email protected]
РЕЗЮМЕ
Предпосылка. Выработка антител к глиадину (Ат Гл), к тканевой трансглютаминазе (Ат тТГ), к эн-домизию (Ат Эм) и к ретикулину (Ат Рк) является основой специфического иммунного ответа при целиакии (Ц) среди больных, страдающих хронической диареей.
Методы. Иммуноферментным и иммунофлюоресцентным методами в сыворотке крови больных хронической диареей определяли Ат к пищевому белку Гл, к ферменту тТГ, к коллагену — Эм и Рк для диагностики Ц. Морфологическим и гистохимическим методами оценивали изменения слизистой оболочки тонкой кишки (СОТК) и распределение субпопуляций лимфоцитов в эпителии и в собственной пластинке.
Результаты. Среди больных, страдающих хронической диареей, имеющих потерю массы тела, гипопротеинемию и железодефицитную анемию, в 15,9% случаев диагностирована Ц. Увеличение в эпителии количества цитотоксических лимфоцитов (CD3+-CD8+), а в собственной пластинке СОТК — хелперных лимфоцитов (CD3+-CD4+) и плазматических клеток связано с патологической иммунной реакцией на глиадин, сопровождающейся выработкой Ат. Повышенная концентрация Ат Гл у 94,6% у больных Ц свидетельствует об иммунном ответе на пищевой белок. Выявление при Ц Ат тТГ, Ат Эм в 98 и 100% случаев указывает на появление антигенных свойств у собственных тканей, что связано с нарушением структуры базальной мембраны эпителия. Частота выявления Ат Гл, Ат тТГ, Ат Эм при Ц по сравнению с другими обследованными больными хронической диареей отражает высокую степень чувствительности и специфичности, что определяет их значение в диагностике.
Заключение. Высокая концентрация Ат Гл, Ат тТГ, Ат Эм и Ат Рк и увеличение количества имму-нокомпетентных клеток в СОТК при Ц является показателем специфического иммунного ответа, развивающегося на глиадин и тканевые антигены. При Ц установлена высокая специфичность и чувствительность Ат тТГ и Ат Эм.
Ключевые слова: целиакия; антитела; тканевая трансглютаминаза; глиадин; эндомизий. SUMMARY
High concentration of Ab Gl, Ab tTG, Ab Em and Ab Rt and increased amount of immunocompetent cells in the SIM in coeliac disease is an index of the developing specific immune response to gliadin and tissue antigens. High specificity and sensitivity of Ab tTG and Ab Em were determined in celiac disease.
Keywords: coeliac disease; antibodies; gliadin; tissue transglutaminase; endomisium.
Ф
терапевтическая гастроэнтерология
therapeutic gastroenterology
ВВЕДЕНИЕ
Среди больных с хронической диареей по тяжести клинического течения выделяются больные Ц, для которых характерно нарушение всасывания в тонкой кишке [1]. Стимуляция антигенами вызывает развитие иммунной реакции, обусловленной повышенной чувствительностью к пищевому белку глиадину с выработкой Ат. Морфологическим признаком Ц является повреждение структуры СОТК — гиперрегене-раторная атрофия, выражающаяся в увеличении крипт и атрофии ворсинок [2]. Активация иммунной системы проявляется увеличением количества иммунокомпетентных клеток, расположенных в эпителии и в собственной пластинке, и выработкой Ат Гл и к его фракциям [3 - 5]. Специфичность и чувствительность этих антител варьируют в широких пределах [6], что ограничивает их диагностическую значимость. Ат тТГ в диагностике Ц являются наиболее чувствительным маркером, а специфичным тестом — Ат Эм [7]. Противоречивость показателей иммунных реакций при Ц связана с исследованиями различных возрастных групп (взрослые и дети), а также со степенью повреждений СОТК. Длительная выработка Ат и постоянная стимуляция антигеном создают опасность развития лимфом, что требует особого внимания к пациентам, страдающим хронической диареей.
Целью работы явилось изучение специфических иммунных реакций, характерных для целиакии, для выявления этого заболевания среди больных с хронической диареей.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
За период с 2003 по 2007 год в отделении патологии тонкой кишки ЦНИИГ обследовано 363 больных с хронической диареей в возрасте от 18 до 67 лет (72 мужчины и 291 женщина). У больных хроническая диарея продолжалась более месяца, частота стула преобладала до 5 раз в сутки с болями в животе и метеоризмом. Более тяжелые проявления диареи в виде полифекалии или частоты стула более 10 раз в сутки встречались у 28% больных. Частым (36%) симптомом является дефицит массы тела. Также часто наблюдаются симптомы гиповита-минозов — сухость и шелушение кожи, ломкость ногтей. Недостаточность минералов проявляется развитием остеопороза, парестезий и судорог (табл. 1).
Для диагностики проводили обследование — общее клиническое (гемоглобин, альбумин, сывороточное железо, минеральный обмен), рентгенологическое исследование тонкой кишки. У больных с хронической диареей установлены характерные клинические симптомы, сочетающиеся с гипопро-теинемией и железодефицитной анемией, которые отражают глубокие метаболические нарушения.
Таблица 1
КЛИНИЧЕСКИЕ СИМПТОМЫ У БОЛЬНЫХ С ХРОНИЧЕСКОЙ ДИАРЕЕЙ
Симптомы Количество больных (я) %
Частота стула: до 5 раз/сутки 232 64,1
6-10 раз/сутки 95 26,2
более 10 раз/сутки 28 8,7
Ночная диарея 20 5,8
Консистенция стула: кашицеобразный 278 76,7
водянистый 84 23,3
Полифекалия (> 300 г/сутки) 63 17,6
Метеоризм, урчание в животе 255 70,3
Боли в животе 218 60,1
Потеря массы тела 130 35,9
Симптомы гиповитаминоза 131 36,8
Парестезии, судороги 63 17,4
Отеки 26 7,3
Гипопротеинемия 49 13,5
Железодефицитная анемия 98 27,1
Остеопороз, боли в костях 27 4,4
о
Таблица 2
НОЗОЛОГИЧЕСКИЕ ФОРМЫ ЗАБОЛЕВАНИЙ У БОЛЬНЫХ С ХРОНИЧЕСКОЙ ДИАРЕЕЙ
Диагноз n %
Целиакия 58 15,9
Болезнь Крона тонкой кишки 14 3,8
Лимфома тонкой кишки 2 0,5
Вариабельный иммунный дефицит (гипогаммаглобулинемия), 6 1,6
Гипогаммаглобулинемическая спру 1 0,2
Синдром раздраженного кишечника 193 53,2
Энтеропатия (аллергическая, холагенная, эндокринная) 51 14,0
Недостаточность ферментов (дисахаридазы, лактазы) 12 3,3
Илеит иерсиниозный 5 1,4
Колит хронический 13 2,5
Панкреатит хронический 7 1,9
Системная склеродермия 1 0,2
Всего 363 100,0
Эзофагогастродуоденоскопия с биопсией двенадцатиперстной или тощей кишки проводилась с использованием интестиноскопа SIF-10L Olympus. Морфологическое исследование биоптатов проведено на парафиновых срезах, окрашенных гематоксилин/эозином. Количество межэпителиальных лимфоцитов рассчитывали на 100 энтероцитов. Степень атрофии слизистой оболочки (частичную, субтотальную, тотальную) и клеточную инфильтрацию оценивали по March (1990). При морфологическом исследовании слизистой оболочки тонкой кишки у 58 больных выявлены изменения: гипер-регенераторная атрофия, инфильтрация лимфоцитами и плазмоцитами собственной пластинки, характерные для Ц. У 305 пациентов в слизистой оболочке тонкой кишки превалировали показатели, характерные для незначительного воспаления или нормы.
Среди пациентов с хронической диареей, кроме больных Ц, часто выявляются функциональные энтеропатии или синдром раздраженного кишечника.
У 14 больных при рентгенологическом и эндоскопическом исследовании обнаружена болезнь Крона тонкой кишки. Редкие болезни тонкой кишки (лим-фома, общая вариабельная гипогаммаглобулинемия, гипогаммаглобулинемическая спру, лимфангиома-тоз) обнаружены у 9 больных (табл. 2).
У всех больных проведено исследование иммунного статуса: содержание иммуноглобулинов A, M, G и Ат в сыворотке крови, субпопуляций лимфоцитов в СОТК.
МЕТОДЫ
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИТЕЛ К ГЛИАДИНУ
У всех больных в сыворотке крови иммунофермен-тным методом (ELISA) определяли Ат Гл IgA и Ат Гл IgG (IMMCO Diagnostics, США). Положительная реакция для IgA Ат оценивалась при уровне выше 12,0 МЕ/мл и для IgG — 15 МЕ/мл. Для выявления аутоантител к глиадину применен ферментный конъюгат, представляющий кроличьи античеловеческие антитела против ^А, меченные перокси-дазой хрена. Интенсивность окраски хромогенного субстрата — тетраметилбензидина (ТМБ) прямо пропорциональна концентрации Ат в образце. Оптическая плотность регистрировалась при 450 нм. Расчет концентрации в образцах сыворотки производился по калибровочной кривой, построенной по результатам показателей в положительных контролях.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИТЕЛ К ТКАНЕВОЙ ТРАНСГЛЮТАМИНАЗЕ
Ат тТГ IgA определяли ELISA с использованием рекомбинантной человечьей тканевой трансглю-таминазы в коммерческих наборах (ORGenTec Diagnostika GmbH). Оптическая плотность регистрировалась при 450 нм. Концентрацию антител рассчитывали по калибровочной кривой, построенной по показателям антител в положительных контролях. Пороговые значения нормы — до 10 МЕ/мл.
терапевтическая гастроэнтерология
therapeutic gastroenterology
о
ю
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИТЕЛ К РЕТИКУЛИНУ
Ат Рт IgA определяли методом непрямой иммунофлюоресценции (IMMCODiagnostics, USA), используя препараты срезов почки мыши. Связавшиеся антитела определяли путем инкубации с меченными флуоресцеинизотиоцианатом поливалентными козьими антителами против IgA человека. На присутствие антител к ретикулину указывает свечение зеленого цвета на перитубулярных, перигломеру-лярных и периваскулярных волокнах в срезах почки. Титр антител представляет величину, обратную наибольшему разведению, при котором наблюдается свечение. Положительная реакция наблюдается при разведении сыворотки 1:40.
ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К ЭНДОМИЗИЮ
Ат Эм IgA определяли методом непрямой иммунофлюоресценции, используя коммерческие наборы (IMMCO Diagnostics, USA). Связавшиеся антитела определяли путем инкубации с меченными флуо-ресцеинизотиоцианатом поливалентными козьими антителами против IgA человека. На наличие специфических Ат Эм указывает свечение зеленого цвета эндомизия гладкомышечных клеток. В каждое определение включается положительный и отрицательный контроль. Концентрация антител определяется по величине наибольшего разведения, при котором наблюдается свечение эндомизия. Результаты считали положительными при титре 1:40.
Информативность антител оценивалась с учетом чувствительности и специфичности их при Ц. Чувствительность определена как частота встречаемости (в%) повышенных титров антител среди нелеченых больных Ц с морфологически подтвержденным диагнозом. Специфичность определялась как доля лиц с положительным результатом в группе пациентов с заболеваниями тонкой кишки, исключая целиакию.
СУБПОПУЛЯЦИИ ЛИМФОЦИТОВ В ТКАНИ СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ ТОНКОЙ КИШКИ
Криостатные срезы ткани слизистой оболочки тонкой кишки толщиной 4 мкм прикрепляли к стеклу
поли^-лизином и обрабатывали моноклональными антителами против CD3, CD4, CD8, CD16 (Dako Сytomation, Дания). Проводили конъюгацию препаратов с кроличьими антимышиными антителами, содержащими Fab-фрагменты. Для выявления реакции использованы антитела против IgA человека, меченные пероксидазой хрена. Ядра клеток окрашены гематоксилином.
СТАТИСТИКА
Результаты представлены как средние значения M ± SD. Для сравнения между средними величинами использован t-тест Стьюдента, значения р < 0,05 оценивались статистически значимыми.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Иммуноморфологическое исследование показало увеличенное содержание иммунокомпетентных клеток в собственной пластинке СОТК больных Ц при сопоставлении с группой сравнения (табл. 3). В СОТК при Ц обнаружена гиперрегенератор-ная атрофия, тотальная и субтотальная атрофия ворсинок, что соответствует 3А, 3В и 3С типу повреждения по Marchs (1990). Увеличено количество лимфоцитов в эпителии и в собственной пластинке. Выявлена выраженная инфильтрации эпителия ворсинок и крипт лимфоцитами (43,7 ± 2,3 на 100 энтероцитов). В собственной пластинке слизистой преобладали лимфоциты, плазмоциты, дендритные клетки и эозинофилы. Иммунокомпетентные клетки образовывали небольшие скопления в виде инфильтратов или располагались изолированно.
Выраженная иммунная реакция в СОТК при Ц сопровождается выработкой антител различной специфичности. Информативность иммунологических тестов в диагностике Ц была оценена по показателям чувствительности и специфичности антител к глиадину и антител к тканевым структурам. В сыворотке крови больных Ц выявлены IgA Ат Гл, IgG Ат Гл, IgA Ат тТГ, IgA Ат Эм и IgA Ат Рк в различной концентрации (табл. 4). Уровни антител
Таблица 3
СУБПОПУЛЯЦИИ ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫХ КЛЕТОК В СОБСТВЕННОЙ ПЛАСТИНКЕ СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ ТОНКОЙ КИШКИ ПРИ ЦЕЛИАКИИ
Субпопуляции клеток,% в 1 кв. мм Целиакия (п = 15) Группа сравнения (п = 15)
Т-лимфоциты (СД3+) 13,41 ± 1,24a 4,76 ± 0,34
Т-хелперы (СД4+) 11,7 ± 1,07a 3,42 ± 0,31
Т-супрессоры (СД8+) 2,3± 0,24 1,12 ± 0,10
Плазматические клетки 24,7 ± 1,47a 7,43 ± 0,31
Нейтрофильные лейкоциты 3,37 ± 0,11a 0,2 ± 0,01
Эозинофильные лейкоциты 4,13 ± 0,14 1,52 ± 0,13
О!
о
о
„
ю
Таблица 4
КОНЦЕНТРАЦИЯ СПЕЦИФИЧНЫХ АНТИТЕЛ И ЧАСТОТА ВЫЯВЛЕНИЯ
Больные Ц (п = 58) Группа сравнения (п = 172)
Антитела концентрация частота концентрация частота
(нг/мл) повышения,% (нг/мл) повышения,%
IgA Ат Гл 150,3 ± 10,4a 94,6 12,2± 0,7 15,4
IgG Ат Гл 127,1± 11,3a 82,6 17,6± 0,5 15,4
IgA Ат тТГ 85,4 ± 8,9a 98,0 11,3 ± 0,4 3,8
IgA Ат Эм 1:160a 100,0 1:5 1,9
IgA Ат Рк 1:80a 82,5 1:10 5,8
у больных Ц были сопоставлены с концентрацией Ат у больных с другими заболеваниями, что определило их специфичность. У больных Ц средние значения Ат Гл и Ат тТГ составили соответственно 150,3 и 85,4 МЕ/мл, превышая норму и показатели в группе сравнения (р < 0,05). Чувствительность составила 94,6 и 98,0%, а специфичность определена как 84,6 и 97,2% соответственно. У больных Ц обнаружены положительные титры ^А Ат Эм — 100% и ^А Ат Рк — у 82,5%, что указывает на высокую чувствительность. Специфичность этих методов составила соответственно 98,1 и 94,2%, так как положительные реакции выявлялись в группе сравнения ^А Ат Эм у 1,9% больных, ^А Ат Рк — у 5,8%.
У пациентов с дефицитом ^А, протекающим с хронической диареей, выявлялись IgG Ат Гл, чувствительность и специфичность которых составила 82,6 и 84,6% соответственно.
ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ
Среди 363 больных с хронической диареей выявлено 58 (15,9%) больных Ц, диагноз которым поставлен на основании клинических, рентгенологических, морфологических и иммунологических данных. Иммунный ответ связан с патологической реакцией на глиадин и на измененные структуры СОТК с образованием Ат к эндомизию, ретикулину, тканевой трансглютаминазе [11]. В наших исследованиях показано, что при хронической диарее иммунные реакции с выработкой антител имеют диагностическое значение. Высокие концентрации Ат Гл, Ат тТГ, Ат Эм и Ат Рк наблюдаются только при Ц. В СОТК увеличено количество лимфоцитов и плазматических клеток. Установлено, что в диагностике Ц наиболее чувствительными и специфичными являются антитела к эндомизию в высокой концентрации. Однако, согласно данным литературы, чувствительность выше у Ат Гл, а высокая специфичность связана с Ат Эм и Ат тТГ [8].
В нашей работе показано, что оптимальным в диагностике Ц является одновременное определение содержания в сыворотке крови ^А Ат Гл, ^А Ат тТГ, ^А Ат Эм, так как при этом сочетается высокая чувствительность Ат Гл и Ат тТГ со специфичностью Ат Эм. Эти маркеры могут быть рекомендованы к использованию в клинической практике при обследовании групп риска. Наличие данных антител не исключает проведения энтеробиопсии с целью диагностики клинически неясных случаев Ц, особенно при низких концентрациях Ат. У пациентов с клиническими симптомами Ц биопсия тонкой кишки является основным диагностическим критерием как при положительных, так и при отрицательных серологических реакциях. У лиц с отсутствием клинических симптомов положительные серологические тесты являются основанием для рекомендации биопсии тонкой кишки, чтобы диагностировать Ц, особенно выявление ^А Ат тТГ и ^А Ат Эм, обладающих высокой специфичностью [7]. Различная специфичность и чувствительность ^А Ат тТГ, выявленная некоторыми исследователями, зависит от используемых в реакциях маркеров тканевой трансглю-таминазы (морской свинки или рекомбинантной тТГ человека) [9; 15]. Спорными считаются тесты с ^А Ат Гл и менее подходящими для диагностики из-за низкой специфичности [10]. Тест с IgG Ат Гл в большинстве работ имеет чувствительность и специфичность меньше 80%, что снижает диагностическую значимость [12], однако с помощью повышенного уровня IgG Ат Гл удается выявлять больных Ц с дефицитом ^А. Доказана обоснованность применения тестов на основе IgG в случаях иммунодефицита [13; 14]. Различная специфичность и чувствительность антител при Ц ставит вопрос о стандартизации обследования больных, страдающих хронической диареей. Расширение спектра антигенов, которые появляются при Ц и распознаются иммунокомпетентными клетками, приводит к иммунным реакциям и развитию аутоиммунного процесса с возможной малигнизацией.
терапевтическая гастроэнтерология
therapeutic gastroenterology
(N
Ю
О
о
„
ЛИТЕРАТУРА
1. Парфенов А. И., Крумс Л. М., Жукова С. Г. и др. Клиническое значение оценки иммунологического статуса больных глютеновой энтеропатией//Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. — 1997. — Т. 7, № 2. — С. 37-41.
2. Marsh M. N., Bjarnason I., Shaw J. et al. Studies of intestinal lymphoid tissue. XIV-HLA status, mucosal morphology, permeability and epithelial lymphocyte populations in first de gree relatives of patients with coeliac disease//Gut. — 1990. — Vol. 3l. — P. 30-36.
3. Sollid L. M. Molecular basis of coeliac disease//Annu. Rev. Immunol. — 2000. — Vol. 18. — P. 53-81.
4. Парфенов А. И., Жукова С. Г., Гудкова Р. Б. и др. Диагностика и оценка эффективности лечения глютеновой энтеропатии//Тер. арх. — 2002. — Т. 2. — С. 27-31.
5. KagnoffM.F. Celiac disease pathogenesis: the plot thickens//Gastro-enterology. — 2002. — Vol. 123. — P. 939-943.
6. Hill I. D. What are the sensitivity and specificity of serologic tests for celiac disease? Do sensitivity and specificity vary in different
populations?//Gastroenterology. — 2005. — Vol. 128, № 4, Suppl. 1.
7. Tesei N., Sugai E., Vazquez H. et al. Antibodies to human recombinant tissue transglutaminase may detect coeliac disease patients undiagnosed by endomysial antibodies//Aliment. Pharmacol. Ther. — 2003. — Vol. 17. — P. 1415-1423.
8. Dickey W., McMillan S. A., Hughes D. F. Sensitivity of serum tissue transglutaminase antibodies for endomysial antibody positive
and negative coeliac disease//Scand. J. Gastroenterol. — 2001. — Vol. 36. — P. 511-514.
9. WongR. C., Wilson R.J., Steele R. H. et al. A comparison of 13 guinea pig and human anti-tissue transglutaminase antibody ELISA kits//J. Clin. Pathol. — 2002. — Vol. 55. — P. 488-494.
10. Гудкова Р. Б., Жукова С. Г., Парфенов А. И. и др. Значение антител к пищевым антигенам в диагностике глютеновой энтеропатии//Рос. гастроэнтерол. журн. — 1998. — Т. 2. — С. 12-17.
11. Flekenstein B., Qiao S. W., LarsenM. R. et al. Molecular characterization of covalent complexes betwen tissue transglutaminase and gliadin peptides//J. Biol. Chem. — 2004. — Vol. 279. — P. 17607-17616.
12. Picarelli A., di Tola M., Sabbatella L. et al. Identification of a new coeliac disease subgroup: antiendomysial and anti-transglutaminase antibodies of IgG class in absence of selective 19A deficiency//J. Intern. Med. — 2001. — Vol. 249. — P. 181-188.
13. Kumar V., Jarzabek-Chorzelska M. et al. Celiac disease and immunoglobulin A deficiency: how effective are the serological methods for diagnosis?//Clin. Diagn. Lab. Immunol. — 2002. — Vol. 9. — P. 1295 - 1300.
14. Agardh D., Borulf S., Lennark A. et al. Tissue transglutaminase immunoglobulin isotypes in children with untreated and treated celiac dis-ease//J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. — 2003. — Vol. 36. — P. 77-82.
15. Leon F., Camarero C., Pena R. et al. Anti-transglutaminase IgA ELISA: Clinical Potential and Drawbacks in Celiac Disease Diagnosis//Am. J. Gastroenterol. — 2001. — Vol. 96, № 8. — P. 849-853.
