CC BY
8
применения экспрессного метода сенсибилизации по О. Г. Алексеевой и
В. И. Петкевич с использованием нескольких доз, отличающихся одна
от другой на 1 порядок.
ЛИТЕРАТУРА
Адо А. Д. Общая аллергология. М., 1970.
Алексеева О. Г., Петкевич В. И. — Гиг. и сан., 1972, № 3, с. 64—67.
Гельднер Л. Б., Бажина Ш. Л. — Лабор. дело, 1969, № 12, с. 728.
Дуева Л. А., Гудина Р. В., Алексеева О. Г. — Там же, 1976, № 11, с. 699.
Иличкина А. Г. — Гиг. и сан., 1978, № 1, с. 92—95.
Крыжановская М. В. Методические указания к экспериментальному выявлению аллергенных свойств химических ингридиентов атмосферных загрязнений. Киев, 1968.
Климкина Н. В., Плитман С. И. — В кн.: Биохимические методы исследования в гигиене. М., 1973, с. 87—92.
Рабен А. С., Антоньев А. А. Профессиональная дерматология. М., 1975.
Сосонкин И. Е. Аллергические дерматозы, вызванные химическими факторами. М., 1977.
Фрадкин В. А. Аллергодиагностика in vitro. М., 1975.
Поступила 10/VII 1978 г.
УДК в1в-056-43-02:6в]-078.7
Канд. мед. наук JI. А. Дуева
СПЕЦИФИЧЕСКИЕ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ ТЕСТЫ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ СЕНСИБИЛИЗАЦИИ К ХИМИЧЕСКИМ СОЕДИНЕНИЯМ В ТОКСИКОЛОГО-АЛЛЕРГОЛОГИЧЕСКОМ ЭКСПЕРИМЕНТЕ
Научно-исследовательский институт гигиены труда и профзаболеваний АМН СССР,
Москва
Выявление аллергенных свойств новых химических соединений, выяснение опасности развития сенсибилизации при различных условиях их воздействия на организм и в итоге решение вопросов их гигиенического нормирования с учетом сенсибилизирующего действия — одно из основных направлений профилактики аллергических заболеваний химической этиологии. Если раньше изучение аллергенных свойств химических соединений основывалось преимущественно на результатах тестирования кожи подопытных животных, то в настоящее время имеются все предпосылки для широкого использования в токсикологической практике специфических иммунологических тестов — так называемых методов аллергодиагностики in vitro.
Особенности многих химических соединений (нерастворимость в воде, токсические или раздражающие свойства, сложный состав и др.) определяют необходимость соблюдения ряда условий при их использовании в иммунологических реакциях для исключения денатурирующего или цитотоксиче-ского действия на белки сыворотки и клетки крови. Эти условия могут быть соблюдены путем выбора групповых водорастворимых гаптенов для соответствующих классов химических соединений и специального подбора и проверки рабочих доз гаптенов в соответствующих иммунологических реакциях (О. Г. Алексеева и соавт.). Такие методические приемы создают реальную возможность для изучения аллергенных свойств довольно широкого круга химических соединений и снижают опасность развития неспецифических реакций in vitro, особенно со сложными по составу, а следовательно, и более токсичными химическими композициями.
Разработан значительный круг методов аллергодиагностики in vitro, которые позволяют оценить различные стороны и механизмы иммунного ответа на воздействие химических аллергенов: реакции клеток крови на гаптен, серологические реакции для выявления циркулирующих антигап-
тенных антител, клеточные реакции гиперчувствительности для изучения основных популяций иммунокомпетентных клеток. В практике токсико-лого-аллергологического эксперимента наиболее целесообразно использование комплекса технически простых и чувствительных клеточных и серологических реакций, которые наряду с кожными тестами позволяют одновременно оценить такие стороны иммунного ответа на химический аллерген, как гиперчувствительность замедленного типа, циркулирующие антигап-тенные антитела и реакции клеток-мишеней. При проведении токсиколого-аллергологического эксперимента с применением специфических иммунологических тестов необходимо учитывать динамику развития сенсибилизации. Как правило, сенсибилизация у подопытных животных достигает максимума к 14—20-м суткам опыта с небольшими колебаниями в зависимости от активности и условий воздействия аллергена. Положительные реакции кожи и клеток крови появляются на 5—10 дней раньше, чем антигаптенные антитела сыворотки. В то же время длительное воздействие аллергенов (в хроническом токсикологическом эксперименте) может привести к развитию у сенсибилизированных животных иммунологической толерантности с постепенным снижением и полным исчезновением аллергических реакций. Кроме того, необходимо иметь в виду, что чувствительность и информативность иммунологических тестов с химическими аллергенами в значительной степени зависит от условий постановки реакций и системы учета результата (О. Г. Алексеева и Л. А. Дуева).
Для токсиколого-аллергологического эксперимента технически наиболее простыми являются реакции клеток крови на гаптен in vitro, среди которых на основании широкой экспериментальной апробации ранее уже была рекомендована реакция специфической агломерации лейкоцитов (РСАЛ). Реакция повреждения нейтрофилов (РПН), отражающая, как и РСАЛ, раннюю фазу реакции сенсибилизированных клеток на специфический аллерген, и реакция усиления пиронинофилии лейкоцитов используются в токсикологической практике реже из-за необходимости гистохимической окраски мазков-препаратов. При выполнении РСАЛ и РПН необходимо иметь в виду, что при высокой сенсибилизации подопытных животных обе эти реакции могут заканчиваться лизисом клеток крови и в результате не повышением, а снижением показателя реакции. Вследствие этого более удобна и информативна для изучения сенсибилизации к химическим аллергенам в эксперименте наша микромодификация реакции специфического лизиса лейкоцитов, требующая, как и другие клеточные реакции, не более 0,2 мл крови.
Чувствительным иммунологическим тестом, особенно при изучении химических аллергенов при их ингаляционном воздействии, являются реакции клеток-мишеней, несущих на своей поверхности антитела IgE (реагины), т. е. базофилов крови и тучных клеток соединительной ткани. Поскольку действие на них иммунных комплексов сопровождается нарушением проницаемости клеточных мембран и выбросом в крови различных биогенных аминов, реакции этих клеток по существу -отражают патохимиче-скую фазу сенсибилизации. Среди различных модификаций базофильного теста Шелли и реакции тучных клеток по Шварцу технически наиболее удобной является разработанная нами реакция прямого специфического повреждения базофилов крови, которая позволяет с помощью относительно простых приемов получить взвесь лейкоцитов, приготовить фиксированные мазки-препараты и одновременно учесть все формы повреждения клеток.
При выполнении каких-либо реакций клеток крови на гаптен in vitro для сопоставимости результатов следует придерживаться унифицированного метода учета реакций с использованием показателя отношения процентов поврежденных клеток в опытной (с аллергеном) и контрольной (растворитель без аллергена) пробах.
Среди серологических реакций для выявления антигаптенных антител технически удобной и информативной является реакция специфической мик-
ропрецнпнтации в жидкой среде (РСМП), постановка которой с химическими аллергенами требует использования шкалы их разведений (от 1 : 256 до 1 : 2), приготовленной из максимальной неденатурирующей концентрации растворов. Как показали наши исследования, существенному повыше-* нию информативности РСМП способствует также количественная оценка ее результата по титру гаптена, т. е. по первому из разведений, вызывающему образование микропреципитата и как следствие этого задержку равномерного снижения оптической плотности реагирующей системы. Такая оценка РСМП исключает необходимость вычерчивания графика на каждое исследование и позволяет проводить групповую обработку полученных данных по log, оснований титра. В отличие от РСМП, которая выполняется на фотоэлектрическом колориметре-нефелометре или спектрофотометре, реакция пассивной гемагглютинации (РПГА) требует определенной методической квалификации, особенно на стадиях приготовления эритроцитарных диа-гностикумов с химическими аллергенами, и визуальной оценки результата реакции. При выполнении РПГА необходимо иметь в виду, что недостаточное количество гаптенных группировок на поверхности эритроцита создает возможность развития неспецифических реакций и существенно влияет на результат исследования. Поскольку приготовление эритроцитарных диа-гностикумов возможно и с водонерастворимыми химическими аллергенами, РПГА наиболее целесообразно применять только в тех случаях, когда нет возможности подобрать водорастворимый химический аналог для других серологических реакций. Технически значительно более простой по сравнению с РПГА является разработанная нами микромодификация реакции связывания комплемента, позволяющая проводить исследования с химическими соединениями в микротитраторе со всеми компонентами реагирующей системы в количестве 0,02 мл (общий объем 0,08 мл). При этом гаптен используют в дозе, исключающей цнтотоксическое и антикомплементарное Й действие, а комплемент — в титре, вызывающем умеренный гемолиз эритроцитов. Поскольку взаимодействие антител и специфического гаптена происходит с участием комплемента, снижение уровня последнего проявляется в задержке реакции гемолиза.
Аналогом гиперчувствительности замедленного типа in vitro может служить реакция торможения миграции лейкоцитов крови, в частности наиболее простая ее микромодификация, которая требует небольшого количества (0,2 мл) крови и выполняется в пятиканальных кассетных миграционных патронах. Реакция специфической бласттрансформации лимфоцитов крови до настоящего времени остается технически сложной, поэтому в токсикологов аллергологическом эксперименте чаще проводят гистологическое изучение препаратов кожи и лимфатических узлов от сенсибилизированных животных с учетом властных форм лимфоцитов.
В последнее время все большее внимание привлекают клеточные реакции гиперчувствительности in vitro, позволяющие оценить количество и функцию различных субпопуляций иммунокомпетентных клеток. Среди различных модификаций реакций специфического бляшко- и розеткообразо-вания для токсиколого-аллергологического эксперимента могут быть использованы модификация теста Ерне с химическими аллергенами Н. В. Русакова и реакция смешанного розеткообразования, разработанная Т. И. Гришиной и С. Мюллером для клинических исследований. Собственный опыт по применению реакции смешанного розеткообразования в эксперименте показал возможность ее использования при замене эритроцитов барана на эритроциты кролика, которые являются маркерами для Т-клеток морских свинок. Для выявления специфических розеткообразующих клеток (В-кле-ток, продуцирующих антигаптенные антитела) в соответствии с методикой ^ применяли частицы зимозана, обработанные химическим аллергеном, в частности 0,1 % раствором хлорного хрома.
Необходимо отметить, что поскольку выраженность специфических аллергических реакций in vitro (log2 титра антигаптенных антител, величина
показателя клеточных реакций) отражает уровень сенсибилизации подопытных животных, они могут быть использованы не только для выявления аллергенных свойств химических соединений, но и для оценки их аллергенной активности и выяснения сенсибилизирующего эффекта при различных путях воздействия на организм. Применение в реакциях in vitro аллергенных ингредиентов полимерных материалов или других сложных по составу химических продуктов при тестировании животных, сенсибилизированных полными композициями, позволяет подойти к решению вопроса гигиенической регламентации их состава с целью снижения аллергенной активности (3. А. Волкова и соавт.). В то же время зависимость уровня сенсибилизации от дозы химического аллергена и путей его воздействия дает основание для использования специфических иммунологических тестов при гигиеническом нормировании химических соединений с учетом порога аллергенного действия (О. Г. Алексеева и Л. А. Дуева; Т. В. Жукова и Г. Я. Ильченко). При этом более высокая чувствительность реакций in vitro по сравнению с кожными тестами позволяет более строго подойти к величине Limai , тем более что при слабо выраженной сенсибилизации возможно исчезновение замедленной гиперчувствительности при сохранении продукции гуморальных антигаптенных антител. Применение в токсиколого-аллергологическом эксперименте различных специфических иммунологических тестов помогает не только решению гигиенических вопросов, но и более глубокому пониманию механизмов индукции иммунного ответа на воздействие химических аллергенов.
ЛИТЕРАТУРА
Алексеева О. Г., Дуева Л. А. Аллергия к промышленным химическим соединениям. М., 1978.
Алексеева О. Г., Дуева Л. А., Поляк Н. Р. и др. — Гиг. и сан., 1976, № 6, с. 51—53. Волкова 3. А., Дуева Л. А., Зильфян 3. Н. — Там же, 1975, № 4, с. 45—48. Гришина Т. И., Мюллер С. — Бюлл. экспер. биол., 1978, № 4, с. 503—506. Жукова Т. В., Ильченко Г. #. — В кн.: Химический фактор — внешняя среда —
здоровье человека. Ростов-н/Д., 1975, с. 24—26. Русаков Н. В.— В кн.: Гигиена воды и санитарная охрана водоемов. М., 1973, с. 20—21.
Поступила 22/1X 1978 г.
УДК 615.285.7.074:543.544
A.A. Красных, Д. А. Швец ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВАЛЕКСОНА МЕТОДОМ ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений, Воронеж
Валексон (волатон, байтион, ромин) — о,о-диэтилтиофосфорил-о-(а-ци-анобензальдоксим) — инсектицид с широким спектром действия. Для идентификации валексона применяют газожидкостную хроматографию (В. В. Ле-щев и Б. А. Королев) и хроматографические методы (А. И. Быховец; Т. М. Петрова), однако это затруднительно при работе с зерном, травой и почвой, которая содержит большое количество гумуса.
Предлагаемый метод основан на экстракции препарата органическим растворителем, осаждении коэкстрактивных веществ коагулирующим раствором и хроматографировании в тонком слое силикагеля Л5/40м («Хема-пол», ЧССР).
Место локализации пестицида обнаруживают после опрыскивания хро-матограммы одним из следующих проявляющих реактивов:
— 0,2 % раствором хлористого палладия в 0,01 н. HCl. Пластинку после обработки облучают УФ-светом до четкого выявления пятен валексона желтого цвета с коричневой окантовкой;
