CC BY
135
УДК: 616-006.484:615.37
СПЕЦИФИЧЕСКАЯ ПРОТИВООПУХОЛЕВАЯ ИММУНОТЕРАПИЯ В КОМПЛЕКСНОМ ЛЕЧЕНИИ БОЛЬНЫХ СО ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫМИ СУПРАТЕНТОРИАЛЬНЫМИ ГЛИОМАМИ
С.П. Бажанов, В.Е. Олюшин, А.Ю. Улитин, Б.И. Сафаров, Д.М. Ростовцев
Российский научно-исследовательский нейрохирургический институт им. проф. А.Л. Поленова,
г. Санкт-Петербург 191104, г. Санкт-Петербург, ул. Маяковского, 12, e-mail: [email protected]
Представлен метод специфической противоопухолевой иммунотерапии на основе аутологичных дендритных клеток в комплексном лечении 55 пациентов со злокачественными полушарными глиомами супратенториальной локализации (41 глиобластома, 14 анапластических астроцитом). Все пациенты имели опухоль более 5 см в диаметре. Специфическая противоопухолевая иммунотерапия проводилась по оригинальной методике и включала аутологичные дендритные клетки, нагруженные опухолевыми антигенами, а также лизат клеток опухоли. Курс лечения заключается во внутрикожном введении специфической противоопухолевой вакцины на 10-12-й день послеоперационного периода и составляет не менее 3 инъекций. Курс лечения повторяется каждые 2-3 мес. Иммунологический статус исследован до и после проведения курсов вакцинотерапии. Применение специфической противоопухолевой иммунотерапии в комплексном лечебном подходе улучшает перспективы лечения больных со злокачественными полушарными глиомами.
Ключевые слова: глиобластома, анапластическая астроцитома, иммунотерапия, дендритные клетки.
SPECIFIC ANTITUMOR IMMUNOTHERAPY IN THE COMPLEX TREATMENT OF PATIENTS WITH CEREBRAL
HEMISPHERE MALIGNANT GLIOMAS S.P. Bajanov, V.E. Oliushin, A.Yu. Ulitin, B.I. Safarov, D.M. Rostovcev A.L. Polenov Russian Research Neurosurgical Institute, St. Petersburg 12, Mayakovsky Street, 191104-St. Petersburg, e-mail: [email protected]
The aim of the research is to investigate activation of antitumor immune response efficiency using professional antigen-presenting autologous dendrite cells in the complex treatment of patients with cerebral hemisphere malignant gliomas. We have analyzed 55 cases of patients with malignant gliomas (41 - glioblastomas, 14 - anaplastic astrocytomas) who received a complex treatment with specific immunotherapy use. All the patients were hospitalized at Late stage of disease and tumor size exceeded 5 cm. Specific antitumor immunotherapy was conducted in accordance with original methodic, including autologous dendrite cells with tumor antigens and tumor cells lysate. Treatment course included intradermal introduction of dendrite cells at the 10-12 day after the operation. The treatment included not less than 3 injections. The course of treatment was repeated every 2-3 months. The immunological status was tested before and after courses of immunotherapy. Specific antitumor immunotherapy included into complex treatment of malignant gliomas allows to increase disease remission, life quality being satisfactory.
Key words: glioblastoma, anaplastic astrocytoma, immunotherapy, dendrite cells.
Опухоли головного мозга занимают 9-10-е место в структуре онкологической заболеваемости в развитых странах. Частота первичных опухолей головного мозга составляет 7,42-13,9 на 100 тысяч населения [1, 4, 8]. Глиальные опухоли относятся к наиболее часто встречающимся новообразованиям головного мозга и составляют в среднем от 35 до 46 % [4, 8, 10]. Злокачественные глиомы астроцитарного ряда (анапластическая астроцитома и глиобластома) составляют 55-60 % всех первичных глиальных опухолей [11].
Сложность проблемы комплексного лечения злокачественных глиальных опухолей заключается в низкой эффективности схем лечения, разработанных на базе традиционно сложившихся представлений об опухоли как местном процессе, обусловленном неконтролируемым разрастанием тканей. При этом все усилия, включающие современные технологии, направлены на разрушение опухолевого очага. Опыт показывает, что подобный подход к лечению злокачественных глиом головного мозга не способствует эффективному снижению уровня
летальности в отдаленном послеоперационном периоде. Это положение определяет стремление к поискам новых терапевтических технологий, способствующих улучшению результатов лечения пациентов с глиальными опухолями. Быстрый прогресс биотехнологической науки и иммунологии в последнее десятилетие позволяет применять передовые достижения в нейрохирургической практике. Из новых методов комплексной терапии злокачественных глиом наибольшее внимание привлекает разработка способов специфической противоопухолевой иммунотерапии [6]. Этот метод биотерапии в настоящее время переживает свое «второе» рождение. Связано это, с одной стороны, с развитием технологий получения рекомбинантных белков, а с другой - с коррекцией показаний к применению вакцин.
В 80-90-х годах XX века вакцинотерапия применялась у больных с диссеминированными формами опухолей, однако не было получено положительных клинических результатов. В настоящее время большинство вакцин проходят клинические испытания на пациентах с местнораспространенными и локальными формами опухолей, однако, по данным литературы, большинство исследований касается экспериментальных работ, и лишь небольшую часть составляют клинические сообщения [13]. Долгое время считалось, что головной мозг человека
- иммунологически «привилегированный» орган, однако целый ряд работ последних лет свидетельствует, что эта точка зрения не полностью отражает сущность иммунных процессов в мозге. Относительна и проницаемость гематоэн-цефалического барьера (ГЭБ) для лимфоцитов, так как активированные лимфоциты способны продуцировать энзимы, влияющие на проницаемость ГЭБ, в посткапиллярных венулах активированные Т-хелперы могут проходить даже через интактный ГЭБ [12]. Очень сомнителен тезис об отсутствии в мозге клеток, способных к презентации антигена, потому как доказана возможность представления антигенов по крайней мере тремя видами клеток [9]. Во-первых, это дендритные клетки костно-мозгового происхождения, которые локализуются в головном мозге вдоль крупных кровеносных сосудов и в белом веществе. Во-вторых, это могут быть
эндотелиальные клетки кровеносных сосудов мозга, способных к презентации антигенов, ассоциации их с антигенами главного комплекса гистосовместимости и поддержанию клонального роста специфических к этим антигенам Т-клеток. И, в-третьих, в качестве антигенпред-ставляющих могут выступать клетки микро-и астроглии [14]. Однако иммунная система не способна справиться с опухолью, потому что на ранних этапах развития опухолевая ткань не распознается как чужеродная, а на более поздних суммарное количество опухолевых клеток значительно превышает количество натуральных киллеров. Кроме того, на более поздних стадиях развития опухоль начинает выделять в большом количестве факторы, подавляющие функции эффекторных лимфоцитов [5].
При прогрессировании опухолевого процесса иммунный ответ перестраивается таким образом, что происходит подавление активности факторов клеточного иммунитета и, как следствие, активация гуморального иммунитета. который оказывается абсолютно неэффективным в противоопухолевой защите [5]. Наиболее эффективным противоопухолевым оружием является специфический клеточный иммунитет, базирующийся на активации цитотоксичских Т-лимфоцитов [7]. Для эффективного противоопухолевого иммунитета недостаточно выработки цитотоксических, направленных против опухолевой мишени лимфоцитов, необходимо, чтобы они мигрировали в возникающие очаги опухоли и эффективно взаимодействовали с мишенью.
В последние годы большое внимание уделяется разработке стратегий, направленных на активацию противоопухолевого иммунного ответа. Одним из таких направлений является использование вакцин на основе аутологичных дендритных клеток.
Материал и методы
Объектом данного изучения стала группа из 55 пациентов с глиобластомами и анапластиче-скими астроцитомами, находившихся на лечении в отделении хирургии опухолей головного и спинного мозга РНХИ им. проф. А.Л. Поленова в период с 2000 по 2008 г. В исследуемой группе было 32 (58,2 %) мужчины и 23 (41,8
%) женщины. Возраст пациентов составил от 18 до 69 лет (медиана - 46 лет). Доля пациентов с глиобластомами составила 41 (74,5 %), с анапластическими астроцитомами 14 (25,4 %) наблюдений. В группе пациентов с глиобласто-мами было 24 (75,0 %) мужчины и 17 (73,9%) женщин, с анапластическими астроцитомами
- 8 (25,0 %) мужчин и 6 (26,1 %) женщин.
Все больные поступали в институт в поздней стадии заболевания с выраженными или начальными симптомами дислокации и имели опухоль размерами более 5 см в диаметре, распространявшуюся, как правило, на две или три доли мозга. Комплекс предоперационного обследования больных включал детальное исследование соматического и неврологического статусов, осмотр нейроофтальмологом, отоневрологом, лучевые методы обследования (КТ и МРТ головного мозга), электроэнцефалографию. Всем пациентам проводилась костно-пластическая трепанация черепа, с рациональным радикализмом удаления опухоли. При глубинных локализациях опухоли, а также для оценки степени радикальности ее резекции применялась интраоперационная нейросонография. В ряде случаев применялась электрокортикография, особенно в наблюдениях с эпилептическим синдромом. Комплексное лечение включало также цитотоксическую химиотерапию в режиме монохимиотерапии или полихимиотерапии и лучевую терапию в дозе 55-60 Гр.
Всем больным исследуемой группы в послеоперационном периоде проведена специфическая противоопухолевая иммунотерапия на основе аутологичных дендритных клеток. Технология защищена патентом № 2192263 (10.11.02). Заявка №2 000122041, приоритет от 17.08.00. Оригинальным в предлагаемом методе лечения является способ представления опухолевых антигенов дендритным клеткам, заключающийся в параллельном использовании эндоцитоза при соинкубации их с дендритными клетками и принудительного введения внутрь клеток с помощью электропорации. Протокол клинического применения предлагаемой технологии лечения состоит в следующем: во время операции забирают фрагмент опухоли не менее 1 см3, из этого же участка опухоли берут материал для гистологического исследования и
ткань, предназначенную для создания вакцины, которую отправляют в лабораторию клеточной биологии только при подтверждении диагноза опухоли. Полученный фрагмент опухолевой ткани помещают в стерильный физиологический раствор и в течение 24 ч передают для приготовления антигенного материала.
Для приготовления антигена фрагмент опухоли подвергают рентгеновскому облучению в дозе 200 Гр и диссоциируют на клетки. Полученные опухолевые клетки отмывают и разрушают путем повышения рН среды, в которой находятся клетки, до 11,5, а затем понижением рН этой среды до 6,5. Полученный таким образом лизат белков используют в качестве источника антигенного материала. Перед каждым сеансом лечения производят забор 40-60 мл периферической крови больного в шприц, содержащий 30 ЕД раствора гепарина на 1 мл крови. Из взятой крови не позднее чем через 6 ч выделяют моноциты, которые культивируются в течение 7 дней с ростовыми факторами (гранулоцит-макрофаг колониестимулирующий фактор и интерлейкин-4 в количестве 1000 ед/мл) с постоянным контролем и сменой среды до получения зрелых дендритных клеток. Доказательством получения зрелых дендритных клеток являлись следующие критерии: 1) появление (увеличение) поверхностных маркеров CD 83, CD 80, CD 11С, тА DR, ^А АВС, определяемых с помощью техники проточной цитофлуометрии; 2) способность полученных дендритных клеток стимулировать синтез ДНК в аллогенных Т-лимфоцитах с помощью включения радиоактивномеченого тимидина.
На 6-й день к дендритным клеткам добавляют приготовленный из опухоли антигенный материал, который в этот же день вводят внутрь дендритных клеток с помощью электрического разряда (электропорация). Параллельно проводится активация аутологичных лимфоциотов с помощью фитогемагглютинина. Цель процедуры - активация возможно большего числа Т-лимфоцитов при преимущественной стимуляции ТЪ-1 клеточного пути иммунного ответа. Введение специфической противоопухолевой вакцины проводится на 10-12-й день послеоперационного периода (столько времени уходит на приготовление аутологичной вакцины). Введе-
ние осуществляется подкожно паравертебраль-но в межлопаточной области.
Для исследования первичного иммунологического статуса за несколько дней до проведения оперативного вмешательства у пациентов бралась кровь из вены натощак. После проведения курса вакцинотерапии (на 21-25-е сут после оперативного вмешательства) иммунологический статус исследовался повторно (11 человек).
Количество лейкоцитов определялось визуально с помощью светового микроскопа в счетной камере Горяева. Морфологическое исследование лейкоцитов проводили в мазках крови, окрашенных по Романовскому-Гимзе с подсчетом лейкоцитарной формулы.
Для оценки функционирования иммунной системы применялись методы выявления популяционной и субпопуляционной принадлежности лимфоцитов периферической крови. Идентифицировали лимфоидные клетки, несущие следующие кластерные дифференциров-ки: СD3+ (Т-лимфоциты); CD3+, CD16+, CD 56+ (ТЫК-клетки); CD4+ (Т-хелперы); CD3+, CD8+ (Т-киллеры); CD3-CD8+ (активированные ЫК-клетки). Рассчитывали соотношение CD4+/CD8+, имеющее важное значение при диагностике дисфункциональных нарушений иммунной системы. Определяли параметры цитокинового звена иммунитета (интерферон-а, интерферону) и функциональную активность ЫК-клеток (цитотоксическую активность). Все показатели представлялись в абсолютных и относительных величинах.
Результаты и обсуждение
Отдаленными считали результаты хирургического лечения, интерпретируемые не ранее 6 мес после выписки больного из лечебного учреждения. Катамнез прослежен у 55 пациентов на протяжении от 6 до 60 мес. Сбор информации о течении отдаленного периода заболевания осуществлялся путем осмотра больных в клинике института, на дому, почтовым анкетированием, опросом больных и их родственников по телефону. В процессе лечения пациенты в обеих группах получили от 1 до 8 курсов иммунотерапии. Наибольшая выживаемость была у пациентов, получивших более
48
40
□
□
1 ±Э1с). Эеу.
1 1 ІБІСІ. Егг. □ Меап
20 --------------------■-------------------■--------------------
До печения После лечения
Основная группа
Рис. 1. Показатель функциональной активности КК-клеток до и после проведения иммунотерапии
0 10 20 30 40 50 60 70
Месяцы
Рис. 2. Показатель выживаемости в зависимости от гистоструктуры опухоли
трех курсов лечения. При изучении показателей иммунитета достоверных различий показателей клеточного, гуморального звеньев иммунного ответа, параметров цитокинов до и после проведения вакцинотерапии отмечено не было. Однако функциональная активность КК-клеток (цитотоксическая активность) в 90,9 % случаев (10 пациентов) была значительно выше после проведения курса иммунотерапии (рис. 1).
Несомненно, продолжительность жизни больных также зависит от гистоструктуры опухоли. Доля выживших в группе больных с глиобластомами (ГБ) в течение 12 мес составила 60 %, в течение 24 мес - 53 %, 30 мес - 36 %. Среди пациентов с анапластическими астроци-
томами (АА) эти показатели составили 90, 67 % и 45 % соответственно (рис. 2).
При проведении специфической противоопухолевой вакцинотерапии ни в одном из наблюдений серьезных осложнений не отмечено. Присутствовали стандартные реакции на введение в организм вакцин: возникновение незначительной гипертермии на фоне введения антигенного материала (устраняется приемом обычных доз нестероидных противовоспалительных препаратов - аспирин, мелоксикам); эритема в месте введения антигенного материала (устраняется использованием антигистамин-ных препаратов в стандартных дозировках).
Таким образом, пациенты из сравнительно небольшой, но однородной группы с анапла-стическими астроцитомами и глиобластомами получили комплексное лечение, включающее хирургию, химиотерапию, лучевую терапию, специфическую противоопухолевую иммунотерапию на основе аутологичных дендритных клеток с опухолевыми антигенами. Основной целью вакцинотерапии является базисная иммунотерапия опухолей, но важное значение имеет также снижение побочных эффектов традиционной противоопухолевой терапии (миело-супрессия, иммуносупрессия), коррекция ее общетоксического действия, антиоксидантный эффект. Сравнительно небольшое количество наблюдений и скромный опыт применения вакцинотерапии позволяют сделать осторожный вывод о значительной результативности метода, который по уровню эффективности и безопасности не уступает существующим мировым
стандартам специфической иммунотерапии опухолей.
ЛИТЕРАТУРА
1. Алексеев А.Г. Эпидемиология первичных опухолей центральной нервной системы в Республике Татарстан (клиническая эпидемиология и организация медицинской помощи): Дис. ... канд. мед.наук. СПб., 2005. 198 с.
2. Лосев Ю.А. Эпидемиология первичных опухолей головного мозга в сельской местности (на модели Ленинградской области): Дис. ... канд. мед. наук. СПб., 2003. 188 с.
3. Молчанов О.Е., Попова И.А., Козлов В.К., Карелин М.И. Современные тенденции иммунотерапии злокачественных опухолей. СПб.: Изд-во С.-Петербургского ун-та, 2001. 88 с.
4. ОлюшинВ.Е. Комплексное лечение больных злокачественными полушарными глиомами полушарий большого мозга // Новые технологии в нейрохирургии: Материалы VII Международного симпозиума. СПб., 2004. С. 164-165.
5. Олюшин В.Е., Тиглиев Г.С., Острейко О.В., Филатов М.В. Комбинированная специфическая противоопухолевая иммунотерапия в лечении больных с продолженным ростом глиобластом: результаты пилотного исследования // Материалы III съезда нейрохирургов России. СПб., 2002. С. 135-136.
6. Улитин А.Ю. Эпидемиология первичных опухолей головного мозга в Санкт-Петербурге: Дис. . канд. мед. наук. СПб., 1997. 232 с.
7. Цымбалюк В.И., Пичкур Л.Д., Руденко В.А. и др. Иммунологические аспекты трансплантации эмбриональной нервной ткани // Вопросы нейрохирургии. 2001. №.3. С. 28-31.
8. Шебзухова Л.М. Эпидемиология и диагностика опухолей головного мозга в Кабардино-Балкарии: Дис. ... канд. мед. наук. СПб., 1995. 218 с.
9. Annegers J.F., Srhoenberg B.S., Okazoki H., KurlandL.T. Epidemiologic study of primary intracranial neoplasms // Arch.Neurol. 1981. Vol. 38, № 4. P. 217-219.
10. Bradburu M., Westrop RJ. Factors influencing exit of substances from cerebrospinal fluid into deep cervical lymph of the rabbit // J. Physiol. Lond. 1983. Vol. 339. P. 519-534.
11. Merchant R.E., Merchant L.H., Cook S.H. et al. Intralesional infusion of limfokine-activated killer (LAK) cells and recombinant interleukin-2 for treatment of patients with malignant brain tumors // J. Neurosurg. 1988. Vol. 23, № 6. Р. 725-732.
12. Ransohoff R.M., Estes M.L. Astrocyte expression of major histocompatibility complex gene products in multiple sclerosis brain tissue obtained by stereotactic biopsy // Arch Neurol. 1991. Vol. 48, № 12. P. 1244-1246.
Поступила 2.06.09
