CC BY
117
_____________УЧЕНЫЕ ЗАПИСКИ КАЗАНСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
Том 152, кн. 3 Естественные науки
2010
УДК 541.12.038.2:536.75:536.728
СПЕКТРОСКОПИЯ ЯМР И АНИЗОТРОПИЯ ХИМИЧЕСКИХ СДВИГОВ 13C В ТВЕРДОЙ ФАЗЕ L-a-Ala-DL-Val
И.З. Рахматуллин, А.Р. Юльметов, А.В. Аганов, В.В. Клочков
Аннотация
В статье представлены результаты исследования пространственного строения дипептида L-a-Ala-DL-Val в твердой фазе методом спектроскопии ЯМР 13С CP/MAS. С использованием одно- и двумерной ЯМР (COSY и HSQC) спектроскопии проведено отнесение сигналов ЯМР 1Н и 13С дипептида L-a-Ala-DL-Val, растворенного в воде (D20). Описаны спектры ЯМР 13С CP/MAS (125.69 МГц) дипептида, приведены результаты сравнительного анализа величин химических сдвигов 13С aCH или aCH2 углеродных атомов дипептида L-a-Ala-DL-Val в растворе и порошке. Определены значения компонентов тензоров химических сдвигов атомов углерода в обоих аминокислотных остатках (L-a-Ala и DL-Val) для дипептида L-a-Ala-DL-Val в твердой фазе.
Ключевые слова: олигопептиды, ЯМР 1Н и 13С спектроскопия, двумерная ЯМР (COSY и HSQC) и ЯМР 13С CP/MAS спектроскопия, химический сдвиг, анизотропия, тензор.
Введение
Хорошо известно, что биологическая активность протеинов связана с их пространственным строением. Изучение конформаций олигопептидов, содержащих в цепи от двух и более аминокислотных остатков, важно в том плане, что их можно рассматривать в качестве структурных блоков протеинов и знание их строения может быть использовано для предсказания конфигурации цепей полипептидов. Известно также, что некоторые короткие пептидные последовательности, синтезируемые клеткой, являются частью иммунной системы живого организма [1-4].
Данные о координатах атомов протеинов в подавляющем большинстве случаев определяются методом рентгено-структурного анализа в твердой фазе. Отсюда задача определения структурных параметров олигопептидов в твердой фазе независимыми методами имеет важное практическое значение.
Интерпретация большинства экспериментальных результатов ЯМР твердого тела протеинов требует хорошо охарактеризованных тензоров анизотропии химических сдвигов ЯМР 13С аминокислотных фрагментов [5]. Знание тензоров химических сдвигов ядер С(а) и С(Р) в примыкающих цепях белков является существенным при изучении структуры и динамики белков с использованием ЯМР-спектроскопии. К сожалению, в литературе подобная информация представлена скудно, что говорит о важности экспериментального определения тензоров анизотропии химических сдвигов ЯМР 13С атомов углерода, входящих в различные наборы аминокислотных остатков.
Целью настоящей работы являлось определение и анализ тензоров анизотропии химических сдвигов 13С в порошкообразном образце дипептида L-a-Ala-DL-Val (L-a-аланин - DL-валин) на основе данных CP/MAS ЯМР 13С спектроскопии.
Экспериментальная часть
Регистрация ЯМР 'H (500 МГц) и 13C (125.69 МГц) спектров проводилась на ЯМР-спектрометре высокого разрешения AVANCE-500 фирмы «Bruker». Спектрометр работает в режиме внутренней стабилизации поля по линии резонанса дейтерия (2H). При записи протонных спектров в изотропном растворителе №О) использовали 90°-импульсы и насыщение сигнала воды либо 30°-им-пульсы без насыщения сигнала растворителя. Задержки между импульсами составляли 2 с, число накоплений - от 4 до 100, ширина спектра - 11 м.д., число точек - 26832. При записи спектров ЯМР 13C использовали 30°-импульсы и развязка от протонов (WALTZ-16). Задержки между импульсами равнялись 2 с, число накоплений - 19485, ширина спектра - 236.6 м.д., число точек - 65536. При обработке спектра применяли цифровую экспоненциальную фильтрацию с константой 3 Гц. Одномерные спектры регистрировались при стабилизированной температуре 25 °C.
Спектры ЯМР 13С CP/MAS (125.69 МГц) дипептида в твердом состоянии (порошок) снимали при комнатной температуре на том же ЯМР-спектрометре. Регистрация спектров проводили при различных скоростях вращения. Число накоплений - от 64. В качестве внешнего стандарта использовали ЯМР-сигнал адамантана.
Обсуждение результатов
В качестве образца исследования был взят дипептид, состоящий из двух аминокислот L-a-аланина и DL-валина. Структурная формула дипептида L-a-Ala-DL-Val приведена на рис. 1.
Рис. 1. Структурная формула дипептида Ь-а-Л1а-БЬ-Уа1
Основным источником уширения линий ЯМР в твердых телах является ди-поль-дипольное взаимодействие ядерных спинов. Спектральную информацию об анизотропии этих взаимодействий можно получить только из спектров ЯМР твердых тел (монокристаллов), но в них линии широкие, и, следовательно, положения линий в большинстве случаев не могут быть измерены с точностью, достаточной для извлечения необходимой информации. Для экспериментального получения такого рода информации был разработан целый ряд методов [5].
Рис. 2. ЯМР 1Н (500 МГц, AVANCE-500, «Bruker») спектр дипептида L-a-Ala-DL-Val в растворе D2O. Т = 298 К, 0 м.д. соответствует сигналу ЯМР 1Н ТМС; сигналы, отмеченные буквой «а», относятся к аланину, «в» - к валину, звездочкой обозначены сигналы примесей
Для достижения поставленной в работе цели была проведена серия экспериментов:
а) запись одномерного спектра 'Н ЯМР дипептида L-a-Ala-DL-Val в растворе D2O (относительная простота в расшифровке ЯМР-спектра);
б) проведение двумерного эксперимента ЯМР :Н-:Н COSY L-a-Ala-DL-Val в растворе (для определения констант косвенных спин-спиновых взаимодействий между близлежащими протонами и отнесения спектральных линий к соответствующим ядрам молекулы);
в) регистрация одномерных спектров С ЯМР в растворе D2O и двумерного спектра HSQC для ядер 13С и :Н (для отнесения спектральных линий к соответствующим парам ядер 13С и :Н молекулы);
г) запись одномерных спектров ЯМР С КП/ВМУ поликристаллического (порошка) образца дипептида L-a-Ala-DL-Val (образец вращается вокруг оси, расположенной под углом 54°44' к направлению внешнего магнитного поля).
На рис. 2 приведен ЯМР :Н спектр дипептида L-a-Ala-DL-Val в растворе D2O. В спектре ЯМР :Н присутствуют многочисленные расщепленные сигналы, обусловленные сложной химической структурой соединения. Здесь имеются сигналы от примесей, находящихся в растворе D2O: при 5 = 1.05 м.д. и при 5 = 3.5 м.д., так как если принять интегральную интенсивность сигнала СЩа) (5 = 4.0 м.д.) за единицу, то интегральные интенсивности этих сигналов окажутся много меньшими единицы. При значении 5 = 4.7 м.д. наблюдается самый интенсивный сигнал, и без сомнения можно предположить, что это сигнал от незамещенных протонов в растворителе (D2O). Сигналы от групп ОН, Н^
JL
Рис. 3. ЯМР Н- Н COSY (500 МГц, AVANCE-500, «Bruker») спектр дипептида L-a-Ala-DL-Val в растворе D2O. Т = 298 К
и NH в спектре не наблюдаются вследствие быстрого обмена с ядрами дейтерия (2D) растворителя. Отнесение сигналов для CH- и C^-групп для разных молекул основано на литературных данных [6-8], согласно которым сигналы при значениях химического сдвига от 0 до 1.5 м.д. в спектре ЯМР принадлежат C^-группам, а сигналы в остальной области спектра ЯМР - CH-группам.
Более детальное определение положения линий, соответствующих CH3- и CH-группам было осуществлено с использованием данных двумерного эксперимента ЯМР 1Н-1Н COSY (рис. 3). Кросс-пики, наблюдаемые в двумерном ЯМР ^^Н COSY спектре, обусловлены спин-спиновым взаимодействием между близлежащими группами протонов. В структуре дипептида присутствуют три CH3-группы: два от аминокислотного остатка Val и один от остатка Ala. В правой области спектра при 5 = 0.5 м.д. (рис. 2) имеются два близко расположенных дуплета. В предположении, что это сигналы C^-групп от Val, так как эта область спектра лежит в диапазоне C^-групп для Val [7-9] (в дипептиде имеется только две близко расположенные CH3-группы). На основании анализа кросс-пиков можно уверенно считать, что сигнал с 5 = 2.0 м.д. относится к группе СрН(в), а сигнал с 5 = 3.9 м.д. - к СЩв) от Val. Аналогично было сделано отнесение линий СН3(а) (5 = 1.4 м.д.) и СЩа) (5 = 4.0 м.д.) к группам протонов аминокислотного остатка Ala (сигналы, отмеченные буквой «а», относятся к аланину, «в» - к валину).
Рис. 4. ЯМР 13С (125.69 МГц, ЛУЛМСБ-500, «Бткеп>) спектр дипептида Ь-а-Л1а-БЬ-Уа1 в растворе Б20. Т = 298 К, 0 м.д. соответствует сигналу ЯМР 13С ТМС
На рис. 4 приведен ЯМР 13С спектр дипептида L-a-Ala-DL-Val в растворе D2O. Углеродные ядра метильных групп CH3(а) и CH3(в) резонируют при 5 = 17.0 и 20.0 м.д., CpH^) - при 5 = 30.0 м.д., Co-Ща) - при 5 = 50.0 м.д., СЩв) -при 5 = 61.0 м.д. Карбонильные атомы углеродов имеют химические сдвиги CO^) при 5 = 170.0 м.д., а CO^) - при 5 = 180.0 м.д. Отнесение сигналов к соответствующим ядрам 13С дипептида L-a-Ala-DL-Val сделано с помощью двумерного эксперимента HSQC [10, 11] для ядер 13С и :Н (рис. 5), который позволяет идентифицировать спектральные линии соответствующих пар ядер 13С и 1Н молекулы (сигналы расположены напротив соответствующих пар ядер).
Отнесение сигналов ЯМР 13С углеродных атомов С=О в соответствующих аминокислотных фрагментах было проведено на основе двумерных ЯМР Н- С HMBC экспериментов [11].
На рис. 6 приведены ЯМР 13С спектры в растворе D2O и CP/MAS ЯМР 13C порошка дипептида L-a-Ala-DL-Val. Как следует из этого рисунка, так же, как и в случае с дипептидами yGlu-Trp (гамма глютомат - триптофан) и Glu-Trp (глютомат - триптофан) [12], смена фазового состояния (раствор и твердая фаза) приводит лишь к небольшим изменениям величин химических сдвигов 13С углеродных атомов дипептида L-a-Ala-DL-Val. Отсюда отнесение сигналов, сделанных для углеродных атомов С=О, СИ, CpH и CH3 дипептида L-a-Ala-DL-Val в растворе, мы можем использовать при отнесении этих сигналов для дипептида L-a-Ala-DL-Val в порошке (поликристалле).
Уменьшение скорости вращения образца приводит к появлению в спектрах CP/MAS ЯМР C порошков боковых сигналов от каждого из углеродных атомов вещества. На рис. 7 приведен CP/MAS ЯМР 13C спектр порошка дипептида L-a-Ala-DL-Val, записанного при различных скоростях вращения образца. Из рис. 7 отчетливо видно, что при низких частотах вращения образца появляются боковые полосы сигналов, относящиеся к карбоксильным атомам углеро-дов дипептида L-a-Ala-DL-Val. При увеличении частоты вращения (14 кГц) эти полосы наблюдаются вне области наблюдения основных сигналов, а интенсивность их очень мала.
СНз(а)
20
З0
40-
"50-
55'
СаН(а)СаН(в) _______ill__
CH3(a) сН3(в)
СрН(в)
—*
-І
0.5 м.д.
Рис. 5. Двумерный ЯМР Н- С ЖрС спектр дипептида Ь-а-ЛІа-БЬ-УаІ в растворе Б20. Т = 298 К. Сверху расположен спектр ЯМР *Н, а слева (вертикально) - спектр ЯМР 13С
25
З5
45
60-
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
СН3(в) СаН(в) СаН(а) СрН(в)
С0(в) С0(а)
....*.....
СН3(а)
Рис. 6. ЯМР 13С (125.69 МГц, AVANCE-500, «Bruker») спектр дипептида L-a-Ala-DL-Val в растворе D2O (вверху) и CP/MAS ЯМР 13C (125.69 МГц, AVANCE-500, «Bruker») спектр порошка (внизу) дипептида L-a-Ala-DL-Val (скорость вращения образца -14 кГц). Т = 298 К, 0 м.д. соответствует сигналу ЯМР 13С ТМС
Рис. 7. CP/MAS ЯМР 13C (125.69 МГц, AVANCE-500, «Bruker») спектр порошка дипептида L-a-Ala-DL-Val при различных скоростях вращения образца (сверху вниз скорости вращения образца равны 3, 2 и 14 кГц). Т = 298 К, 0 м.д. соответствует сигналу ЯМР 13С ТМС
Тензор анизотропии химического сдвига может быть определен из одномерного CP/MAS ЯМР 13C спектра, полученного при медленной скорости вращения образца. Для определения тензора экранирования ядер С=О, входящих в состав дипептида L-a-Ala-DL-Val, были проведены расчеты теоретических CP/MAS ЯМР C спектров с помощью программы ADC, входящей в состав программного обеспечения ЯМР-спектрометра «AVANCE-500» фирмы «Bruker». С помощью этой компьютерной программы можно произвести подгонку теоретических сигналов и сигналов, полученных экспериментально, задавая компоненты тензора экранирования. Таким способом были найдены наиболее оптимальные значения компонентов тензора экранирования ядер С=О-групп, входящих в состав дипептида L-a-Ala-DL-Val, при которых сигналы теоретического и экспериментального спектра из интересующей нас области максимально совпадают (рис. 8).
В табл. 1 приведены полученные таким образом значения компонентов тензоров химических сдвигов карбонильных атомов углерода аминокислотных остатков L-a-Ala и DL-Val и изотропное значение химического сдвига CP/MAS ЯМР 13C (5iso) для С=О.
В работе [13] было проведено подобное CP/MAS ЯМР 13C исследование для группы С=О остатка Ala в различных дипептидах (скорость вращения 1.5 кГц). Результаты представлены в табл. 2. Их анализ показывает, что определенные
Рис. 8. Рассчитанный и экспериментальный CP/MAS ЯМР 13C (125.69 МГц, AVANCE-500, «Bruker») спектры С=О-групп порошка дипептида L-a-Ala-DL-Val при скорости вращения образца 2 кГц
Табл. 1
Значения компонентов тензоров химических сдвигов (в м.д.) атомов углерода С=О-групп дипептида Ь-а-Л1а-ЭЬ-Уа1 и изотропное значение химического сдвига 13С (5ио) для С=О-групп
Атомы углеродов Скорость вращения, кГц 5lso 5ц 522 533 1> 15 1 35
С=О (L-a-Ala) 2 172.04 245.5 179.6 91.01 154.49
3 171.97 244.51 179.55 91.85 152.66
С=О (DL-Val) 2 175.99 239.84 179.74 108.41 131.43
3 175.95 240.66 181.6 105.58 135.08
Табл. 2
Значения компонентов тензора химического сдвига (в м.д.) атома углерода С=О-группы Ala в различных дипептидах и изотропное значение химического сдвига 13C (5lso) для С=О-группы
Дипептид 5lso 511 522 533 > = 511 - 533
Ala-Gly 171.1 248.5 ± 0.8 173.2 ± 0.5 91.6 ± 0.8 156.9 ± 1.1
Ala-Asp 171.7 247.4 ± 2.5 177.5 ± 2.0 90.2 ± 2.5 157.2 ± 3.0
Ala-Ser 170.4 245.5 ± 3.0 170.8 ± 2.5 94.9 ± 3.0 150.6 ± 3.5
нами тензора анизотропии химического сдвига 13С группы С=О остатка Ala в порошкообразном образце дипептида L-a-Ala-DL-Val достаточно близки к литературным данным.
Аналогичным образом были получены значения компонентов тензоров химических сдвигов CP/MAS ЯМР C СН- и CH3-групп аминокислотных остатков L-a-Ala и DL-Val и изотропные значения химических сдвигов CP/MAS ЯМР 13C (5lso) для этих же групп (табл. 3).
Табл. 3
Значения компонентов тензоров химических сдвигов (в м.д.) атомов углерода СНи СН3-групп дипептида Ь-а-Л1а-ЭЬ-Уа1 и изотропное значение химических сдвигов 13С (5и0) для СН- и СН3-групп (скорость вращения 4 кГц)
Атомы углеродов §iso 5n <N <N to §33 m m § - § II <
CaH (DL-Val) 115.49 162.49 111.96 72.01 90.48
CaH (L-a-Ala) 117.66 158.87 97.24 96.87 62
CBH (DL-Val) 133.43 204.55 105.8 89.95 114.6
CH3 (DL-Val) 140.22 166.95 139.96 113.75 53.2
CH3 (DL-Val) 139.23 166.25 141.56 109.87 56.38
CH3 (L-a-Ala) 134.67 158.72 124.71 120.59 38.13
Работа выполнена при поддержке РФФИ (проект № 09-03-00077а) и программы РНП Министерства образования РФ.
Summary
I.Z. Rakhmatullin, A.R. Yulmetov, A.V. Aganov, V.V. Klochkov. 13C NMR Spectroscopy and Chemical Shift Anisotropy of L-a-Ala-DL-Val in Solid State.
We present here the results of investigation of the spatial structure of L-a-Ala-DL-Val dipeptide in the solid state by the method of 13C CP/MAS NMR spectroscopy. The assignment of 1H and 13С NMR signals of L-a-Ala-DL-Val dipeptide in solution (D2O) was performed using the two-dimensional NMR spectroscopy (COSY and HSQC). 13C CP/MAS NMR (125.69 MHz) spectra of the dipeptide are described, and the results of the comparative analysis of 13C chemical shift values for aCH and aCH2 carbon atoms of L-a-Ala-DL-Val dipeptide in solution and in powder are presented. The components of chemical shift anisotropy tensors for carbon atoms in both amino-acid residues (L-a-Ala and DL-Val) are determined for the solid-state dipeptide.
Key words: oligopeptides, 1H and 13C NMR spectroscopy, two-dimensional NMR (COSY and HSQC) spectroscopy and 13C CP/MAS NMR spectroscopy, chemical shift, anisotropy, tensor.
Литература
1. Boman H.G. Peptide antibiotics and their role in innate immunity // Annu. Rev. Immunol. - 1995. - V. 13. - P. 61-92.
2. Zasloff M. Antimicrobial peptides of multicellular organisms // Nature. - 2002. - V. 415. -P. 389-395.
3. Wang Z., Wang G. APD: the antimicrobial peptide database // Nucleic Acids Res. -2004. - V.32. - P. 590-592.
4. Epand R.M., Vogel H.J. Diversity of antimicrobial peptides and their mechanisms of action // Biochim. Biophys. Acta. - 1999. - V. 1462. - P. 11-28.
5. Haeberlen U., MehringM. High resolution NMR spectroscopy in solids. - Berlin: Springer Verlag, 1976. - 504 p.
6. Wuthrich K. NMR of Proteins and Nucleic Acids. - N. Y.: Wiley-VCH, 1986. - 396 p.
7. Bradley E.K., Kerr J.M., Richter L.S., Figliozzi G.M., Goff D.A., Zuckermann R.N., Spellmeyer D.C., Blaney J.M. NMR structural characterization of oligo-N-substituted glycine lead compounds from a combinatorial library // Mol. Divers. - 1997. - V. 3, No 1. -P. 1-15.
8. Anishetty S., Pennathur G., Anishetty R. Tripeptide analysis of protein structures // BMC Struct. Biol. - 2002. - V. 2. - P. 1472-1507.
9. Breitmaier E., Woelter W. 13C NMR spectroscopy. Methods and application in organic chemistry. - Weinheim, N. Y.: Verlag Chemie, 1978. - 322 p.
10. Ernst R.R., Bodenhausen B., Wokaun A. Principles of Nuclear Magnetic Resonance in One and Two Dimensions. - Oxford: Oxford Univ. Press, 1987. - 610 p.
11. Berger S., Braun S. 200 and More NMR Experiments. - Weinheim: Wiley-VCH, 2004. -810 p.
12. Klochkov V.V., Baikeev R.F., Skirda V.D., Klochkov A.V., Muhamadiev F.R., BaskyrI., Berger S. Spatial structure of peptides determined by residual dipolar couplings analysis // Magn. Reson. Chem. - 2009. - V. 47. - P. 57-62.
13. Wei Y., Lee D.-K., Ramamoorthy A. Solid-State 13C NMR chemical shift anisotropy ten-
sors of polypeptides // J. Am. Chem. Soc. - 2001. - V. 123, No 25. - P. 6118-6126.
Поступила в редакцию 25.02.10
Рахматуллин Ильфат Зуфарович - студент физического факультета Казанского (Приволжского) федерального университета.
Юльметов Айдар Рафаилович - кандидат физико-математических наук, ассистент кафедры общей физики Казанского (Приволжского) федерального университета.
Аганов Альберт Вартанович - доктор химических наук, профессор, заведующий кафедрой общей физики Казанского (Приволжского) федерального университета.
Клочков Владимир Васильевич - доктор химических наук, профессор кафедры общей физики Казанского (Приволжского) федерального университета.
E-mail: vladimir.klochkov@ksu.ru
