CC BY
65
ПРИКЛАДНАЯ ХИМИЯ И ХИМИЧЕСКАЯ ТЕХНОЛОГИЯ
УДК 51.7:544.77.02.2.532:543.4:615,285:547.1-326
Р. Ф. Бакеева, Т. С. Горбунова, А.И. Валиахметова,
Э. И. Гафарова, С. Ю. Гармонов, Л. М. Юсупова
СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ 4,4-ДИАМИНОДИФЕНИЛСУЛЬФОНА
В ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТАХ ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ
5,7-ДИХЛОР-4,6-ДИНИТРОБЕНЗОФУРОКСАНА КАК РЕАГЕНТА В МИЦЕЛЛЯРНОЙ СРЕДЕ. Ч 2
Ключевые слова: 4,4-диаминодифенилсульфон, спектрофотометрический метод, первичные ароматические амины, 5,7-дихлор-4,6-динитробензофуроксан, оксиэтилированный алкилфенол, многофакторный эксперимент, поверхность отклика,
уравнение регрессии.
Представлены результаты многофакторного эксперимента для нахождения оптимальных условий определения 4,4'-диаминодифенилсульфона спектрофотометрическим методом. В данных условиях проведен анализ влияния мешающих компонентов и показаны способы применения методики для определения диаминдифенилсульфона в лекарственном препарате «Дапсон» и биологических жидкостях.
Keywords: 4,4-diaminodifenilsulfon, spectrophotometric method, primary aromatic amines, 5,7-dichloro-4,6-dinitrobenzofuroksan, ethoxylated alkylphenol, multiple-factor experiment, a response surface, the regress equation.
With the purpose to find the optimal conditions for the determination of 4,4-diaminodifenilsulfona using by spectrophotometric method, we conducted multivariate analysis.We carried out analysis of components influence of interfering in these optimal conditions . We show the application of the method for determining diamindifenilsulfona in the drug "Dapsone" and in biological fluids.
Введение
Для разработки методики определения 4,4'-диаминодифенилсульфона в лекарственных препаратах ранее нами проведен однофакторный анализ. Выявлены оптимальные условия. Определена спектральная область полосы поглощения продукта реакции 4,4'-диаминодифенилсульфона и ДХДНБФО в присутствии АФ9-10 (Xmax = 510 нм), установлены концентрация реагента, время протекания аналитической реакции (реакция протекает практически мгновенно) и интервал значений рН (6-9 ед. рН) [1].
Однофакторный эксперимент позволяет найти главные эффекты, но не способствует обнаружению, количественному описанию взаимодействия факторов, осуществлению процедур оптимизации. Поэтому для совершенствования методики нами проведен многофакторный эксперимент.
В настоящем сообщении приведены результаты многофакторного эксперимента, а также анализа влияния мешающих компонентов на определение ДАДФС. Кроме того, представлены способы применения методики для определения диаминдифенилсульфона в лекарственном препарате «Дапсон» и биологических жидкостях.
1. Экспериментальная часть
В качестве аналитического регента при определении ароматических аминов использовали 5,7-дихлор-4,6-динитробензофуроксан (ДХДНБФО)
получен по известной методике [2,3]. ДХДНБФО представляет собой кристаллы желтого цвета пластинчатой формы, хорошо растворимые в органических растворителях (диметилсульфоксид,
ДМСО, ацетонитрил), но плохо растворимые в воде. Молекулярная масса 295 г/моль.
В качестве поверхностно-активного вещества (ПАВ) в работе применяли
оксиэтилированный алкилфенол АФд_ю, который был предоставлен лабораторией поверхностно-активных веществ ОАО «Нижнекамскнефтехим».
Молекулярная масса 661 г/моль.
4,4 '-Диаминодифенилсульфон ( ДАДФС).
Белый или кремовато-белый кристаллический порошок. Практически не растворим в воде, хорошо растворим в спирте, ацетоне, разбавленных кислотах. Фенол, натрия бензоат, магния стеарат, кальция гидрофосфат и др. вспомогательные вещества - фармакопейной чистоты. ДМСО - «х.ч.»
Для приготовления растворов использовали воду, очищенную на установке «Millipore compact high purity system». В этой установке сочетаются процедуры Reserve Osmosis (обратный осмос), Distillation (перегонка), Deionization (деионизация). После очистки этой системой в воде гарантировано отсутствие загрязнений всех классов. Электрическое сопротивление воды 18,2 Мом.
Определение рН проводили на рН-метре (рН 150 М);
Спектры получали на спектрофотометре СФ-46 с использованием кварцевых кювет толщиной поглощающего слоя 0,5; 1,00 см.
Математическую модель строили с помощью пакета программ «Statistica 6.0».
2. Результаты и обсуждение
На основании данных, полученных в ходе однофакторных экспериментов [1] показано, что наиболее значимыми являются pH водосодержащих
систем, концентрация аналитического реагента (5,7-дихлор-4,6-динитробензофуроксан, ДХДНБФО),
концентрация неионогенного поверхностно-активного вещества (оксиэтилированный алкилфенол, АФ9-ю).
С целью оценки эффектов взаимодействия между факторами, а также оптимизации условий спектрофотометрического определения аналита (4,4'-диаминодифенилсульфон, ДАДФС) мы использовали метод планирования эксперимента.
В качестве критерия оптимальности (отклика) мы выбрали аналитический сигнал - значение оптической плотности исследуемых растворов.
Оптимизация методики включала планирование и выполнение многофакторного эксперимента по плану
Бокса-Бенкена [4]; построение математической модели (у = f (Х1)); изучение влияния факторов (Х1) на целевую функцию (у) путем построения поверхности отклика; анализ поверхности отклика с целью поиска точки оптимума. В табл.1 приведены план эксперимента, уровни факторов и измеренные в ходе выполнения эксперимента значения отклика (Х1 - концентрация аналитического реагента
ДХДНБФО (СдХднбфо, ммоль/л); Х2 - величина pH; Х3 - концентрация поверхностно-активного
вещества АФ9-10 (Спав, ммоль/л)).
Таблица 1 - Схема плана Бокса-Бенкена и уровни факторов для описания поверхности отклика при разработке методики определения ДАДФС
№ опыта Реальные (декодированные) уровни факторов Кодированные уровни факторов Результаты, у
Хг103 моль/л Х2 4, /л ? е Х3 мо Х1 Х2 Хз У1 У1 У1 уср
1 0,700 10,00 2,70 +1 + 1 0 0,617 0,618 0,618 0,618
2 0,700 2,00 2,70 +1 -1 0 0,624 0,626 0,625 0,625
3 0,100 10,00 2,70 -1 + 1 0 0,261 0,261 0,261 0,261
4 0,100 2,00 2,70 -1 -1 0 0,242 0,242 0,242 0,242
5 0,700 6,00 25,0 +1 0 +1 0,947 0,950 0,950 0,949
6 0,700 6,00 0,25 +1 0 -1 0,053 0,053 0,053 0,053
7 0,100 6,00 25,0 -1 0 +1 0,377 0,377 0,377 0,377
8 0,100 6,00 0,25 -1 0 -1 0,053 0,027 0,027 0,027
9 0,400 10,00 25,0 0 +1 +1 1,128 1,132 1,132 1,131
10 0,400 10,00 0,25 0 +1 -1 0,039 0,039 0,039 0,039
11 0,400 2,00 25,0 0 -1 +1 0,385 0,385 0,385 0,385
12 0,400 2,00 0,25 0 -1 -1 0,040 0,040 0,040 0,040
13 0,400 6,00 2,70 0 0 0 0,778 0,779 0,779 0,779
14 0,400 6,00 2,70 0 0 0 0,770 0,772 0,771 0,771
15 0,400 6,00 2,70 0 0 0 0,781 0,782 0,782 0,782
Рис. 1 - Поверхность отклика зависимостей
функции отклика от концентрации реагента ДХДНБФО и концентрации ПАВ при х2* = 0
Рис. 2 - График контуров зависимостей функции отклика от концентрации реагента ДХДНБФО и концентрации ПАВ
Анализ поверхности отклика позволил получить уравнение регрессии (1): у= 0,781+0,167Х-| +0,095X2 + 0,335Хз - 0,196Х1 2 -0,149Х22 - 0,234Хз2 + 0,187X2X3+
0,137ХзХ1 (1)
Анализ полученной модели показывает, что поверхность отклика имеет нелинейный характер: полуоси эллипсов - линий уровней - не параллельны осям координат (рис. 1 и 2). Это свидетельствует о наличии эффектов взаимодействия факторов Х1 г Х3-, и Х2 г Х3. Вместе с тем отсутствуют взаимная связь между факторами Х1 г Х2. Обращает на себя внимание также относительно низкое значение регрессионного коэффициента для линейного факторного эффекта Х2 (0,095) в уравнении (1), что вполне согласуется с полученными ранее данными.
Поиск оптимума осуществлялся до достижения точки экстремума (см. рис. 1,2).
Получены следующие значения координат оптимума (максимума) в кодированных значениях факторов: фактор Хь 0,922; фактор Х2: 1,23; фактор Х3: 1,48.
Декодированные значения составляют рН=10,9; Сдхднбфо = 6,76-10-4моль/л и саф9-10= 7,54-10-
3 моль/л (иначе говоря, рекомендуемые соотношения концентраций реагентов: Сдадфс:Сдхднбфо:Саф9-10 =
1:6,76:75). При этом величина отклика в области максимума составляет: у = 1,164. Для проверки модели провели параллельные эксперименты по определению значения отклика в выбранных (оптимальных) условиях. Полученные экспериментальные данные (1,1582 ± 0,0044) вполне согласуются с расчетными (у = 1,164).
В этих условиях величина е^тах составляет 23200 л/моль-см, что позволяет говорить о значительном увеличении чувствительности спектрофотометрических определений ДАДФС в результате проведенной оптимизации (ранее значение е^тах составляло 11200 л/моль-см).
В данных условиях зависимость оптической плотности от концентрации ДАДФС в растворе линейна и описывается уравнением (1=0,5 см) (2):
А = 0,020 + 49,66 С (мг/мл) (2)
(г=0,9995)
Проверка линейности зависимости величины отклика у (А) от концентрации определяемого
вещества (ДАДФС) осуществлялась в рамках валидационного процесса. Для методик
количественного определения содержания основных веществ в качестве критерия линейности используют значения коэффициента корреляции г>0,999. Полученные данные и график, визуально подтверждающий линейность зависимости у от С, соответствуют установленным критериям.
Линейность графика сохраняется в широком диапазоне определяемых концентраций (диапазон применения) ДАДФС: 1-10-6-3-10-4 моль/л и выше. Полученные данные свидетельствуют, о том, что методику можно использовать для определения содержания, как основного компонента лекарственных форм, так и примесей.
При оценке такого показателя, как селективность (специфичность методики как валидационной характеристики) изучено влияние компонентов пробы (вспомогательных веществ -плацебо) на результаты аналитических определений (табл.2).
Под специфичностью методики понимается способность достоверно определять анализируемое вещество в присутствии всех других компонентов, включая примеси, которые потенциально могут присутствовать в анализируемом веществе [5].
Таблица 2 - Мешающее влияние компонентов на результаты определения ДАДФС
Компоненты (А) Содержание компонента С(А),мкг/мл Соотношение С(А)/С(ДАДФС) (С, моль/л) Введено ДАДФС, мкг/мл Найдено ДАДФС, мкг/мл V
38,0 16,0 1 6,21 6,25±0,19 0,025
Фенол 1,90 0,40 1 12,40 12,20±0,30 0,020
9,50 4,00 1 24,80 25,30±0,56 0,018
Крахмал 40,0 - 12,40 12,55±0,17 0,011
Магния стеарат 10,0 0,35 1 12,40 12,25±0,22 0,015
Лактоза моногидрат 40,0 2,50 1 12,40 12,55±0,35 0,023
Натрия бензоат 2,00 0,30 1 12,40 12,65±0,30 0,020
Глюкоза 50,0 3,00 1 12,40 12,15±0,31 0,021
СаНР04 40,0 6,00 1 12,40 12,63±0,28 0,019
Ацетилсалициловая кислота 7,50 1,00:1 12,40 11,80±0,48 0,033
Сульфосалициловая кислотата 11,0 1,00:1 12,40 11,70±0,51 0,035
В результате анализа полученных данных, пришли к выводу, что спектрофотометрическому определению ДАДФС не мешает присутствие большинства приведенных в таблице 2 потенциальных компонентов и примесей. Исключение составляют кислоты (ацетилсалициловая и сульфосалициловая). Возможно, это объясняется тем, что некоторые кислоты (например, аскорбиновая, уксусная и др.) способны образовывать с азотсодержащими соединениями комплексы в результате возникновения водородной связи №--Н - О или 0--М - Н , что может привести к изменению спектральных характеристик.
Таким образом, на примере анализа целого ряда модельных растворов проверена возможность спектрофотометрического определения ДАДФС в
исследуемых матрицах. Были получены
доказательства внутрилабораторной повторяемости (сходимости) результатов количественного определения ДАДФС по данной методике (V) (составляющая случайной погрешности метода, прецизионности). Полученные результаты в целом удовлетворительны по своим метрологическим характеристикам (требуемое значение V (8г или Я^Б) для Р=0,95 при определении основных веществ в субстанциях и лекарственных формах: < 1-2%).
Правильность методики оценивалась с помощью общепринятого критерия «введено»-«найдено». В целом были получены
удовлетворительные результаты.
Полученные данные можно использовать в первом приближении для характеристики точности методики. Более строгие заключения можно будет сделать после всесторонних метрологических исследований в ходе валидации методики. Согласно [5] точность методики анализа лекарственных средств можно оценивать в виде открываемости определяемого вещества (3):
(найдено аналита)
Р =-------------------100%, (3)
(взято аналита)
где Р — открываемость.
Считается, что нет необходимости тестировать методику на отсутствие значимой систематической погрешности, если установлено, что границы открываемости при количественном анализе субстанций с содержанием основного вещества < 98% и лекарственных форм не выходят за пределы: 98 -102%. Полученные нами данные свидетельствуют, что разброс значений Я практически во всех случаях (кроме оговоренных выше) находился в этих пределах.
Был установлен предел количественного определения ДАДФС по данной методике (показатель чувствительности). Оценку СН проводили по зависимости V (8г) от С, по которой устанавливали концентрацию ДАДФС, соответствующую допустимой величине V (8г) (<0,33).
Предел обнаружения составил: 0,25 мкг/мл. Это существенно ниже предела обнаружения ароматических аминов по стандартной методике с нитропруссидом натрия 0,5 мкг/мл или с нитритом натрия [6, 7].
Полученные результаты были использованы для разработки методики определения диаминдифенилсульфона в лекарственных средствах (Дапсон) и биологических жидкостях. Достигнутая величина нижней границы определяемых содержаний позволяет использовать разработанную методику для количественного определения, как основного компонента лекарственных форм, так и компонентов биологических сред организма человека.
Разработанную методику можно применить для изучения кинетики выведения диуцифона (ДЦ) из организма человека, поскольку ДЦ выводится почками в виде 4,4'-диаминодифенилсульфона. Предварительно было установлено, что компоненты биологической жидкости (БЖ) (мочи) не мешают количественному определению диаминдифенилсульфона с помощью модифицированного алкилфенолом аналитического реагента 5,7-Дихлор-4,6-динитробензофроксана
(рис.3). Следует отметить, что в отсутствие ПАВ желаемый результат не был достигнут. Это подтверждает эффективность мер по оптимизации разработанной нами методики.
Рис. 3 - Спектры поглощения модельных
растворов биологической жидкости (мочи)
В таблице 3 представлены результаты определения содержания диаминдифенилсульфона в модельных средах на основе биологической жидкости (мочи)
Таблица 3 - Влияние компонентов биологической жидкости (мочи) на результаты определения диаминодифенилсульфона (п=5; Р=0,95)
Нами был проведен фармакокинетический эксперимент. Пробы в количестве 50 мл отбирали в стерильные, герметично закрывающиеся
одноразовые пластиковые контейнеры до и через 1,2,4,6,8,10,12,18 и 24 часа после приема препарата. Анализ мочи на содержание в ней диаминодифенилсульфона проводили не позже, чем через 3-4 часа.
Длина волны поглощения устанавливалась равной 510 нм. Для фотометрических измерений использовали кюветы 1,00 см. В качестве раствора сравнения использовали раствор «холостого опыта». Количественные определения проводили с использованием метода градуировочного графика. Для этого были приготовлены стандартные растворы диаминодифенилсульфона в БЖ.
На рис. 4 представлен график изменения концентрации выделенного с мочой диаминодифенилсульфона во времени после однократного приема исследуемого препарата диуцифона. График имеет вид типичных фармакокинетических кривых.
Как показано на рис. 4 пиковый уровень одного из основных метаболитов ДЦ -диаминодифенилсульфона в моче достигается ~ через 6 час после введения препарата.
После достижения максимального значения количество выводимого мочой
диаминодифенилсульфона монотонно убывает и достигает минимальных значений после 24 часов (рис.4). Поэтому время наблюдения было установлено равным 24 часам.
Отсутствие/ присутствие ПАВ (АФ9_іо) Введено, мкг/мл Найдено, мкг/мл V
Отсутствие 12,40 0,620 -
Присутствие 24,80 24,08±0,60 0,020
12,40 12,47±0,24 0,022
6,21 6,33±0,30 0,038
2,48 2,60±0,13 0,040
Рис. 4 - Кривые выделения диаминодифенилсульфона (с мочой) после перорального однократного приема 300 мг диуцифона здоровым добровольцем
Была определена суточная кумулятивная экскреция ДAДФC после приема диуцифона (300 мг).
Рис. 5 - Кривая кумулятивной экскреции
диаминодифенилсульфона после перорального однократного приема З00 мг диуцифона здоровым добровольцем
Кривая кумулятивной экскреции (рис. 5)
показывает, что за время наблюдения из организма с мочой было выделено 29,4 мг ДДДФС, что составляет 25% от первоначальной (введенной) дозы диуцифона.
Исследование кинетики экскреции препарата с мочой показало, что почечная экскреция не является единственным путем выведения препарата из организма.
Полученные результаты после
дополнительных исследований могут быть использованы для выработки рекомендаций по проведению лечения пациентов (расчет суточной дозы
препарата, разовых дозировок, интервала дозирования) для того, чтобы добиться максимальной эффективности лечения, исключить возможные побочные эффекты (например, связанные с передозировкой лекарственным средством в результате кумулятивного действия препарата и т.п.).
Полученные экспериментальные данные показывают возможность применения
предложенной методики для фармацевтического анализа 4,4'-диаминодифенилсульфона и делают ее
пригодной для
лекарственного
условиях.
Tаким
чувствительная,
проведения
мониторинга
терапевтического в клинических
образом, разработана
селективная и экспрессная методика спектрофотометрического определения 4,4'-диаминодифенилсульфона с использованием модифицированного поверхностно-активным
веществом (АФ9-ю) низкотоксичного реагента 5,7-дихлор-4,6-динитробензофуроксана. Она обладает хорошими аналитическими и метрологическими характеристиками.
Литература
1 Бакеева Р.Ф., Горбунова Т.С., Марданова А.И.,
Гафарова Э.И., Гармонов С.Ю., Юсупова Л.М., Сопин В.Ф. Спектрофотометрическое определение 4,4'-диаминодифенилсульфона в лекарственных
препаратах при использовании 5,7-дихлор-4,6-динитробензофуроксана как реагента в мицеллярной среде. Ч.1 / Р.Ф. Бакеева и др. // Вестник Казан. технол. ун-та. - 2012. - №12. - С. 40-44.
2 Пат. 2194990 Российская Федерация / С.Ю. Гармонов, И.Ф. Фаляхов, А.С. Салахова, В.Ф. Сопин; заявл. 03.05.01; опубл. 20.12.02, Бюл. № 35.
3 Пат. 2255935 Российская Федерация / И.Ф. Фаляхов, Л.В. Спатлова, Т.В. Гарипов; заявл. 24.06.2003; опубл. 10.07.2005, Бюл. № 19.
4 Кельнер, Р. Аналитическая химия. Проблемы и подходы / Р.Кельнер, Ж.-М. Мерме, М.Отто, Г.М. Видмер -Москва, 2004. - 608с.
5 Эпштейн, Н.А. Оценка пригодности (валидация) ВЭЖХ методик в фармацевтическом анализе (обзор) / Н.А. Эпштейн // Хим. - фарм. журн. - 2004. - Т.38, №4. - С. 41-55.
6 Государственная Фармакопея СССР, изд. Х. - М.: Медицина, 1968. - 1079 с.
7 Британская Фармакопея. V. 1. L., 1996.
© Р. Ф. Бакеева - д-р хим. наук, проф. каф. аналитической химии, сертификации и менеджмента качества КНИТУ, bakeeva@kstu.ru; Т. С. Горбунова - канд. хим. наук, доц. той же кафедры; А.И. Валиахметова - магистр КНИТУ;
Э. И. Гафарова _ химик-аналитик НП «Логистика»; С. Ю. Гармонов _ д-р хим. наук, проф. каф. аналитической химии, сертификации и менеджмента качества КНИТУ, Л. М. Юсупова _ д-р хим. наук, проф. каф. химии и технологии органических соединений азота КНИТУ.
