CC BY
81Journal of Siberian Federal University. Chemistry 3 (2012 5) 281-288
УДК 615.332:582.998.2.03
Спектрофотометрическое исследование накопления хлорофилла и его производных в экстрактах мелиссы лекарственной при использовании двухфазной системы растворителей
Л.В. Наймушинаа*, А.Ю. Карасеваа, Н.В. Чесноковаб
а Сибирский федеральный университет Россия 660041 Красноярск, Свободный, 79, б Институт химии и химической технологии СО РАН, Россия 660036 Красноярск, Академгородок, 50-24 1
Received 10.09.2012, received in revised form 17.09.2012, accepted 24.09.2012
Методом спектрофотометрии исследованы закономерности извлечения хлорофилла и его производных (ПХ) из мелиссы лекарственной Melissa officinalis при двухфазной экстракции в системе «водный раствор этанола (60 %) - рапсовое масло». Количественный анализ содержания ПХ в масляных фазах экстрактов показал, что применение системы несмешивающихся растворителей по сравнению с однофазной экстракцией рапсовым маслом повышает выход в 1,5-2 раза при увеличении времени процесса с 6 до 30 часов соответственно. При создании устойчивой эмульсии в системе несмешивающихся растворителей с помощью поверхностно-активного вещества второго рода - лецитина - эффективность извлечения ПХ возрастает в 2,5-3,7раза соответственно.
Ключевые слова: растительное сырье, биологически активные вещества (БАВ), хлорофилл и его производные, двухфазная экстракция, спектрофотометрическое исследование.
Несомненным достоинством всех видов лекарственного растительного сырья является разнообразие биологически активных веществ (БАВ) различной полярности, обеспечивающих поливалентность (т. е. множественность) фармакологических эффектов. Однако эффективное комплексное извлечение БАВ затрудненно при применении классических методов экстракции ввиду того, что спиртово-водные и масляные извлечения, различающиеся составом ценных со-
* Corresponding author E-mail address: naimlivi@mail.ru
1 © Siberian Federal University. All rights reserved
единений, получают раздельно, используя разные по полярности экстрагенты. Например, применение технологии мацерации - масляной экстракции - позволяет извлекать растительными маслами только жирорастворимые вещества. При этом гидрофильные компоненты остаются в исходном сырье и могут быть извлечены лишь в другой экстракт. Как показывают исследования, в шроте часто остается большое количество ценных соединений, которые могут служить основой для производства лекарственных и косметических препаратов или биологически активных добавок к пище. В этой связи существует необходимость рационального использования растений, совершенствования и разработки новых ресурсосберегающих комплексных технологий переработки лекарственного растительного сырья, обеспечивающих максимальное извлечение БАВ.
Для решения указанных проблем возможна переработка сырья методом двухфазной экстракции в системе полярный - неполярный растворители с эффективным извлечением как гидрофильных, так и липофильных веществ. Например, применение системы несмешивающихся растворителей водный раствор этанола - растительное масло позволит за один технологический цикл получить одновременно водно-спиртовое и масляное извлечения [1-5].
В ряде научных исследований для оптимизации процесса двухфазной экстракции растительного сырья добавляют поверхностно-активные вещества (ПАВ) с целью получения эмульсионно-диспергированной системы несмешивающихся растворителей, обеспечивающей более высокую скорость массопереноса при экстрагировании [6-8].
Для изучения закономерностей процессов двухфазной экстракции растительного сырья авторами статьи в качестве объекта исследования была выбрана мелисса лекарственная - Melissa officinalis. Данное лекарственное сырье входит в фармакопеи большинства стран и применяется как успокаивающее, болеутоляющее, спазмолитическое и общеукрепляющее средство [9]. Известно, что мелисса содержит как липофильные (производные хлорофилла, каратиноиды), так и гидрофильные (флавоноиды, дубильные вещества, углеводные комплексы) БАВ [9].
Целью данной работы явилось спектрофотометрическое изучение накопления хлорофилла и его производных, извлекаемых из мелиссы лекарственной - Melissa officinalis, с использованием системы несмешивающихся растворителей: водно-этанольный раствор (60 %-ный) -рапсовое масло.
Из литературы известно, что хлорофилл и его производные проявляют бактерицидное и антиоксидантное действие и используются в медицине и ветеринарии для фотодинамической терапии онкологических заболеваний; также есть данные по их применению в качестве натурального пигмента при производстве ряда косметических и парфюмерных изделий [10].
Использование рапсового масла как экстрагента объясняется его традиционным применением в качестве полезного растительного пищевого масла. В его составе преобладают мононенасыщенные кислоты олеинового ряда с незначительным содержанием ди- и триненасыщен-ных кислот. Являясь природными антиоксидантами, они уменьшают окисляемость масла и увеличивают его срок годности. Сегодня в продажу поступают так называемые селекционные низкоэруковые сорта - с низким содержанием эруковой кислоты. Достоинство низкоэрукового масла - сбалансированность смеси жирных кислот: 50-60 % олеиновой, 15-25 % - линолевой и 7-15 % - линоленовой. Они эффективно снижают уровень плазменного холестерина - главного виновника развития атеросклероза и сопутствующих заболеваний. Особенно важна роль
линолевой и линоленовой кислот - их дефицит чреват сужением сосудов и нарушением кровообращения. Кроме того, содержание в рапсовом масле необходимого количества витамина Е (430-1680 мг/кг) обеспечивает нормальную деятельность эндокринной системы [11].
В задачи исследования входило: 1) проведение процессов экстракции мелиссы лекарственной: а) однофазной системой - мацерацией рапсовым маслом, б) двухфазной системой: водно-этанольный раствор - рапсовое масло, в) той же двухфазной системой с добавлением ПАВ; 2) спектрофотометрическое изучение поглощения масляными экстрактами УФ- и видимого излучения в диапазоне длин волн 280-750; 3) количественное определение содержания хлорофилла и его производных в масляных экстрактах на спектрофотометре СФ-46 при 680 нм.
Экспериментальная часть
В качестве исходного сырья использовалась высушенная надземная часть мелиссы лекарственной, собранная в августе 2010 г. в экологически чистых регионах Приангарья. Аналитическую пробу сырья измельчали до размера частиц, проходящего сквозь сито с отверстиями диаметром 3,0-5,0 мм.
Двухфазная система экстрагентов выбрана со следующим составом: рапсовое растительное масло - водный раствор этанола (60 %-ный) в соотношении 2:1. Экстрагирование осуществляли по следующей методике: 10,0 г сухого сырья помещали в круглодонную колбу, приливали 50 мл 60 %-го водного раствора этилового спирта и выдерживали в течение 1,5 ч при комнатной температуре. Затем добавляли 100,0 мл рапсового масла. Экстрагирование вели в той же колбе с обратным холодильником при нагревании на водяной бане до 80-85 °С при периодическом перемешивании. Накопление БАВ в экстрактах изучали в динамике: через 6, 12, 18, 24, 30 ч экстрагирования. По достижении определенного времени вытяжку процеживали через марлю для отделения частиц сырья и разделяли по плотности в делительной воронке.
Для сравнения параллельно проводили мацерацию - однофазную экстракцию сырья рапсовым маслом. Также проведена экстракция сырья той же системой несмешивающихся растворителей, но с добавлением поверхностно-активного вещества (ПАВ) лецитина в количестве 0,025 г. Лецитин, являясь натуральным эмульгатором, позволял получать устойчивые эмульсии вода-этанол-масло.
Электронные спектры поглощения масляных фракций экстрактов записывали на спектрометре Specord 40 М. В этих же образцах оценивали степень извлечения липофильной фракции БАВ мелиссы по содержанию хлорофилла и его производных, измеряя оптическую плотность на спектрофотометре СФ-46 при X = 680 нм [3]. В качестве растворов сравнения использовали рапсовое масло или - при исследовании двухфазной экстракции с добавлением ПАВ - рапсовое масло с добавлением лецитина.
Результаты и обсуждения
Исследование закономерностей экстракции травы мелиссы однофазной и двухфазной системами растворителей методом УФ- и видимой спектроскопии показало, что уже после 6-часовой экстракции в электронных спектрах масляных фракций экстрактов обнаруживаются существенные различия по интенсивности поглощения (рис. 1, кривые 1, 2). В спектрах экстрактов
Длина волны, нм
Рис. 1. Электронные спектры поглощения экстрактов мелиссы (6 ч): 1 - экстрагент: рапсовое масло; 2 - экстрагент: рапсовое масло - 60 %-ный водный раствор этанола
можно выделиыь два основных максимума поглощения. Первый! - при X ~ 400-430 им - можно отнести к поглощению гидрофильного комплекса БАВ мелиссы, второй - при X ~ 670-685 нм -поглощение, характерное для хлорофилла и его производных. Кроме того, при двухфазном экстрагировании появляется погло щение в диапазоне да лип волн 550-580 нм, характеризующее присутствие в экстрактах антоцианов (рис. Ы, кривая 2). Характерно, что антоцианы, будучи полярными флавоноидами, в чистом виде в неполярных растворителях нерастворимы. Таким образом, электронные спектры масляных фракций экстрактов зволяют визуально оценить возрастание степени извлрчения как гидрофильных, так и иипрфильных БАВ мелиссы при применении двухфазной! системы : по лярный-неполярный растворители.
Опытным путем показано, что предварительное замачивание растительного сырья в полярном растворителе - в нашем случае в водно-этанольном растворе - обеспечивает протекание процесса гидратации, усновное значение которого заолючается в оклаблеоии межмолеку-лярныр связей, их разрыхление, дополнителсной оидратации полярных групп аидрофильных соединений.
После разрушения связей между макромолекулами вода далее вытесняется этанолом, предоизрачающимся для извлечения менее пиоярных БАВ лекарственного сырьл. Кроме того, этаноп разрушает водородные связи и ослабляет эле ктростатическое взаимодействие липидов с белками, эффективно экстрагируя полярные липиды [12].
Следовательно, содержание этанола не ниже 60 мас. % в полярной фазе при двухфазной экстракции обеспечивает хороше е проникновение растрорителс внутрь олеток сырья, его набухание, ресорбцпю и сольватацию не тольио липофилнных (фитостеринов, токоферолов, те р-пенов, хлорофиллов и др.), но и полярных веществ (флавоноидов, иридоидов, антоцианов и др.). При прохождении через клеточные мембраны эт ловый спирт переносит растворенные БАВ из клеточных компертментов на поверхность. Другими словами, использование в одного растнонаэтанола облегчает ороникновениа более тяжхлых молеиул - триглицеридов жирных
680
Длина волны,нм
Рис. 2. Электронные спектры поглощения масляных экстрактов мелиссы после применения двухфазной системы растворителей: 60 %-ный водный раствор этанола - рапсовое масло при добавлении лецитина
кислот растительного масла внутрь клеточных оболочек сырья для извлечения гидрофильных соединений, а также общих и нейтральных липидов.
Экспериментально установлено, что при добавлении к двухфазной системе экстрагентов поверхностно -активного вещества эффективность извлечения БАВ возрастает в несколько раз. Такое увеличение зарегистрировав при ирименении в качтстве ПАВ лецитина - ната-рального эмульгатора, позволмющтго получать истойчивую эмултсию вода - спирт-масло. Электронные спектры поглощения демонстрируют, что использование лецитина в добавлении к двухфазной системе растворителей приводит к увеличению содержания как гидрофильной, тнк и липофильуо й фракций Б АВ в составе масленой фракции экстрнктов мелиссы (рис. 2).
Так как гидрофильная фракция в экстрактух представлена несколькими классами соединений, дли количиственного изучения накопления БАВ в зависимости от условий экстрагирования уылу зыбрана липофильная фракция. Эта фракция представлена в сырье мелиссы лекарственной преимущественно хлорофиллом и его производными, дающими в видимой области четкий максимум поглощения при Х= 680 нм.
Измвренме оптичоской плотнтст и экстрактов сырья при А, ~ 680 нм на спектрофотометре СФ-46 позволило провести количественноу опредеиение содержания хлорофилла и его производных (ПХ) в зависимости от усло вий экстракции (рис. 3). Расчет содержания проводили по форм уле
И-Р-1000
X —-,
755
где Х - концентруция ПХ, мг %з ; И) — оптическая плот но сть; Р - кратность разведения экстракта хлороформом; 7В5 - удельный показнтель поглощенив хлорофилла при 680 нм; 1000 - пересчет концентрации мг % [3].
5 10 15 20 25 30
Время экстракции, час
Рис. 3. Содержание хлорофилла и его производных (ПХ) в экстрактах мелис сы : 1 - экстракция рапсовым маслом; 2 - экстракция в двухфазной системе: рапсовое масло - 60 %-ный водный раствор этанола; 3 -экстракция в двухфазной системе : рапсовое масло - 60 %о-ный водный раствор этанола с добавлением лецитина
Количественный анализ содержания хлорофилла и его производных (ПХ) в экстрактах мелиссы лекарственной показал, что применение системы «полярный - неполярный растворители» повышает выаод ПХ в 1 ,5-2 раза (рис. 3, иривые 1-2).
При соэдании устойчивой эмульсии в системе несмешивоющихся растворителей а помощью лецитина эффективность извлечения ПХ возрастает в 2,5-3,7 раза при увеличении времени экстракции с 6 до 30 часов соответственно (рис. 3, кривая 3).
Оптимизация извлечения БАВ, в частности хлорофилла и его производных, из мелиссы при пымощи ПАВ проявляется в тоМы что оецитин, являясь гидрофоОным эмулагатором 2-го родо, образует обратную эмульсию «вода-спирт в мосле». В эмульыионно-диспергированной системе несмешивающихся растворителей вязкость масла резко уменьшается, что приводит к возрастанию скорости процессов массопереноса и облегчению перехода липофильных БАВ из сухого сырья о мас ляную фазу [12].
Приведенные исс ледования позволяю т сделать заключение, что фитоизв лечения, получаемые технологией двухфазной экстракции, являются облегченными эмульсиями, которые можно использовать для введения в пищевые, лекарственные или косметические кремообразные композиции. Кроме того, в связи с теме что количество полярной фазы доститочно мало и о на легкоиспаряема, многообещающим направлением считается полученио маслянв1х экстривтов, насыщенных богатым спектром биохимических соединений различной полярности, обеспечивающих многофункциональное лечебное и профилактическое воздействие на организм.
Выводы
1 . Проведенвоз спектрофотометрическоо исследоваане показалу, что экстраоция мелиссы лекарственной двухфазной системой растворителей: водный раствор этанола (60 %-ный) - рапсовое масло по сравнению с однофазным экстрагированием сырья рапсовым маслом увеличивает в несколько раз содержание как гидрофильной, так и липо-фильной фракций БАВ в масляных фазах экстрактов.
2. Экспериментально установлено, что применение ПАВ 2-го рода - лецитина - оптимизирует извлечение БАВ при двухфазной экстракции мелисы вследствие образования устойчивой эмульсии, уменьшения вязкости масла и возрастания скорости процессов массопереноса.
3. Количественный анализ содержания хлорофилла и его производных в масляных фазах экстрактов мелиссы лекарственной показал, что применение системы полярный - неполярный растворители по сравнению с экстракцией рапсовым маслом повышает их выход в 1,5-2 раза при увеличении времени экстракции с 6 до 30 часов соответственно. При создании устойчивой эмульсии в системе несмешивающихся растворителей с помощью лецитина эффективность извлечения хлорофилла и его производных возрастает в 2,5 - 3,7 раза в соответствии с затраченным временем на экстрагирование.
4. Данный метод извлечения ценных компонентов с получением устойчивой эмульсии может быть применен для составления кремо- и мазеобразных лекарственных и косметических композиций, содержащих комплекс БАВ различной полярности и обеспечивающих поливалентность фармакологических эффектов.
Список литературы
1. Каухова И. Е. Новая методика получения растительных препаратов // Фармация. 2006. № 1. С. 37-39.
2. Минина С. А., Каухова И. Е. Химия и технология фитопрепаратов. М.: Гэотар-медиа, 2009. 560 с.
3. Хаззаа И.Х., Вайнштейн В.А., Чибиляев Т.Х. Экстрагирование липофильных БАВ из травы зверобоя водно-масляными эмульсиями // Химико-фармацевтический журнал. 2003 .Т.37. № 7. С. 20 - 23.
4. Иванова С.А., Ванштейн В.А., Каухова И.А. Особенности массопереноса липо-фильных БАВ при экстрагировании сырья двухфазной системой экстрагентов // Химико-фармацевтический журнал. 2003. Т.37. № 8. С.30-33.
5. Сорокин В.В., Вайнштейн В.А., Карнаухова И.Е., Чибиляев Т.Х. Изучение экстрагирующей способности одно- и двухфазных систем экстрагентов для извлечения флавоноидов из травы клевера лугового // Химико-фармацевтический журнал. 2008. Т.42. № 8. С.23 - 25.
6. Вайнштейн В.А., Хаззаа И.Х., Чибиляев Т.Х., Каухова И.Е. Экстрагирование полярных БАВ из травы зверобоя двухфазной системой экстрагентов в присутствии ПАВ // Химико-фармацевтический журнал. 2004. Т. 38. № 5. С. 25 -27.
7. Белякова А.В., Вайнштейн В.А., Маркова К.В., Демченко Ю.Т., Чибиляев Т.Х. Применение синтетических эфиров высших жирных кислот для экстрагирования листьев крапивы // Химико-фармацевтический журнал. 2005. Т.39. № 11. С. 35 - 39.
8. Демченко Ю.Т., Каухова И.Е., Вайнштейн В.А., Чибиляев Т.Х. Особенности процесса экстрагирования лекарственного сырья двухфазными системами экстрагентов, содержащими компоненты суппозиторных основ // Химико-фармацевтический журнал. 2005. Т.39. № 11. С.30-34.
9. Государственная фармакопея СССР. 11-е изд. М., 1989. Т.2. 389 с.
10. Андрианова Ю. Е., Тарчевский И.А. Хлорофилл и продуктивность растений. М.: Наука, 2000. 135 с.
11. Лисицын А.Н., Быкова С.Ф., Давиденко Е.К., Минасян Н.М. Биологические особенности сортов рапса и физиологические ценности жмыхов и шротов // Масложировая промышленность. 2007. № 6. С. 18-20.
12. Гусакова С.Д., Степаненко Г.А., Асимбекова Д.Т. Липиды некоторых лекарственных растений // Растительные ресурсы. 1983. Т. 19. Вып. 4. С. 444-445.
Spectrophotometry Study of Chlorophyll and its Derivatives Accumulation in Melissa Officinalis Extracts Using Two-Phase Solvent System
Lilia V. Naimushinaa, Anastasia Yu. Karasevaa and Nikolai V. Chesnokova,b
a Siberian Federal University 79 Svobodny, Krasnoyarsk, 660041 Russia b Institute of Chemistry and Chemical Technology SB RAS 50/24 Akademgorodok, Krasnoyarsk, 660036 Russia
The regularities of chlorophyll and its derivatives (CD) recovering from Melissa officinalis at two-phase extraction in system "ethanol water solution (60 %) - colza oil" were investigated by spectrophotometric method. CD content quantitative analysis in oil extracts has shown that a usage of immiscible solvents system increases a yields in 1,5 - 2 time compared to single-phase extraction by colza oil under process time extension from 6 to 30 hours properly. The efficiency of CD extraction was increased in 2,5-3,7 times when a stable emulsion in immiscible solvents system was created by adding a surface-active agent of the second kind - lecithin.
Keywords: vegetable row materials, biologically active substances (BAS), chlorophyll and its derivatives, two-phase extraction, spectrophotometric study.
