CC BY
73
DOI: 10.24411/0235-2451-2018-10419 УДК 543.062:664.2
СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД ОЦЕНКИ УСТОЙЧИВОСТИ СОЕДИНЕНИЙ ВКЛЮЧЕНИЯ КРАХМАЛА С НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫМИ ЛИГАНДАМИ
Н. Д. ЛУКИН1, доктор технических наук, директор (e-mail: vniik@arrisp.ru)
А. Ю. ВИНОКУРОВ2, кандидат технических наук, доцент (e-mail: tolmach_88@mail.ru)
А. А. ВОДЯШКИН3, научный сотрудник Ю. С. ХАПИЛИНА2, научный сотрудник всероссийский научно-исследовательский институт крахмалопродуктов - филиал Федерального научного центра пищевых систем им. В.М. Горбатова РАН, ул. Некрасова, 11, пос. Красково, Люберецкий р-н, Московская обл., 140051, Российская Федерация
2Орловский государственный университет имени И. С. Тургенева, ул. Комсомольская, 95, Орел, 302026, Российская Федерация
3Санкт-Петербургский национальный исследовательский университет информационных технологий, механики и оптики, Кронверкский просп., 9, Санкт-Петербург, 197101, Российская Федерация
Резюме. Полисахариды крахмала, обладающие рядом преимуществ (высокой распространенностью, биоразлагаемо-стью, биосовместимостью, относительно низкой стоимостью, доступностью для модифицирования химического строения и пространственной структуры в результате физического, механического, химического, биохимического или комбинированного воздействия), находят все большее применение в создании систем доставки лекарственных препаратов, нового поколения пищевых добавок, тканевой инженерии и других направлениях, многие их которых относятся к сфере нанобиотехнологии. Зачастую это связано со способностью амилозы и амилопектина к образованию соединений включения с различными веществами - лигандами, имеющими, как правило, гидрофобную природу. Более широкое распространение комплексообразования на практике возможно при использовании на стадии исследований предлагаемого в статье метода количественной оценки комплексов. Он основан на изучении влияния рассматриваемого лиганда на интенсивность окраски соединения крахмала с йодом. При выраженной способности лиганда к включению в структуру молекул полисахаридов происходит вытеснение йода, что приводит к снижению оптической плотности исследуемых растворов. Причем более высокое сродство лиганда к крахмалу ведет к более резкому падению оптической плотности. Использование разработанного алгоритма обработки экспериментальных данных позволяет рассчитать величину константы устойчивости комплексов. Метод использовали для оценки устойчивости комплексов кукурузного крахмала с рядом алифатических одноатомных спиртов. Найдено количественное подтверждение теоретических представлений о роли гидрофобности лигандов в образовании соединений включения. В гомологическом ряду нормальных спиртов с удлинением углеродного скелета происходило увеличение константы устойчивости комплекса (от 2,1 л/мкмоль - для этанола до 30,0 л/мкмоль - для пентанола-1). Способность к комплексообразованию у спиртов с разветвленным углеродным скелетом ниже, чем у изомерных им нормальных спиртов (константа устойчивости в случае 2-метилбутанола-1 составила 13,5 л/мкмоль, что более чем в 2 раза меньше, чем у пентанола-1). Достоинство приводимого метода - возможность использования повсеместно распространенного аналитического оборудования для абсорбционной спектро-фотометрии.
Ключевые слова: крахмал, амилоза, амилопектин, соединения включения, метод оценки устойчивости комплексов, взаимодействие крахмала со спиртами. Для цитирования: Спектрофотометрический метод оценки устойчивости соединений включения крахмала с низкомо-
лекулярными лигандами/ Н. Д. Лукин, А. Ю. Винокуров, А. А. Водяшкин и др. // Достижения науки и техники АПК. 2018. Т. 32. № 4. С. 77-80. DOI: 10.24411/0235-2451-2018-10419.
На сегодняшний день одна из активно развивающихся междисциплинарных областей фундаментальной и прикладной науки - нанобитехнология. Благодаря способности отдельных биомолекул к самоорганизации удается выработать новые подходы к решению широкого круга актуальных проблем, к которым относятся повышение эффективности использования и целевая доставка лекарственных препаратов, моделирование процессов, протекающих в живых системах, развитие методов тканевой инженерии и др. [1]. Одним из направлений развития нанобиотехнологии может стать использование молекул полисахаридов, в частности крахмала, характеризующихся рядом таких неоспоримых преимуществ, как высокая доступность, биоразлагаемость, биосовместимость, относительно низкая стоимость [2, 3]. Кроме того, крахмалы различного ботанического происхождения различаются по своим свойствам, что делает возможным выбор материала из имеющегося природного набора под конкретные задачи. При необходимости химическое строение и пространственную структуру полисахарид-ных макромолекул можно изменить путем физического, механического, химического, биохимического или комбинированного воздействия [4].
Одно из интересных свойств полисахаридов крахмала - способность к образованию комплексов по типу соединений включения с различными веществами (лигандами), среди которых наиболее известны окрашенные комплексы с йодом. На сегодняшний день многие аспекты этого процесса до конца не изучены, особенно при рассмотрении отдельных фракций крахмала - амилозы и амилопектина. Например, в экспериментах с чистым амилопектином было доказано, что количество йода, с которым он связывается, составляет 0-0,7 %. Поэтому, говоря о соединении включения «крахмал-йод», как правило, имеют в виду «амилоза-йод». Такие комплексы содержат одноцепочечную полисахаридную спираль ^-форма амилозы), образование которой происходит в присутствии таких гидрофобных лигандов, как йод, жирные кислоты, ароматические и амфифиль-ные соединений [5]. Внутренняя поверхность спирали V-амилозы представляет собой гидрофобную полость, а гидрофильные гидроксильные группы находятся на поверхности межмолекулярных контактов, обеспечивающих стабильность полимера [1]. Очевидно, что параметры внутренней области во многом зависят от типа образующейся спирали и, в частности, от количества остатков глюкозы на один виток. По величине этого показателя общепринято выделение V6- и V8-структур, вопрос о существовании V7-спиралей остается спорным [5, 6]. При обсуждении надмолекулярной организации таких комплексов обычно отмечают образование двух полиморфных форм - типов I и II, различающихся взаимной ориентацией отдельных спирализованных участков и, как следствие, устойчи-
востью, например, температурами диссоциации [6]. Как правило, подобные комплексы нерастворимы в воде, склонны к агрегированию с образованием сфе-ролитов - поликристаллических частиц, в которых отдельные кристаллы отделены один от другого тонким аморфным слоем [7].
При этом на практике использование чистой амилозы для получения указанных комплексов вряд ли будет иметь широкое распространение в связи с достаточно высокой трудоемкостью и стоимостью ее выделения даже из продукции высокоамилозных сортов растений, в которых ее содержание может достигать 60 %. Поэтому важным вопросом остается взаимодействие между низкомолекулярными лигандами и амилопектином. Так, с йодом он дает продукты фиолетово-красного или буро-красного цвета. Существенно менее интенсивная, по сравнению с амилозой, окраска объясняется способностью амилопектина связывать лишь небольшое количество йода. Косвенным признаком образования соединений включения в этом случае служит уменьшение сродства к йоду с увеличением разветвленности цепи амилопектина или, другими словами, со снижением доли и размеров линейных участков макромолекулы.
На сегодняшний день реакция с йодом находит преимущественное применение для аналитических целей (в йодометрии, для количественного определения крахмала и отдельных его фракций). Однако способность к образованию комплексов с другими соединениями уже сейчас используют в фармацевтическом производстве (изготовление препаратов бета-каротина [8], пиразинамида [9], ибупрофена [10]) и в технологиях производства новых форм пищевых ароматизаторов [11, 12, 13]. Стоит отметить, что существуют и природные соединения включения. Вероятно, с этим связано наличие в промышленно производимых крахмалах примесей (липидной и белковой природы), практически неизвлекаемых в ходе технологического процесса.
Основная цель получения таких структур - повышение их стабильности при использовании (под воздействием высоких температур или в агрессивных условиях желудочно-кишечного тракта). В случае создания новых форм лекарственных препаратов имеет место увеличение биодоступности действующего вещества или обеспечение контроля его высвобождения.
Растущий интерес к соединениям включения делает актуальной интегральную оценку устойчивости комплексов низкомолекулярных лигандов со смесью амилозы и амилопектина, которой можно считать крахмал.
Цель исследований - разработка методики определения константы устойчивости комплексов полисахаридов крахмала с алифатическими спиртами как модельными лигнадами, основанной на применении повсеместно распространенного в лабораториях метода абсорбционной спектрофотометрии.
Условия, материалы и методы. В работе использовали крахмал кукурузный соответствующий ГОСТ Р 53876-2010.
Химические реактивы - этанол, пропанол-1, пропанол-2, бутанол-1, пентанол-1 и 2-метилбутанол-1, йодид калия, йод, диметилсульфооксид - имели квалификацию ч.д.а.
Оптические свойства растворов изучали с использованием спектрофотометра СФ-46.
Растворы крахмала концентрацией 1 г/л готовили путем диспергирования при нагревании и по-
стоянном перемешивании в небольшом количестве диметилсульфооксида (10 мл на 0,1 г крахмала в пересчете на СВ) до образования абсолютно прозрачной жидкости с последующим разбавлением дистиллированной водой.
Реакцию крахмала с йодом без добавления и с добавлением спиртов проводили в мерных колбах объемом 100 см3. Для этого в них вводили одинаковые объемы раствора крахмала, дистиллированную воду до общего объема 70 мл и разные количества раствора йода в йодиде калия. В зависимости от варианта опыта в колбы также вносили определенные объемы спирта. Концентрация всех спиртов в растворах составляла 0,11 моль/л. После этого уровень раствора в колбах доводили до метки дистиллированной водой. Затем колбы закрывали пробками, помещали на кипящую водяную баню до полного обесцвечивания растворов и охлаждали до комнатной температуры с последующим выдерживанием в течение 60 минут для установления равновесия.
Оптическую плотность растворов определяли в кварцевых кюветах при длине волны 630 нм (максимум поглощения окрашенного комплекса) и 288 нм (максимум поглощения свободного йода). Последнюю величину использовали для нахождения концентрации йода, не принявшего участие в образовании комплекса(равновесная концентрация йода), используя предварительно построенный градуировочный график. При работе со спиртами (особенно с 2-метилбутанолом-1) учитывали их собственное поглощение при 288 нм, используя для сравнения растворы спиртов в дистиллированной воде.
Результаты и обсуждение. График насыщения крахмала йодом имеет вид кривой, выходящей на максимум поглощения, обусловленный общим содержанием полисахаридов в растворе(рис.1).
с
О QJH ti4 Щ» J.L'i '-V '.М '. I I
РагкоБесрш концентр amis йода, млгс.гз
Рис. 1. Графики зависимостей оптической плотности растворов крахмала при 630 нм от равновесной концентрации йода в двухкомпонентной (крахмал+йод) и трехкомпонентной (крахмал+йод+спирт) системах.
Важно отметить, что в присутствии спиртов интенсивность окраски комплексов «крахмал-йод» сильно снижается. Это свидетельствует о конкурентном характере комплексообразования в таких системах, то есть молекулы спирта частично вытесняют йод из спиральных структур амилозы и линейных участков амилопектина.
При анализе экспериментальных данных мы сделали предположение о возможности математического описания процесса связывания крахмала с йодом в отсутствии дополнительных веществ с помощью уравнения, которое выводится теоретически (представление этого вывода не входит в цель данной работы):
К, с
'2_
1+ К. с
ь
(1)
где А - оптическая плотность раствора, образованного при взаимодействии крахмала с йодом; Атах - оптическая плотность раствора в состоянии насыщения крахмала йодом; с - равновесная концентрация йода, моль/л; - константа устойчивости комплекса, характеризующая равновесие в системе: крахмал+йод-^-йод-крахмальный комплекс.
В случае соответствия реальной системы нашему предположению экспериментальные данные в обратных координатах (1/А630=^(1/с)) должны характеризоваться прямой линией, что подтвердилось при выполнении необходимых расчетов (рис. 2).
1 + /С, • с + К х ■ сх
Рис. 2. График зависимости 1/А630 от 1/с для комплекса «крахмал-йод» в отсутствии дополнительных соединений.
Очевидно, что такую прямую линию можно описать уравнением, свободный член которого численно равен величине 1/Атах, а угловой коэффициент -1/Атах 'К/). После этого нахождение значений Атах и К, уже не представляет никаких трудностей. Для исследованного в работе кукурузного крахмала они составили 0,51 и 54,5 л/моль соответственно.
Образование окрашенного комплекса «крахмал-йод» в присутствии конкурента (в нашей работе - насыщенные одноатомные спирты) представляет значительно более сложный случай, в котором наравне с приведенным ранее равновесием дополнительно реализуется следующее:
крахмал+конкурент Х^комплекс «крахмал-конкурент Х».
Прочность соединения крахмала с конкурентом также характеризует константа устойчивости Кх, а уравнение зависимости оптической плотности растворов крахмала от равновесной концентрации йода в присутствии дополнительных соединений может быть представлено в следующем виде (2): К, с
А = Атя
I Л , 4- Л .Г?
(2)
Рис. 3. График зависимости 1/А630 от 1/с для комплекса «крахмал-йод» в присутствии предельных одноатомных спиртов.
По результатам всех наших измерений представленные экспериментальные данные удовлетворительно отражались линейными функциями (рис. 3), свободные члены которых равны 1/А , а угловые коэффициенты -
(1 + К,' Сх)/Атах К/2).
По нашему мнению, линейность графиков зависимости 1/А630 от 1/с для комплекса «крахмал-йод» в присутствии предельных одноатомных спиртов в случае хорошо растворимых в воде соединений (этанола, пропанола-1 и пропанола-2) может быть связана с их значительно более низким сродством к полисахаридам крахмала, по сравнению с йодом, и, как следствие, относительным постоянством равновесной концентрации спиртов, сопоставимой с их общей концентрацией.
Таблица. Результаты математической обработки опытов по образованию комплексов «крахмал-йод» в присутствии спиртов
Спирт А "шах к, '2 1 + Кхсх' л/ммоль Кх, л/ мкмоль
Этанол 0,506 44,0 2,1
Пропанол-2 0,488 34,2 5,4
Пропанол-1 0,479 34,9 5,1
Бутанол-1 0,500 29,1 8,0
2-метилбутанол-1 0,522 22,1 13,5
Пентанол-1 0,575 12,7 30,0
где Кх - константа устойчивости комплекса крахмала с конкурентом йода; сх - равновесная концентрация конкурента, моль/л.
Применение изложенного алгоритма обработки экспериментальных данных для оценки прочности комплексов с конкурентами йода возможно благодаря особенностям свойств большинства лигандов, образующих соединения включения с крахмалом, а именно их гидрофобности и, как следствие, слабой растворимости в воде. В таком случае равновесную концентрацию конкурента можно принять за постоянную величину, равную максимальной при данных условиях, а представление экспериментальных данных в обратных координатах должно давать прямую линию.
Найденные экспериментально значения максимального поглощения комплексов, параметров (1 + Кх ■ сх)/ (Атах ), а также значения Кх, рассчитанные на основе предположений о насыщении растворов спиртами (для бутанола-1, 2-метилбутанола-1 и пентанола-1) и о слабом сродстве этанола, пропанола-1 и пропанола-2 к крахмалу (см. табл.), однозначно свидетельствуют о закономерных изменениях устойчивости комплексов полисахаридов крахмала со спиртами, которая зависит, прежде всего, от гидрофобности лигандов. Так, в ряду нормальных спиртов с увеличением размеров углеродного скелета и, соответственно, с уменьшением растворимости в воде происходит рост прочности комплексов, что находит отражение в увеличении константы устойчивости (для этанола Кх составляет 2,1 л/ мкмоль, а для пентанола-1 - 30,0 л/мкмоль). Появление разветвлений углеродного скелета и, следовательно, снижение компактности размещения в спиральной структуре молекул полисахаридов ведет к снижению прочности соединений включения. Например, у изомерного пентанолу-1 2-метилбутанола-1 с разветвленным строением основной цепи наблюдается более чем двукратное снижение константы устойчивости.
Выводы. Представленная в работе методика дает но с гидрофобным характером полости, образующейся
возможности проводить количественную оценку проч- при спирализации линейных участков полисахаридных
ности соединений включения полисахаридов крахмала молекул (прежде всего - амилозы). Важное значение
на основании определения констант комплексов. Она для образования комплексов имеют особенности
реализуется с использованием повсеместно использу- пространственного строения лигандов. Нелинейность
емого оборудования для абсорбционной спектрофото- молекул пропанола-2 и 2-метилбутанола-1 существен-
метрии в ультрафиолетовой и видимой частях спектра. но снижает их способность к комплексообразованию,
Определенные экспериментально значения Amax во всех по сравнению с изомерными им пропанолом-1 и
опытах - результат измерения одной и той же вели- пентанолом-1 соответственно.
чины (Р=0,95), определяемой общей концентрацией Отмеченные особенности взаимодействия поликрахмала в растворе, которую в работе поддерживали сахаридов крахмала со спиртами качественно соот-на одном уровне. Исследованные спирты различаются ветствуют ожиданиям, основанным на теоретических по величине константы устойчивости комплексов с представлениях о механизме образования соединений крахмалом. Так, для соединений с более выраженными включения, что свидетельствует о возможности приме-гидрофобными свойствами (бутанол-1, пентанол-1, нения такого метода для изучения поведения крахмала 2-метилбутанол-1) величины Кх были выше. Это связа- в смесях с низкомолекулярными веществами.
Литература.
1. Газид Э. Нанобиотехнология: необъятные перспективы развития. М.: Научный мир, 2011. 152 с.
2. Preparation of starch-stabilized silver nanoparticles from amylose-sodium palmitate inclusion complexes / G. F. Fanta, J. A. Kenar, F. C. Felker, etc. // Carbohydrate Polymers. 2013. Vol. 92. Pp. 260-268.
3 Preparation and characterization of amylose inclusion complexes for drug delivery applications / F. M. Carbinatto, T. S. Ribeiro, L. A. Colnago, etc. // Journal of pharmaceutical sciences. 2016. Vol. 105. Pp. 231-241.
4 BeMiller J. N. Starch modification: challenges and prospects// Starch/Starke. 1997. Vol. 49. Pp. 127-131.
5. Structural and functional properties of amylase complexes with genistein / R. Cohen, Y. Orlova, M. Kovalev, etc. // Agricultural and food chemistry. 2008. Vol. 56. Pp. 4212-4218.
6. Utilization of amylose-lipid complexes as molecular nanocapsules for conjugated linoleic acid /1. Lalush, H. Bar, I. Zakaria, etc. // Biomacromolecules. 2005. Vol. 6. Pp. 121-130.
7. Fanta G. F., Felker F. C., Shogren R. L. Formation of crystalline aggregates in slowly-cooked starch solutions prepared by steam jet cooking// Carbohydrate Polymers. 2002. Vol. 48. Pp. 161-170.
8. Kim J.-Y., Seo T.-R., Lim S.-T. Preparation of aqueous dispersion of b-carotene nano-composites through complex formation with starch dextrin // Food Hydrocolloids. 2013. Vol. 33. Pp. 256-263.
9. Preparation and characterization of amylose-pyrazinamide inclusion complexes/A. C. Ribeiro, L. P. Fonseca, R. M. D. Soares, etc. // Bioengineering (ENBENG), 4th Portuguese bioengineering meeting. 2015. [Электронный ресурс]. URL: http://ieeexplore. ieee.org/document/7088808/(дата обращения: 11.01.2018).
10. Structural and release properties of amylose inclusion complexes with ibuprofen / L. Zhang, H. Cheng, Ch. Zheng, etc. // Journal of drug delivery science and technology. 2016. Vol. 31. Pp. 101-107.
11. Рогачев А. Г. Ароматизирующая пищевая добавка и способ ее получения // Патент 2264130 РФ, МПК A 23 L 1/226, 1/22./ опубл. 20.11.2005.
12. Борисенко Е. В., Мишарина Т. А. Пищевой ароматизатор в виде сухой формы и способ его получения//Патент2336736 РФ, МПКA23L 1/22.; опубл. 27.10.2008.
13. Evidence of Starch Inclusion Complexation with Lactones / С. Heinemann, В. Conde-Petit, J. Nuessli, etc. // Swiss Federal Institute of Technology (ETH) Zurich. 2001. Vol. 49. Pp. 1370-1376.
SPECTROPHOTOMETRIC METHOD OF STABILITY ESTIMATION OF STARCH INCLUSION COMPLEXES WITH LOW-MOLECULAR LIGANDS
N. D. Lukin1, A. Y. Vinokurov2, A. A. Vodyashkin3, Y. S. Hapilina2
'All-Russian Research Institute of Starch Products - the branch of the V. M. Gorbatov Federal Science Center of Food Systems of the RAS, ul. Nekrasova, 11, pos. Kraskovo, Lyuberetskii r-n, Moskovskaya obl., 140051, Russian Federation 2I.S. Turgenev Oryol State University, ul. Komsomol'skaya, 95, Orel, 302026, Russian Federation
3Saint Petersburg State National Research University of Information Technologies, Mechanics and Optics, Kronverkskii prosp., 9, Sankt-Peterburg, 197101, Russian Federation
Abstract. Starch polysaccharides, which have a number of advantages (high prevalence, biodegradability, biocompatibility, relatively low cost, availability for modification of the chemical and spatial structure due to physical, mechanical, chemical, biochemical or combined effects), are increasingly used in the development of drug delivery systems, a new generation of food additives, tissue engineering and other areas, many of which are related to nanobiotechnology. Often it is due to the ability of amylose and amylopectin to form inclusion complexes with various ligand substances, which are usually hydrophobic in nature. A wider introduction of complexing in practice can be possible after the using of the proposed method of quantitative evaluation of complexes at the research stage. It is based on the study of the effect of the ligand on the color intensity of the starch complex with iodine. With the expressed ability of the ligand to incorporate polysaccharides into the structure of the molecules, iodine is displaced, which leads to a decrease in the optical density of the solutions studied. Moreover, the higher affinity of the ligand for starch leads to a more abrupt drop in the optical density. The use of the developed algorithm of the data processing makes it possible to calculate the value of the stability constant of the complexes. This method was used to assess the stability of corn starch complexes with a number of aliphatic monohydric alcohols. A quantitative confirmation of theoretical ideas on the role of the hydrophobicity of ligands in the formation of inclusion compounds is found. Thus, in the homologous series of normal alcohols with the elongation of the carbon skeleton, the stability constant of the complex increased (from 2.1 L/micromol for ethanol to 30.0 L/micromol for pentanol-1). The ability to complexing in alcohols with a branched carbon skeleton is lower than that of isomeric normal alcohols (the stability constant in the case of 2-methylbutanol-1 was 13.5 L/micromol, which is more than 2 times lower than in pentanol-1). The advantage of this method is the use of common analytical equipment for absorption spectrophotometry.
Keywords: starch; amylose; amylopectin; inclusion connections; method of assessment of complex stability; interaction of starch with alcohols.
Author Details: N. D. Lukin, D. Sc. (Tech.), director (e-mail: vniik@arrisp.ru); A. Y Vinokurov, Cand. Sc. (Tech.), assoc. prof. (e-mail: tolmach_88@mail.ru); A. A. Vodyashkin, research fellow; Yu. S. Hapilina, research fellow.
For citation: Spectrophotometric Method of Stability Estimation of Starch Inclusion Complexes with Low-Molecular Ligands / N. D. Lukin, A. Y Vinokurov, A. A. Vodyashkin, Y S. Hapilina // Dostizheniya nauki i tekhniki APK. 2018. Vol. 32. No. 4. Pp. 77-80 (in Russ.). DOI: 10.24411/0235-2451-2018-10419.
