Спектрофотометрический анализ основных производных гемоглобина в присутствии сульфгемоглобина Текст научной статьи по специальности «Прочие медицинские науки»

МЕДИЦИНСКАЯ БИОФИЗИКА

Вестник Омского университета, 2005. № 2. С. 38-40.

© Е.В. Бескровная, Е.Ю. Мосур, И.А. Пилыцикова, УДК 543.42.062:616.5

H.A. Семиколенова, 2005

СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ОСНОВНЫХ ПРОИЗВОДНЫХ ГЕМОГЛОБИНА В ПРИСУТСТВИИ СУЛЬФГЕМОГЛОБИНА

Е.В. Бескровная, Е.Ю. Мосур*, И.А. Пилыцикова, Н.А. Семиколенова**

* Омский филиал Института физики полупроводников СО РАН

644077, Омск, пр. Мира, 55а, ** Омский государственный университет им. Ф.М. Достоевского, кафедра микроэлектроники и медицинской физики (¡44077, Омск, пр. Мира, 55а

Получена 14 марта 2005 г.

Five general derivates of hemoglobin (HbO-2 , Hb, HbCO, MetHb, SulfHb) has been measured by multicomponent method in current study. Some samples with increased level of SulfHb by 4% has been observed. The dynamics of the absorbance spectra of blood from degree of saturation by H2S has been investigated.

Введение

Изучение патологических состояний организма человека на современном уровне, повышение качества диагностики невозможно без внедрения в клиническую практику методов определения дисфункциональных (не участвующих в транспорте кислорода) производных гемоглобина, в том числе сульфгемоглобина.

Известно, что гемоглобин под влиянием некоторых реакций окисления может превращаться в зеленый пигмент, названный вердоглобином. В настоящее время известны 5 типов вердоглоби-нов: вердоглобин А (холеглобин), вердоглобин^дг, вердоглобинрЯ, вердоглобинNO и вердоглобин S (сульфгемоглобин).

Особенный интерес для исследователей представляет сульфгемоглобин (SulfHb) - единственный из вердоглобинов, который накапливается в значительных количествах в крови при ряде заболеваний. Содержание SulfHb в крови здоровых людей очень мало и не превышает 1 %.

Хотя точное строение вердоглобинов пока не известно, установлено, что эти пигменты состоят из нативного глобина и простетической группы (верда) - железопорфиринового комплекса. В верде, в отличие от гема, раскрыто порфириновое кольцо вследствие окисления а-метинового мостика. Считается, что в SulfHb атом серы связан с парой /3-пиррольных атомов углерода, расположенных на периферии хлоринолового кольца, образовавшегося при насыщении данной /3- /3 двой-

ной связи протопорфирина IX гемоглобина [1]. Подобная структура объясняет значительные отличия спектра поглощения сульфгемоглобина от спектров поглощения других производных гемоглобина, а также очень низкое сродство SulfHb к кислороду [2].

Вердоглобины - продукты необратимого окисления гемоглобина - не участвуют в транспорте кислорода, поэтому их можно отнести к группе дисгемоглобинов. Все эти вещества получены в эксперименте in vitro, они образуются при реакции гемоглобина и сероводорода (H2S). In vivo, наличие SulfHb объясняется тем, что сероводород производится кишечными бактериями и в результате аутоинтоксикации всасывается в кровь. Имеется достаточно оснований предполагать, что в физиологических условиях окисление гемоглобина в вердоглобины является обычным этапом в процессе образования желчных пигментов.

Источником H2 S для образования SulfHb может служить не только кишечник, но и сами эритроциты, содержащие повышенное количество восстановленного глютатиона (Г-Н). Предполагается, что при избытке Г-Н происходит реакция:

2Г-Н + НАДФ Г"редуктаза 2Г + НАДФ - Н2. (1)

Накапливающийся при этом окисленный глюта-тион (Г) разрушается с образованием сероводорода.

Содержание SulfHb в крови выше нормы мо-

Спектрофотометрический анализ основных производных гемоглобина.

39

жет наблюдаться при отравлениях сероводородом, бромом, различными соединениями сурьмы, нитратами, анилином и его производными, а также вследствие приема таких лекарственных препаратов, как ацетанилид, сульфонамид, фенаци-тин [3].

В лаборатории биофизики ОмГУ разработан метод определения содержания основных производных гемоглобина (дезоксигемоглобина (НЬ), оксигемоглобина (НЪ02), карбоксигемоглобина (НЬСО) и метгемоглобина (МеШЬ)) в крови, основанный на многокомпонентном анализе спектров поглощения крови и ее растворов [4; 5].

Целью данной работы является: расширение числа производных, определяемых с помощью многокомпонентного метода - наряду с основными производными устанавливается концентрация сульфгемоглобина; исследование динамики содержания основных производных гемоглобина при насыщении крови сероводородом.

Методика эксперимента

В настоящей работе использовались образцы ге-паринизированной венозной крови, насыщенные сероводородом, полученным по стандартной методике при реакции сульфида натрия и концентрированной соляной кислоты. После насыщения крови сероводородом приготовлены 1%-ые растворы: к 20 мл дистиллированной воды добавляется 0,06 мл 0,04% раствора аммиака (для просветления раствора) и 0,5 мл крови, через 1— 2 минуты (после гемолиза) добавляется 25 мл фосфатного буфера (0,0667 М КН2РОА/0,0667 М Ыа2НРОА • 2Я20, рН = 7,2). Общий объем раствора доводится дистиллированной водой до 50 мл.

Регистрация спектров поглощения проводилась с помощью спектрофотометра СФ-56 в диапазоне длин волн 510-650 нм, оптическая длина пути 1 см. Вычисление содержания производных гемоглобина по измеренной оптической плотности производилось с помощью компьютерной программы «Нето8рес1г» [6], реализующей метод, объединяющий в единой вычислительной схеме методы линейного программирования и алгебраической коррекции фона. Данный метод позволяет выделить спектр примеси, по которому примесное вещество можно идентифицировать.

Результаты и их обсуждение

На рис. 1 приведена зависимость спектров поглощения крови от степени насыщения сероводородом.

Рис. 1. Спектры поглощения крови при различном насыщении сероводородом: жирной сплошной линией выделен исходный образец, жирной пунктирной — образец с максимальным насыщением Н2в

Количественный анализ основных производных гемоглобина показал появление в смеси производных еще одного вещества. При исследовании фонового спектра предполагалось, что неизвестное вещество - сульфгемоглобин. Для подтверждения этой гипотезы матрица миллимоляр-ных показателей поглощения (м.п.п.) дополнена м.п.п. сульфгемоглобина (рис. 2). Повторное проведение вычислений с учетом сульфгемоглобина показало обоснованность выдвинутого предположения, при этом была получена зависимость содержания оксигемоглобина, дезоксигемоглобина, карбоксигемоглобина, метгемоглобина и сульфгемоглобина от степени насыщения крови сероводородом.

Рис. 2. Зависимость миллимолярных показателей поглощения сульфгемоглобина от длины волны [7]

Данные, представленные на рис. 3, позволяют сделать вывод о том, что при постепенном насыщении крови сероводородом происходит восстановление НЬО2, так как наблюдается уменьшение содержания НЬО^ ■ Содержание SulfHb увеличивается с 0,11 до 7,94% в результате реакции между восстановленным гемоглобином и серово-

40

Е.В. Бескровная, Е.Ю. Мосур, И.А. Пилыцикова, Н.А. Семиколенова

Рис. 3. Динамика содержания основных производных гемоглобина при насыщении крови сероводородом

дородом. Растет содержание MetHb в результате окисления железа гемоглобина до трехвалентного состояния, вызванного Но S. Небольшой рост содержания НЬСО обусловлен деструкцией гемоглобина. При разрушении гемоглобина образуется моноокись углерода, которая связывается гемоглобином с образованием карбоксигемоглоби-на.

При серийном анализе образцов крови пациентов МСЧ №7 г. Омска обнаружены образцы с повышенным содержанием SulfHb. Количественный анализ показал, что в этих образцах содержание SulfHb достигает 4%. Патофизиология SulfHb такова, что содержание равное 4% вызывает цианоз, эквивалентный цианозу при 12% MetHb. Предположительно, такую реакцию могли вызвать лекарственные препараты класса сульфониламидов.

моглобина.

2. Исследована динамика содержания производных гемоглобина при насыщении крови сероводородом.

3. Количественный анализ образцов крови пациентов МСЧ №7 выявил образцы с повышенным содержанием сульфгемоглобина, что подтверждает необходимость клинического внедрения методики.

[1] Dijkhuizen P., Buursma A., Gerding A.M., Zijlst-ra W. G. Sulfhemoglobin. Absorption spectrum, millimolar extinction coefficient at e=620 nm, and interference with the determination of haemiglobin and of haemiglobincyanide // Clin. Chem. Acta. 1977; 78: 479-487.

[2] The reversible binding of oxygen to sulfhemoglobin //J. Biol. Chem. 1978; 253: 7212-5.

[3] Kneezel L.D., Kitchens C.S. Pheiiacetin-induced sulfhemoglobinemia: Report of a case and review of the literature // Johns Hopkins Med. J. 1976; 139: 175-7.

[4] Пат. 2140083 Ru, МПК6 С 01 N 33/52, 33/72. Способ определения содержания основных производных гемоглобина / Адамов С.А., Александрова С.А., Мосур Е.Ю., Семиколенова Н.А. (Россия); Омский государственный университет (Россия). № 98101662/14; заявл. 29.01.98; опубл. 20.10.99. Бюл. №29.

[5] Адамов С.А., Александрова С.А., Денисов А.Н., Мосур Е.Ю., Семиколенова Н.А. Спектрофото-метрический количественный анализ основных дериватов гемоглобина // Биохимия. 1998. Т. 63. № 10. С. 1362-1366.

[6] Свидетельство об официальной регистрации программы для ЭВМ «HemoSpectr» №2001610571, Мосур Е.Ю. (Россия); Омский государственный университет (Россия). № 2001610305; заявл. 19.03.01; Зарегистрировано в Реестре программ для ЭВМ 17.05.01.

[7] Zivart A., Buursma A., Van Катреп E.J., Zijlst-ra W. G. Multicomponent analysis of hemoglobin derivatives with a reversed-optics spectrophotometer // Clin. Chem. 1984; 30: 373-9.

Выводы

1. Число производных гемоглобина, содержание которых определяется при помощи разработанного метода, расширено. Наряду с основными производными возможно исследование сульфге-